Mesure de l’Expression des gènes dans les couches d’Aleurone orge bombardé avec un débit plus élevé

Résumé

Un protocole amélioré est présenté pour la mesure de l’expression transitoire de constructions de journaliste dans les cellules d’aleurone orge après le bombardement par des particules. La combinaison d’automatisé grain de meulage avec essais enzymatiques plaque 96 puits offre un débit élevé pour la procédure.

Résumé

La couche d’aleurone de grains d’orge est un important système modèle pour l’expression génique réglé par hormone chez les plantes. Dans les cellules d’aleurone, gènes requis pour la germination ou du développement de la plantule sont activés par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Les mécanismes de signalisation de GA et ABA peuvent être interrogés en introduisant des constructions de gène de journaliste dans les cellules d’aleurone par bombardement par des particules, avec l’expression transitoire résultante mesurée à l’aide d’essais enzymatiques. Un protocole amélioré est rapporté que partiellement automatise et simplifie l’étape d’homogénéisation de grain et les dosages enzymatiques, ce qui permet un débit nettement plus que les méthodes existantes. Homogénéisation des échantillons de grain se faite avec un homogénéisateur tissus automatisés, et GUS (β-glucuronidase) essais sont effectués à l’aide d’un système de plaque à 96 puits. Les résultats représentatifs en utilisant le protocole suggèrent que l’activité phospholipase D jouerait un rôle important dans l’activation de l’expression de gène HVA1 par l’ABA, par le facteur de transcription TaABF1.

Introduction

La couche d’aleurone de l’orge est un système de modèle bien établi pour l’étude de l’expression génique réglé par hormone en plantes¹. En particulier, un certain nombre de gènes nécessaires à la germination ou du développement de la plantule est activé par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Le GA et ABA, voies de signalisation sont entrelacées, comme l’expression de certains gènes activés par le GA est inhibée par l’ABA et vice versa¹.

Une stratégie utile pour comprendre que le rôle des acteurs particuliers dans la signalisation de GA/ABA a été l’introduction d’effecteur gènes chimères par bombardement par des particules, suivi d’une expression transitoire de constructions de journaliste qui permettent l’effet qui en résulte sur expression des gènes en aval à déterminer. L’utilisation de gènes rapporteurs comme GUS (β-glucuronidase) ou de la luciférase permet la mesure sensible et quantitative de l’expression des gènes spécifiquement dans les cellules qui ont reçu la construction de l’effecteur. Par exemple, l’introduction d’une construction d’effecteur codant le facteur de transcription TaABF1^5,6 établi que gènes induite par l’ABA comme HVA1 sont induits par la TaABF1, tout en GA-induite des gènes tels que Amy32b sont réprimés. Bombardement de particules comme une stratégie expérimentale a été utilisé par plusieurs laboratoires pour étudier divers aspects de la GA/ABA de signalisation. Ce travail a conduit à l’identification des éléments du promoteur importants pour l’activation de gènes induite par l’ABA³et induite par le GA² et à la découverte des protéines kinases⁴ et facteurs de transcription⁵ qui régulent la expression de ces gènes.

L’existant protocoles^2,3,4,5,6 pour le bombardement par des particules et mesure subséquente d’expression transitoire sont travail très intensif, comme chaque ensemble de bombardé à peine les grains soit homogène à la main dans un mortier et un pilon et les dosages enzymatiques sont effectués individuellement. Ce manuscrit rapporte un protocole amélioré que partiellement automatise et simplifie l’étape d’homogénéisation et le GUS dosages pour permettre un débit nettement plus, permettant un plus grand nombre de traitements pour être testés dans la même expérience, ou la inclusion de plusieurs répétitions pour chaque traitement afin d’obtenir davantage de résultats statistiquement robuste. Résultats représentatifs sont indiqués pour l’expression de constructions journaliste HVA1 et Amy32b , régie par le facteur de transcription TaABF1, ainsi que par les GA, ABA et autres molécules régulatrices.

