Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

Resumo

Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.

Resumo

A camada de aleurona de grãos de cevada é um importante modelo sistema para expressão gênica hormônio-regulada em plantas. Nas células de aleurona, genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas são ativados por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). Os mecanismos de sinalização GA e ABA podem ser interrogados por introduzir construções de gene repórter em células de aleurona através do bombardeamento de partículas, com a expressão transitória resultante medida através de ensaios enzimáticos. Um protocolo melhorado é relatado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização de grão e os ensaios enzimáticos, permitindo que a taxa de transferência significativamente mais do que os métodos existentes. Homogeneização das amostras de grãos é realizada usando um homogeneizador de automatizado, e ensaios de GUS (β-glucuronidase) são realizados através de um sistema de placa de 96 poços. Resultados representativos, usando o protocolo sugerem que a atividade da fosfolipase D pode desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 pela ABA, através do fator de transcrição TaABF1.

Introdução

A camada de aleurona de cevada é um sistema bem estabelecido de modelo para o estudo da expressão gênica de hormônio-regulada em plantas¹. Em particular, um número de genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas é ativado por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). O GA e ABA vias de sinalização estão interligados, como a expressão de alguns genes GA-ativado é inibida pela ABA e vice-versa¹.

Uma estratégia valiosa para a compreensão que do papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização foi a introdução das construções de gene effector através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter que permitem que o efeito resultante na expressão do gene a jusante para ser determinado. O uso de genes repórter como GUS (β-glucuronidase) ou Luciferase permite a medição quantitativa e sensível da expressão do gene especificamente dentro das células que receberam a construção effector. Por exemplo, a introdução de uma construção effector codificação o fator de transcrição TaABF1^5,6 estabeleceu que genes induzida por ABA como HVA1 são induzidos por TaABF1, enquanto genes GA-induzido, como Amy32b são reprimidos. Bombardeio de partículas como uma estratégia experimental serviu por vários laboratórios para investigar os diversos aspectos de sinalização GA/ABA. Esse trabalho levou à identificação de elementos do promotor importantes para a ativação de GA-induzido² e genes induzida por ABA³e a descoberta de proteínas quinases⁴ e fatores de transcrição⁵ que regulam o expressão destes genes.

O existente protocolos^2,3,4,5,6 para o bombardeamento de partículas e mensuração subsequente da expressão do gene transiente são bastante trabalhoso, como cada conjunto de bombardeados mal de grãos é homogeneizado à mão em um almofariz e um pilão e os ensaios enzimáticos são realizados individualmente. Este manuscrito relata um protocolo melhorado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização e o GUS ensaios para permitir que a taxa de transferência significativamente mais, permitindo um maior número de tratamentos a ser testado no mesmo experimento, e/ou a inclusão de mais repetições para cada tratamento obter mais resultados estatisticamente robustos. Resultados representativos são mostrados para a expressão de construções HVA1 e Amy32b do repórter, regulados pelo factor de transcrição TaABF1, bem como pelo GA, ABA e outras moléculas reguladoras.

Protocolo

1. preparação do efetor e Gene repórter constrói

1. Construa construções efetoras que empregam um promotor constitutivo (por exemplo, milho ubiquitin, UBI) a expressão de unidade de um frame de leitura aberto desejado. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém UBI::TaABF1 a expressão constitutiva forte de unidade de TaABF1⁵.
2. Construa construções de repórter que incluem o promotor, cuja actividade está a ser medido, colocados a montante de um frame de leitura aberto, tais como GUS. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém HVA1::GUS para medir a expressão do promotor HVA1 ^2,5.
3. Construir uma construção de controle interno (por exemplo, UBI::luciferase).
4. Usando uma coluna de ligação de sílica protocolo (consulte Tabela de materiais), preparar o plasmídeo de alta qualidade para cada uma das construções de gene necessário. Usando espectroscopia ultravioleta (veja a Tabela de materiais), cuidadosamente medir a concentração de cada preparação do plasmídeo.

