מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

Summary

פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

Abstract

השכבה aleurone של גרגרי שעורה היא מערכת מודל חשוב על ביטוי גנים מוסדר הורמון בצמחים. בתאים aleurone, גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המנגנון של GA ו ABA איתות יכולה להיחקר על ידי החדרת כתב ג'ין בונה לתאים aleurone באמצעות הפגזה של חלקיקים, עם ביטוי ארעי וכתוצאה מכך נמדד באמצעות מבחני אנזים. פרוטוקול משופר הוא דיווח זה חלקית הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון דגן, את מבחני אנזים, ומאפשר תפוקה יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות. המגון הדגימות תבואה מתבצעת באמצעות מהמגן רקמות אוטומטיות של, מבחני גאס (β-glucuronidase) מתבצעות באמצעות מערכת צלחת 96-ובכן. נציג תוצאות באמצעות הפרוטוקול מראים כי פעילות phospholipase D עשוי לשחק תפקיד חשוב ההפעלה של ביטוי גנים HVA1 על ידי ABA, דרך הפקטור שעתוק TaABF1.

Introduction

השכבה aleurone שעורה היא מערכת מודל ומבוססת על המחקר של ביטוי גנים מוסדר הורמון צמחי¹. בפרט, יש מספר גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המשחק ואת ABA מסלולי איתות שלובים זה בזה, כפי הביטוי של גנים מסוימים מופעל GA מעוכבת על ידי ABA, ולהיפך¹.

אסטרטגיה חשוב להבין שהתפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות כבר המבוא של בונה ג'ין אפקטור באמצעות הפגזה של חלקיקים, ואחריו הביטוי ארעית של בונה כתב לאפשר את האפקט המתקבל על ביטוי גנים במורד הזרם נקבע. השימוש של הכתב גנים כמו גאס (β-glucuronidase) או לוציפראז מאפשר את המדידה רגיש, תפוקה של ביטוי גנים במיוחד בתוך התאים, כי קיבלו הבונה אפקטור. לדוגמה, כניסתה של הבונה אפקטור קידוד של פקטור שעתוק TaABF1^5,6 הוקם כי ABA-induced גנים כגון HVA1 הם המושרה על-ידי TaABF1, תוך כדי משחק-induced גנים כגון Amy32b . מדוכאים. הפגזה של חלקיקים כמו אסטרטגיית ניסיוני שימש על ידי מעבדות מרובים כדי לחקור היבטים שונים של GA/ABA איתות. עבודה כל כך הוביל לזיהוי של יזם אלמנטים חשובים עבור ההפעלה של GA-induced² וגם הגנים ABA-induced³, לגילוי של חלבונים kinases⁴ , תמלול גורמים⁵ המסדירים ביטוי של גנים אלה.

קיימים פרוטוקולים^2,3,4,5,6 עבור חלקיקים הפגזה ומדידה עוקבות של ביטוי גנים ארעי הם די עמל רב, כמו כל קבוצה של מופגז בקושי גרגרים הוא הומוגני על ידי יד ומכתש, מבחני אנזים מבוצעות בנפרד. כתב יד זה מדווח על פרוטוקול משופרת זה הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון חלקית, מבחני גאס כדי לאפשר תפוקת יותר באופן משמעותי, המתיר מספר גדול יותר של טיפולים כדי שיהיה ניתן לבחון אותו אותו ניסוי, או הכללה של משכפל נוסף עבור כל טיפול להשיג תוצאות סטטיסטית חזקים יותר. נציג התוצאות יוצגו עבור הביטוי של בונה כתב HVA1 , Amy32b , מוסדר על ידי הגורם שעתוק TaABF1, כמו גם על ידי GA, ABA, מולקולות רגולטוריות אחרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת אפקטור, מדווח בונה

1. לבנות מבנים אפקטור כי מעסיקים מקדם מכוננת (למשל תירס אוביקוויטין, UBI) לביטוי נסיעה מן מסגרת קריאה פתוחה הרצוי. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל UBI::TaABF1 לביטוי מכוננת חזקה נסיעה של TaABF1⁵.
2. לבנות מבנים כתב הכוללים ייצוג המקדם הפעילות נועד למדוד, ממוקמים במעלה הזרם של מסגרת קריאה פתוחה, כמו גאס. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל HVA1::GUS כדי למדוד את הביטוי בין^2,יזם HVA1 ⁵.
3. לבנות לבנות בקרה פנימית (למשל UBI::לוציפראז).
4. באמצעות עמודת איגוד סיליקה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים), להכין פלסמיד באיכות גבוהה עבור כל אחד בונה הגן חובה. בעזרת ספקטרוסקופיית אולטרה סגול (ראה טבלה של חומרים), בקפידה למדוד את ריכוז כל הכנה פלסמיד.