Protocole

1. préparation des effecteurs et gène rapporteur construit

1. Construire des constructions d’effecteur qui emploient un promoteur constitutif (p. ex. maïs ubiquitine, UBI) à l’expression de la voiture d’un cadre de lecture souhaité. Par exemple, construire un plasmide contenant UBI::TaABF1 à disque forte l’expression constitutive de TaABF1⁵.
2. Construire des constructions de journaliste qui incluent le promoteur dont l’activité consiste à mesurer, placé en amont d’un cadre de lecture ouvert comme GUS. Par exemple, construire un plasmide contenant HVA1::GUS permettant de mesurer l’expression de la HVA1 promoteur^2,5.
3. Construire une structure de contrôle interne (p. ex. UBI::luciférase).
4. À l’aide d’une colonne de silice liaison protocole (voir Table des matières), préparer le plasmide de haute qualité pour chacune des constructions gène nécessaire. En utilisant la spectroscopie ultraviolette (voir Table des matières), soigneusement mesurer la concentration de chaque préparation de plasmide.

2. préparation des Grains d’orge bombardement

1. Mettre en place une feuille de calcul (voir Figure 1 pour un exemple) indiquant les plasmides qui seront bombardés, les traitements appropriés de l’hormone et autres informations pertinentes pour chaque traitement qui fera partie de l’expérience.
2. À l’aide d’une planche à découper et une lame de rasoir stérile, couper les embryons de grains d’orge Himalaya (40 pour chaque traitement comprise dans le test). Exclure les grains qui sont décolorés ou sensiblement inférieur à la moyenne.
3. Placez tous les grains d’embryoless dans un tube de 50 mL. Ajouter 40 mL d’eau et de roche pendant 10 minutes.
4. Versez l’eau soigneusement (pour éviter de perdre des grains), ajouter 40 mL d’eau de Javel de 10 %. Rock pendant 20 minutes.
5. Versez l’eau de Javel, ajouter 40 mL d’eau stérile. Rock pendant 5 minutes. Répéter ce lavage à l’eau stérile, quatre fois plus.
6. Ajouter 40 mL de Solution d’imbibition (succinate sodique de 20 mM, 20 mM chlorure de calcium, pH 5.0) et 40 μL de solution étalon de chloramphénicol (10 mg/mL).
7. Transférer la plus grande partie de la Solution de s’imbiber (avec chloramphenicol) du tube dans une assiette de Vermiculite (voir Table des matières). Puis transférez les grains à la surface du papier filtre humide dans les plaques de Vermiculite. Étaler uniformément les grains. Verser dans une solution assez on pour garder les grains partiellement (mais pas complètement) immergé. Placez le couvercle sur la plaque de Vermiculite.
8. Incuber les grains embryoless à 24 ° C pendant environ 48 heures avec un éclairage fluorescent. Ajouter la Solution de s’imbiber supplémentaires si nécessaire.
9. Ouvrir une boîte de Pétri plastique 90 mm et verser 20 mL de Solution s’imbiber dans le plat lui-même et 20 mL dans le couvercle inversé. Ajouter 20 μL de chloramphénicol (10 mg/mL) à chacun. Stériliser les deux paires de pinces à pointe fine en les plongeant dans de l’alcool.
10. Placez quelques uns des grains embryoless dans le couvercle de la boîte de Pétri. À l’aide de la pince, retirez délicatement le tégument (transparent) de chaque grain. Tout en éliminant les téguments de la graine du côté du grain lisse, ne pas endommager les cellules (aleurone) sous-jacentes. Transférer le grain Pelé dans la boîte de Pétri contenant la Solution de s’imbiber.
11. Après avoir épluché les téguments de la graine de tous les grains, les retourner à la plaque de Vermiculite. Incuber les grains embryoless pelées à 24 ° C pendant 16 à 20 heures.
12. Juste avant d’utiliser les grains pour le bombardement, enlever l’humidité de surface par les secousses entre papier-filtre dans une boîte de Pétri.