2. preparação de grãos de cevada para bombardeio

1. Configurar uma planilha (ver Figura 1 para obter um exemplo) indicando o plasmídeo que será bombardeado, os tratamentos hormonais adequados e outras informações relevantes para cada tratamento que farão parte do experimento.
2. Usando uma placa de corte e uma lâmina de barbear estéril, cortar os embriões a partir de grãos de cevada Himalaya (40 para cada tratamento incluído no experimento). Exclua os grãos que são descoloridos ou substancialmente menor do que a média.
3. Coloque todos os grãos de embryoless em um tubo de 50 mL. Adicione 40 mL de água e pedra por 10 minutos.
4. Despeje a água com cuidado (para evitar a perda de grãos) e adicionar 40 mL de água sanitária 10%. Rocha por 20 minutos.
5. Deite fora a água sanitária e adicionar 40 mL de água estéril. Pedra por 5 minutos. Repeti esta lavagem de água estéril quatro vezes mais.
6. Adicionar 40 mL de solução de absorver (succinato de sódio de 20 mM, 20 mM de cloreto de cálcio, pH 5,0) e 40 μL de solução cloranfenicol (10 mg/mL).
7. Transferência da solução (com cloranfenicol) absorver a maioria do tubo em uma placa de Vermiculite (ver Tabela de materiais). Depois transferi os grãos para a superfície do papel filtro molhado na placa de vermiculita. Espalhe os grãos uniformemente. Despeje em suficiente imbibing solução para manter os grãos parcialmente (mas não completamente) submerso. Coloque a tampa na parte superior da placa de vermiculita.
8. Incube os grãos de embryoless a 24 ° C, durante cerca de 48 h com iluminação fluorescente. Adicione solução absorvendo adicionais conforme necessário.
9. Abrir-se um prato de petri de plástico 90mm e despeje 20 mL da solução de absorver para o prato em si e 20 mL a tampa invertida. Adicione 20 μL de cloranfenicol (10 mg/mL) a cada um. Esterilize dois pares de pinças de ponta fina, mergulhando-os em álcool.
10. Coloque alguns grãos de embryoless na tampa da caixa de Petri. Usando a pinça, remova suavemente a camada de sementes (transparente) de cada grão. Ao remover o revestimento de semente do lado liso do grão, não danificam células subjacentes (aleurona). Transfira o grão descascado para a placa de Petri contendo solução absorvendo.
11. Depois de descascar o revestimento de semente de todos os grãos, devolvê-los à placa de vermiculita. Incube os grãos descascados embryoless a 24 ° C por 16-20 horas.
12. Imediatamente antes de usar os grãos para bombardeio, remova a umidade da superfície sacudindo-os entre papéis de filtro em um prato de petri.

3. preparação do ADN do plasmídeo para bombardeio

1. Rotule um tubo de 1,5 mL para cada tratamento que será incluído no experimento de bombardeio. A cada tubo, adicionar 2,5 µ g de UBI:: plasmídeo de controle interno deluciferase , 2,5 µ g de um plasmídeo do repórter GUS e a quantidade desejada (normalmente 0,025 µ g de 2,5 µ g) de um plasmídeo effector. Adicione água para trazer o volume total de 5 µ l.
2. Prepare-se 1,6 µm ouro microcarriers (ver Tabela de materiais) seguinte publicado protocolos⁶.
3. Para cada tratamento, adicione 50 µ l de suspensão microcarriers no tubo de 1,5 mL contendo Plasmídeo. Revesti o microcarriers com o plasmídeo de acordo com o protocolos^{6 do fabricante}.
4. Na etapa final, quando os plasmídeo-revestido microcarriers são suspensos em 48 µ l 100% de etanol, pipetar 8 μL da suspensão microcarriers para cada um dos cinco macrocarriers e deixe-os ao ar seco.

4. partícula bombardeio de grãos de cevada Embryoless

1. Configurar o aparelho de bombardeio de partículas (ver Tabela de materiais)⁶.
2. Coloque um disco de ruptura de 1550 psi na retenção PAC e montá-lo no instrumento.
3. Coloque um macrocarrier que contém a combinação desejada de plasmídeo (juntamente com uma tela de parar) o assembly de lançamento de microcarrier. Introduza o conjunto na ranhura superior da câmara de bombardeio. Definir a distância entre o disco de ruptura, mantendo a tampa e a tampa de cobertura macrocarrier à distância padrão (6 mm) e coloque o suporte de tela de parar na posição do meio (padrão), permitindo uma distância de viagem macrocarrier de 11 mm (Figura 2A).
4. Arrume 8 grãos embryoless em um padrão radial apertado (com as extremidades mais finas, apontando para dentro) em um círculo de papel de filtro que está pregado no chão para a tampa de um prato de petri de 90 mm (ver Figura 2B).
5. Coloque o prato com os grãos dentro da câmara de bombardeio, a uma distância de 6 cm a partir da tela de parar.
6. Evacuar a câmara de bombardeio para 95 kPa e então bombardeia a amostra.
7. Depois de lançar o vácuo, transferi os grãos bombardeados para um prato de petri 60mm etiquetados contendo 4 mL de solução absorvendo contendo 1 mg/ml de cloranfenicol.
8. Repita até que todos os bombardeamentos foram concluídos. Incube (em uma plataforma de agitação a 100 rpm) a 24 ° C por 24 horas.