2. הכנה של גרגרי שעורה הפגזה

1. להגדיר את גיליון אלקטרוני (לקבלת דוגמה, ראה איור 1 ) המציין את פלסמידים זה תהיה מופגז, הטיפולים המתאימים הורמון, ומידע רלוונטי נוסף עבור כל טיפול זה יהיה חלק מהניסוי.
2. באמצעות קרש חיתוך, סכין גילוח סטרילי, לחתוך את העוברים בין גרגרי שעורה ההימליה (40 הטיפול כלולה הניסוי). הכללת גרגרים דהוי או קטנים יותר באופן משמעותי מהממוצע.
3. מניחים שכל הגרגרים embryoless לתוך צינור 50 מ. להוסיף 40 מ של מים, סלע במשך 10 דקות.
4. שופכים את המים בזהירות (כדי להימנע מאובדן גרגרים) ולהוסיף 40 מיליליטר 10% מלבין. רוק במשך 20 דקות.
5. שופכים את המלבין ולהוסיף 40 מיליליטר מים סטריליים. רוק למשך 5 דקות. חזור על זה לשטוף במים סטריליים ארבע פעמים נוספות.
6. להוסיף 40 מ"ל של שתיית פתרון (succinate נתרן 20 מ מ, 20 מ מ סידן כלורי, pH 5.0) וμl 40 של פתרון מניות כלורמפניקול (10 mg/mL).
7. להעביר את רוב הפתרון שתיית (עם כלורמפניקול) באמצעות הרכבת התחתית לתוך צלחת ורמיקוליט (ראה טבלה של חומרים). ואז להעביר את הגרגרים על גבי המשטח של נייר הסינון הרטוב בצלחת ורמיקוליט. שמתפזר הגרגרים. יציקת בפתרון imbibing מספיק כדי לשמור על הגרגרים חלקית (אבל לא לגמרי) במים. מקם את המכסה על גבי הלוח ורמיקוליט.
8. דגירה החיטים embryoless ב 24 מעלות צלזיוס במשך כ- 48 שעות עם תאורת פלורוסנט. להוסיף פתרון שתיית נוספים לפי הצורך.
9. להיפתח 90 מ מ פלסטיק פטרי, שופכים 20 מ של פתרון שתיית לתוך המנה עצמה, 20 מ"ל לתוך המכסה הפוך. להוסיף כל אחד μL 20 כלוראמפניקול (10 mg/mL). לעקר את שני זוגות של הצבע בסדר מלקחיים בטבילת אותם באלכוהול.
10. מניחים כמה מן החיטים embryoless המכסה של הפטרי. עם המלקחיים, להסיר בעדינות קליפת הזרע (שקוף) כל גרגיר. בעת הסרת קליפת הזרע מן הצד חלקה של התבואה, לא לפגוע בתאים (aleurone) המשמש כבסיס. להעביר את התבואה קלופים הפטרי הכוללת שתיית פתרון.
11. לאחר קילוף קליפת הזרע מכל הגרגרים, להחזיר אותם לצלחת ורמיקוליט. תקופת דגירה החיטים embryoless קלופים ב 24 ° C של 16-20 שעות.
12. רק לפני השימוש הגרגרים עבור הפגזה, להסיר לחות משטח ע י ניעור אותם בין מסנן המסמכים בצלחת פטרי.