3. préparation d’ADN plasmidique de bombardement

1. Étiqueter un tube de 1,5 mL pour chaque traitement qui figurera dans l’expérience de bombardement. Dans chaque tube, ajouter 2,5 µg d’UBI:: plasmide contrôle interneluciférase , 2,5 µg d’un plasmide de journaliste de GUS et la quantité désirée (en général 0,025 µg à 2,5 µg) d’un plasmide effecteur. Ajouter de l’eau pour porter le volume total à 5 µL.
2. Préparer 1,6 µm or microporteurs (voir Table des matières) protocoles⁶publiés.
3. Pour chaque traitement, ajouter 50 µL de suspension microporteurs dans le tube de 1,5 mL contenant l’ADN de plasmide. Enrober les microporteurs avec l’ADN de plasmide selon protocoles^{6 du fabricant}.
4. Dans l’étape finale, lorsque les plasmide-enduit microporteurs sont suspendus dans 48 µL 100 % d’éthanol, pipette 8 μL des microporteurs suspendu sur chacun des cinq macrocarriers et laissez-les à l’air sec.

4. particules bombardement de Grains d’orge Embryoless

1. Mettre en place l’appareil de bombardement de particules (voir la Table des matières)⁶.
2. Placez un disque de rupture 1550 lb/po2 dans la PAC retenue et installez-le sur l’instrument.
3. Placez un macrocarrier contenant la combinaison désirée plasmidique (avec un écran d’arrêt) dans l’ensemble de lancement avec des microporteurs. Insérer l’ensemble dans la fente supérieure de la chambre de bombardement. La distance entre le disque de rupture, garder le cap et le macrocarrier du couvercle à la distance standard (6 mm) et y déposer le support d’écran arrêt la position centrale (standard), ce qui permet une distance de voyage macrocarrier de 11 mm (Figure 2 a).
4. Disposer 8 grains d’embryoless dans un modèle radial serré (avec les extrémités plus minces pointant vers l’intérieur) sur un cercle de papier filtre qui est collé à plat sur le couvercle d’une boîte de Pétri 90 mm (voir Figure 2 b).
5. Placez le plat avec les grains dans la chambre de bombardement, à une distance de 6 cm de l’écran de s’arrêter.
6. Évacuer la chambre de bombardement à 95 kPa et puis bombarde l’échantillon.
7. Après avoir relâché le vide, transférer les grains ont bombardé à un marqué 60 mm boîte de Pétri contenant 4 mL de Solution s’imbiber contenant 1 mg/ml de chloramphénicol.
8. Répétez jusqu'à ce que tous les bombardements sont terminés. Incuber (sur une plateforme vibrante à 100 tr/min) à 24 ° C pendant 24 heures.

5. extraction des protéines solubles des Grains ont bombardé

1. À l’aide de pinces, retirer les 8 grains ont bombardé un plat de Pétri de 60 mm et épongez les sécher sur du papier absorbant. Diviser les grains en deux tubes étiquetés 2,0 mL (4 grains par tube) chacun contenant 800 μL tampon de meulage (100 mM Na phosphate pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptine, 20 % de glycérol) et une bille en acier inoxydable de 5 mm. Répétez ce processus pour tous les grains ont bombardé.
2. Placer (jusqu'à 48) 2,0 mL tubes dans les deux paniers de l’homogénéisateur de perle (voir Table des matières). Monter les supports sur l’homogénéisateur.
3. Agiter les échantillons à 30 Hz pendant 3 minutes.
4. Retirer les grilles de l’homogénéisateur de l’homogénéisateur et placez-les sur la glace (5 min) pour re-refroidir les échantillons.
5. Monter les supports sur l’homogénéisateur - dans le sens opposé. Agiter à nouveau les échantillons à 30 Hz pendant 3 minutes.
6. Refroidir les grilles sur la glace, puis répétez les étapes 5.3 à 5.5. Cela s’ajoutera jusqu'à un total de 12 minutes d’agitation.
7. Centrifuger les extraits de grains à 16 000 x g à 4 ° C pendant 10 minutes.
8. Décanter immédiatement après la centrifugation, le surnageant clair dans une seconde série de tubes de microcentrifuge. Donner à chaque tube un tourbillon rapide. Stocker les tubes sur la glace.
9. Après avoir transféré le surnageant, récupérer les billes en acier de boulettes donc ils peuvent être lavés et réutilisés.