5. extração de proteína solúvel de grãos bombardeados

1. Usando a pinça, remova os 8 grãos bombardeou um prato de petri 60mm e exterminá-los seco sobre papel absorvente. Divida os grãos em dois tubos etiquetados 2,0 mL (4 grãos por tubo) cada um contendo 800 μL tampão de moagem (100mm at fosfato pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de glicerol) e um grânulo de aço inoxidável de 5mm. Repita este processo para todos os de grãos bombardeados.
2. Coloque os dois racks de homogeneizador do grânulo (até 48) tubos de 2,0 mL (ver Tabela de materiais). Monte as prateleiras do homogenizador.
3. Agite as amostras em 30 Hz durante 3 minutos.
4. Retire os cestos homogenizador do homogenizador e colocá-los no gelo (5 min) para re-fixe as amostras.
5. Monte os racks volta do homogenizador - na orientação oposta. Agite as amostras novamente a 30 Hz durante 3 minutos.
6. Legal os racks no gelo, em seguida, repita passos 5.3 a 5.5. Isto irá adicionar um total de 12 minutos de agitação.
7. Centrifugue os extratos de grão a 16.000 x g a 4 ° C por 10 minutos.
8. Imediatamente após a centrifugação, decantar os sobrenadantes claros em um segundo conjunto de tubos do microcentrifuge. Dar a cada tubo um vórtice rápido. Armazene os tubos em gelo.
9. Depois de transferir o sobrenadante, recupere as esferas de aço de pelotas para que eles podem ser lavados e reutilizados.

6. medida da atividade de Luciferase de extratos de grão

1. Para cada tubo de extracto de grãos a ser analisada, prepare um tubo de ensaio de vidro 12 x 75 mm contendo 200 μL de mistura de ensaio Luciferase (45 mM Tris sulfato de pH 7,7, 15 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, Luciferina de 1 mM, 1 mM ATP).
2. Adicione 100 μL do primeiro extracto de grãos para o primeiro tubo de ensaio. Vórtice rapidamente para misturar bem. Imediatamente , coloque o tubo no suporte do tubo do luminómetro e feche a porta. Quando a medição estiver concluída, retire o tubo do luminómetro – deixando a porta aberta para a colocação do tubo próxima.
3. Repita este processo até que todas as amostras foram medidas.

7. medição de GUS atividade de extratos de grão

1. Adicione 200 μL de tampão de ensaio de GUS (50mm at fosfato pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glicuronídeo, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de metanol, 0,02% de azida de sódio) para cada poço de uma placa bem 96.
2. Colocar 50 μL de cada extrato de grão para a correspondente bem. Misture com a ponta após a adição. Sele o topo com película de vedação.
3. Incube a placa bem 96 a 37 ° C, no escuro por 20 horas.
4. Centrifugue a placa bem 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos e coloque-o no gelo.
5. Adicione 250 μL de 0,2 M Na₂CO₃ para cada poço de uma placa bem preto 96.
6. Adicionar 6,25 μL de cada mistura de ensaio centrifugada GUS para a correspondente bem (contendo 0,2 M Na₂CO₃) do negro 96 placa bem. Misture com a ponta após a adição. Inclua poços com 6,25 μL de 10 μM 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone como padrões.
7. Coloque a placa preta em um dados de placa e ler a fluorescência de methylumbelliferone. Fazer as leituras em um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Defina o ganho do instrumento tal que um bem contendo 6,25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL de 0,2 M Na₂CO₃ dão uma leitura de 1000 unidades de fluorescência.

8. análise de dados

1. Insira os valores para a luciferase e ensaios de GUS em uma planilha. Exclua da consideração qualquer amostra com uma leitura do luciferase inferior a luminescência relativa de 20.000 unidades de s^-1, já que indica que as construções do gene não foram entregue com êxito para as células de aleurona.
2. Para cada grão bombardeado com sucesso o extrato (representando um grupo de quatro grãos embryoless), calcular a expressão de GUS normalizada a partir dos dados brutos de GUS e luciferase como segue: normalizado GUS = [(expressão de GUS - GUS em branco) x (2.000.000)] / (luciferase expressão – luciferase em branco).
   Nota: Isto normaliza a quantidade de atividade de GUS, o que poderia ter sido observado em um bombardeio que deu uma leitura de luciferase de 2.000.000.
3. Relatar o nível relativo de expressão de uma construção de repórter especial na presença de construções de efetor ou tratamentos hormonais, sendo testados, comparando o nível de expressão na ausência de efetores ou hormônios.

Resultados

A técnica descrita aqui pode ser usada para introduzir qualquer teste de construção de gene em células de aleurona de grãos de cevada. O nível de expressão do gene de teste pode então ser convenientemente medidos (Figura 2). O protocolo de taxa de transferência superior descrito aqui grandemente aumenta a eficiência da moagem de sementes e etapas de ensaio enzima. Este método tem sido usado para avaliar a capacidade da transcrição fator TaABF1

Discussão

A introdução do gene effector constrói através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter é uma estratégia valiosa para dissecar o papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização e no gene resultante hormônio-regulada expressão.
No entanto, os protocolos existentes para a realização de tais experiências em cevada aleurona células^2,3,4,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800