3. הכנה של פלסמיד DNA עבור הפגזה

1. תווית צינור 1.5 mL עבור כל טיפול זה ייכלל הניסוי הפגזה. כדי כל שפופרת להוסיף 2.5 µg של UBI::לוציפראז בקרה פנימית פלסמיד, µg 2.5 פלסמיד כתב גאס , את הסכום הרצוי (בדרך כלל 0.025 µg כדי 2.5 µg) של פלסמיד אפקטור. מוסיפים מים כדי להביא את הנפח הכולל 5 µL.
2. להכין 1.6 מיקרומטר זהב microcarriers (ראה טבלה של חומרים) בעקבות פרסום הפרוטוקולים⁶.
3. עבור כל טיפול, להוסיף 50 µL של microcarriers על תנאי לתוך הצינור 1.5 mL המכילה DNA פלסמיד. מעיל של microcarriers עם פלסמיד הדנ א על פי פרוטוקולים של היצרן⁶.
4. בשלב הסופי, כאשר microcarriers מצופים פלסמיד מושעים 48 µL 100% אתנול, pipet 8 μL של microcarriers על תנאי על גבי כל אחד חמש macrocarriers ולאפשר להם לאוויר יבש.

4. חלקיקים הפגזה של גרגרי שעורה Embryoless

1. להרכיב את המערכת הפגזה של חלקיקים (ראה טבלה של חומרים)⁶.
2. להכניס דיסק קרע 1550 psi בתוך הכיפה שהגנו והר אותה על המכשיר.
3. המקום של macrocarrier המכילה את השילוב הרצוי פלסמיד (יחד עם מסך עצירה) לתוך מכלול ההשקה microcarrier. הכנס את מכלול לתוך החריץ העליון של התא הפגזה. קבעו את המרחק בין הדיסק קרע שמירה, פקקי מכסה כיסוי macrocarrier ממרחק סטנדרטי (6 מ מ), ולמקם את תמיכת מסך עצירה במיקום האמצעי (רגיל), המאפשר מרחק הנסיעה macrocarrier של 11 מ"מ (איור 2 א).
4. לסדר את גרגרי embryoless 8 בדפוס רדיאלי חזק (עם מסתיים רזה הצבעה פנימה) על עיגול נייר סינון מודבקת למטה שטוח המכסה של צלחת פטרי 90 מ מ (ראה איור 2B).
5. מקם את המנה עם הגרגרים אל החדר הפגזה, במרחק של 6 ס מ מן המסך עצירה.
6. לפנות את החדר הפגזה 95 kPa, ואז להפציץ את הדגימה.
7. לאחר שחרור האבק, להעביר החיטים bombarded צלחת פטרי עם תוויות 60 מ מ המכיל 4 מ"ל של שתיית פתרון המכיל 1 מ ג/מ ל כלורמפניקול.
8. חזור עד כל הפגזות הושלמו. דגירה (על פלטפורמה חזק 100 סל"ד) ב 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

5. החילוץ של חלבון מסיס מן החיטים Bombarded

1. באמצעות מלקחיים, להסיר את החיטים bombarded 8 צלחת פטרי 60 מ מ, למחוק אותם יבש על מגבת נייר. לחלק את הגרגרים mL 2.0 שכותרתו שני צינורות (4 גרגרים למחזור) שכל אחד מהם מכיל 800 μL טחינת מאגר (100 מ מ נה פוספט pH 7.2, 5 מ מ DTT, 10 leupeptin µg/mL, גליצרול 20%) וחרוז נירוסטה 5 מ מ. חזור על תהליך זה עבור כל הדגנים מופגז.
2. להכניס צינורות 2.0 mL (עד 48) בתוך המדפים שני של מהמגן חרוז (ראה טבלה של חומרים). הר המדפים על מהמגן.
3. לנער את הדגימות ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
4. להסיר את המדפים מהמגן מהמגן ולמקם אותם על קרח (5 דקות) מחדש לצנן את הדגימות.
5. הר המדפים על מהמגן - בכיוון ההפוך. לנער את הדגימות שוב ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
6. מגניב המדפים על קרח, ואז חזור על צעדים 5.3 ל 5.5. זה יוסיף סך של 12 דקות של טלטול.
7. Centrifuge תמציות דגן ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
8. מיד לאחר צנטריפוגה, decant את supernatants ברור לתוך קבוצה שנייה של microcentrifuge צינורות. לתת כל שפופרת מערבולת מהירה. לאחסן הצינורות על קרח.
9. לאחר העברת את תגובת שיקוע, לשחזר את החרוזים פלדה כדורי אז הם יכולים להיות שטופים לעשות בה שימוש חוזר.