6. mesure de l’activité de la luciférase dans des extraits de Grain

1. Pour chaque tube d’extrait de grain à doser, préparer un tube de verre de 12 mm x 75 mm contenant 200 μl du mélange d’essai luciférase (45 mM Tris sulfate pH = 7,7, 15 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, luciférine de 1 mM, 1 mM ATP).
2. Ajouter 100 μl de l’extrait de grain premier dans le premier tube de dosage. Vortex rapidement pour bien mélanger. Immédiatement , placer le tube dans le porte-tube de luminomètre et fermer la porte. Lorsque la mesure est terminée, retirer le tube du luminomètre – laissant la porte ouverte pour placer le tube suivant.
3. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les échantillons ont été mesurés.

7. mesure de l’activité de GUS dans des extraits de Grain

1. Ajouter 200 μl de tampon de GUS (50 mM Na phosphate, pH 7,2, 2,5 mM 4-méthylumbelliféryl - D-glucuronide, 10 mM TNT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptine, 20 % de méthanol, 0,02 % d’azide de sodium) dans chaque puits d’une plaque 96 puits.
2. Place 50 μL de chaque extrait de grain dans le bien qui correspond. Mélanger avec le bout après l’ajout. Sceller la partie supérieure avec film d’étanchéité.
3. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C dans l’obscurité pendant 20 heures.
4. Centrifuger la plaque 96 puits à 4 000 x g à 4 ° C pendant 10 minutes et placez-le sur la glace.
5. Ajouter 250 μL de 0,2 M Na₂CO₃ dans chaque puits d’une plaque bien noir 96.
6. Ajouter 6,25 μL de chaque mélange de dosage GUS centrifugé dans la correspond bien (contenant 0,2 M Na₂CO₃) de la black 96 bien plate. Mélanger avec le bout après l’ajout. Inclure les puits avec 6,25 μL de 10 μM, 40 μM et 100 μM 4-méthylumbelliférone comme normes.
7. Placez la plaque noire dans un fluorimètre plaque et lire la fluorescence de la méthylumbelliférone. Prendre la lecture à une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et une longueur d’onde d’émission de 460 nm. Réglez le gain de l’instrument tel qu’un bien contenant μL 6,25 de 40 μM 4-méthylumbelliférone et 250 μL de 0,2 M Na₂CO₃ donnent une lecture de 1000 unités de fluorescence.

8. analyse des données

1. Entrez les valeurs de la luciférase et dosages de GUS dans un tableur. Exclure de tout échantillon avec une lecture de la luciférase d’inférieur à 20 000 luminescence relative unités s^-1, car cela indique que les gènes chimères n’étaient pas correctement livrés pour les cellules d’aleurone.
2. Pour chaque grain bombardé avec succès extrait (représentant un groupe de quatre grains d’embryoless), à calculer l’expression normalisée de GUS partir des données brutes de GUS et de la luciférase comme suit : normalisé GUS = [(expression GUS - GUS vide) x (2 000 000)] / (luciférase expression – luciférase vide).
   Remarque : Cela normalise le volume d’activité GUS à ce qui serait ont été observé dans un bombardement qui a donné une lecture de la luciférase de 2 000 000.
3. Signaler le niveau relatif d’expression d’une construction particulière de journaliste en présence d’effecteur des constructions ou des traitements hormonaux testées en comparant le niveau d’expression en l’absence d’hormones ou les effecteurs.

Résultats

La technique décrite ici peut servir à introduire toute construction de test génétique dans des cellules d’aleurone de grains d’orge. Le niveau d’expression du gène de l’essai peut alors être idéalement mesuré (Figure 2). Le protocole de débit supérieur décrit ici grandement augmente l’efficacité de la graine de meulage et les étapes de test enzyme. Cette méthode a été utilisée pour évaluer la capacité de la transcription factor T...

Discussion

L’introduction du gène de l’effecteur construit par bombardement par des particules, suivie d’une expression transitoire de constructions de journaliste est une stratégie utile pour disséquer le rôle des acteurs particuliers dans la signalisation de GA/ABA et du gène réglementés hormone qui en résulte expression.
Cependant, les protocoles existants pour mener à bien de telles expériences dans l’orge aleurone cellules^2,3,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800