6. מדידת פעילות לוציפראז מן התבואה תמציות

1. לכל שפופרת של תבואה תמצית כדי להיות לבדיקה, להכין 12 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית מבחנה המכילה 200 μL תערובת Assay לוציפראז (45 מ מ טריס חומצה גופרתית pH 7.7, 15 מ מ MgCl₂, 20 מ מ DTT, 1.5 mM EDTA, luciferin 1 מ מ, 1 מ מ ATP).
2. להוסיף 100 μL של תמצית תבואה הראשון הצינור assay הראשון. מערבולת במהירות כדי לערבב היטב. מיד למקם את הצינור לתוך צינור האוחז luminometer וסגור את הדלת. עם סיום המדידה, הסר את הצינורית luminometer – השארת הדלת פתוחה עבור מיקום של הצינור הבא.
3. חזור על תהליך זה עד כל הדגימות נמדדו.

7. מדידה של גאס פעילות של תמציות של דגנים

1. להוסיף 200 μL גאס Assay מאגר (50 מ מ נה פוספט pH 7.2, 2.5 מ מ 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 מ מ DTT, 2 מ מ EDTA, leupeptin µg/mL 10, 20% מתנול, אזיד הנתרן 0.02%) כל טוב של צלחת טוב 96.
2. במקום 50 μL של כל גרגיר לחלץ לתוך המתאימה היטב. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. חותם העליון עם איטום הסרט.
3. תקופת דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך של 20 שעות.
4. Centrifuge את הצלחת היטב 96 ב g 4,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומניחים אותו על קרח.
5. להוסיף 250 μL של 0.2 מ'-נה-₂CO-₃ כל טוב של צלחת טוב שחור 96.
6. להוסיף 6.25 μL של כל תערובת assay גאס centrifuged המתאימה טוב (המכיל 0.2 מ' נה₂CO₃) של השחור 96 טוב צלחת. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. לכלול וולס עם μL 6.25 μM 10, 40 μM ו 100 μM 4-methylumbelliferone כמו סטנדרטים.
7. למקם את הלוח השחור fluorometer צלחת ולקרוא את זריחה של methylumbelliferone. קח את הקריאות-גל עירור של 360 ננומטר, אורך גל של פליטה של 460 ננומטר. להגדיר את הרווח של המכשיר כך על μL טוב המכיל 6.25 של 4 μM 40-methylumbelliferone 250 μL של 0.2 מ'-נה-₂CO-₃ מאפשר קריאה של 1000 יחידות קרינה פלואורסצנטית.

8. ניתוח נתונים

1. הזן את הערכים עבור לוציפראז ו גאס מבחני לתוך גיליון אלקטרוני. אל תכלול התייחסות דוגמה עם קריאת לוציפראז נמוך יותר מאשר הפריה חוץ גופית יחסית 20,000 יחידות s^-1, כי זה מצביע על כי המבנה ג'ין לא בהצלחה נשלחו אל תאי aleurone.
2. עבור כל גרגיר בהצלחה bombarded לחלץ (ייצוג קבוצה של ארבעה גרגרים embryoless), לחשב את הביטוי גאס מנורמל מתוך הנתונים הגולמיים גאס ואני לוציפראז כדלקמן: מנורמל גאס = [(ביטוי גאס - גאס ריק) x (2,000,000)] / (לוציפראז ביטוי – לוציפראז ריק).
   הערה: זה מווסת את כמות הפעילות גאס מה נצפו בהפגזות שנתן קריאה לוציפראז של 2,000,000.
3. דווח על הרמה היחסית של ביטוי של מבנה כתב מסוים בנוכחות אפקטור בונה או טיפולים בהורמון נבדק על ידי השוואת לרמה של הביטוי בהיעדרו של effectors או הורמונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן להציג לבנות גן בכל מבחן לתוך התאים aleurone של גרגרי שעורה. רמת הביטוי של הגן הבדיקה ואז הוא יהיה נוח נמדד (איור 2). פרוטוקול תפוקה גבוהה יותר המתוארים כאן מאוד מגדיל את היעילות של זרע שחיקה, אנזים assay צעדים. בשיטה זו נעשה שימוש כד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המבוא של ג'ין אפקטור בונה באמצעות חלקיקים הפגזה, ואחריו הביטוי ארעית של הכתב בונה היא אסטרטגיה ערך ניקוד את התפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות וב -הגן מוסדר הורמון וכתוצאה מכך ביטוי.
עם זאת, קיימים פרוטוקולים עבור ביצוע ניסויים אלה שעורה aleurone תאים^2,3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800