Medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento

Resumen

Se presenta un protocolo mejorado para la medición de la expresión de genes transitorios de construcciones de reportero en las células de aleurona de cebada después de bombardeo de partículas. La combinación de grano automático con placa de 96 pozos análisis de enzima proporciona alto rendimiento para el procedimiento.

Resumen

La capa de aleurona de cereales de cebada es un sistema de modelo importante para la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas. En las células de la aleurona, genes requieren para la germinación o desarrollo temprano de la plántula son activados por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). Los mecanismos de señalización de GA y ABA pueden ser interrogados por introducir reportero gene construcciones en las células de aleurona mediante bombardeo de partículas, con la expresión transitoria resultante medida mediante pruebas enzimáticas. Se divulga un protocolo mejorado parcialmente que automatiza y agiliza el paso de homogeneización del grano y el análisis de enzima, lo que permite mucho más rendimiento que los métodos existentes. Homogeneización de las muestras de grano se lleva a cabo utilizando un homogeneizador de tejidos automatizados, y GUS (β-glucuronidasa) los ensayos se llevan a cabo mediante un sistema de placa de 96 pocillos. Resultados representativos usando el protocolo sugieren que la actividad de la fosfolipasa D puede desempeñar un papel importante en la activación de la expresión de genes HVA1 por ABA, a través del factor de transcripción TaABF1.

Introducción

La capa de aleurona de cebada es un sistema de modelo bien establecido para el estudio de la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas¹. En particular, un número de genes necesarios para la germinación o el desarrollo temprano de la plántula es activado por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). El GA y ABA vías de señalización están entrelazados, como la expresión de algunos genes de GA activa es inhibida por ABA y viceversa¹.

Una estrategia valiosa para entender que el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA ha sido la introducción de efector gen construcciones mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero que permiten el efecto resultante en expresión del gen aguas abajo a determinarse. El uso de genes del reportero luciferasa como GUS (β-glucuronidasa) permite la medida sensible y cuantitativa de la expresión génica específicamente dentro de las células que han recibido la construcción del generador de efectos. Por ejemplo, la introducción de un concepto de efector codifican el factor de transcripción TaABF1^5,6 estableció que los genes inducidos por ABA como HVA1 son inducidos por TaABF1, mientras que de genes inducida por GA como Amy32b son reprimidos. Bombardeo de partículas como una estrategia experimental se ha utilizado por varios laboratorios para investigar diversos aspectos de la señalización de ABA/GA. Dicho trabajo ha conducido a la identificación de los elementos del promotor importantes de la activación inducida por GA² y³de genes inducidos por ABA y al descubrimiento de la proteína kinasas⁴ y factores de transcripción⁵ que regulan la expresión de estos genes.

Los actuales protocolos^2,3,4,5,6 por bombardeo de partículas y medición posterior de la expresión génica transitoria son bastante mano de obra, como cada juego de bombardea apenas granos se homogeneiza con la mano en un mortero y los análisis de enzima se llevan a cabo individualmente. Este manuscrito informa un protocolo mejorado que parcialmente automatiza y simplifica el paso de homogeneización y GUS ensayos para permitir un rendimiento significativamente más, permitiendo un mayor número de tratamientos en el mismo experimento, o la inclusión de más repeticiones para cada tratamiento obtener resultados estadísticamente robustos más. Se muestran resultados representativos para la expresión de construcciones de reportero HVA1 y Amy32b , regulado por el factor de transcripción TaABF1, así como por otras moléculas reguladoras, GA y ABA.

Protocolo

1. preparación del efector y gen reportero construye

1. Construir estructuras efectoras que emplean a un promotor constitutivo (e.g. ubiquitina de maíz, UBI) a la expresión de la unidad desde un marco de lectura abierto deseada. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene UBI::TaABF1 de fuerte expresión constitutiva unidad de TaABF1⁵.
2. Construir construcciones reportero que incluyen el promotor cuya actividad es la que se medirá, situado aguas arriba de un marco abierto de lectura, como GUS. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene HVA1::GUS para medir la expresión de la HVA1 promotor^2,5.
3. Construir un concepto de control interno (por ejemplo, UBI::luciferasa).
4. Usando una columna de sílice enlace protocolo (véase Tabla de materiales), preparación de plásmido de alta calidad para cada una de las construcciones de genes requeridos. Usando la Espectroscopia ultravioleta (véase Tabla de materiales), cuidadosamente Mida la concentración de cada preparación de plásmido.

2. preparación de granos de cebada para el bombardeo

1. Configurar una hoja de cálculo (ver figura 1 para un ejemplo) indicando la plásmidos que será bombardeada, los tratamientos adecuados de la hormona y otra información pertinente para cada tratamiento que será parte del experimento.
2. Usando una tabla de cortar y una hoja de afeitar estéril, cortar los embriones de granos de cebada de Himalaya (40 para cada tratamiento en el experimento). Excluir los granos que están decolorados o substancialmente más pequeño que el promedio.
3. Coloque los granos de embryoless en un tubo de 50 mL. Añadir 40 mL de agua y roca durante 10 minutos.
4. Vierta el agua con cuidado (para evitar la pérdida de granos) y añadir 40 mL de lejía del 10%. Roca durante 20 minutos.
5. Verter la lejía y añadir 40 mL de agua estéril. Roca durante 5 minutos. Repita este lavado con agua estéril cuatro veces más.
6. Añadir 40 mL de solución bebiendo (succinato de sodio 20 mM, cloruro de calcio 20 mM, pH 5,0) y 40 μL de la solución madre de cloranfenicol (10 mg/mL).
7. Transferir la mayor parte de la solución bebiendo (con cloranfenicol) del tubo a una placa de vermiculita (véase Tabla de materiales). Luego se transfieren los granos sobre la superficie de papel de filtro húmedo en la placa de vermiculita. Se extienden los granos uniformemente. Vierta suficiente bebida solución para guardar los granos parcialmente (pero no totalmente) sumergido. Coloque la tapa encima de la placa de vermiculita.
8. Incubar los granos embryoless a 24 ° C por cerca de 48 horas con iluminación fluorescente. Añadir solución bebiendo adicional según sea necesario.
9. Arriba de un plato de petri plástico 90 mm y vierta 20 mL de solución de ingerir en el plato sí mismo y 20 mL en la tapa invertida. Añadir 20 μL del cloranfenicol (10 mg/mL) a cada uno. Esterilizar de dos pares de pinzas de punta fina por inmersión en alcohol.
10. Coloque algunos de los granos de embryoless en la tapa de la caja Petri. Usando las pinzas, suavemente Retire la capa de semilla (transparente) de cada grano. Mientras se retira la capa de semilla desde el lado liso del grano, no dañe las células subyacentes (aleurona). Transferir el grano pelado a la placa de Petri que contenga solución de bebiendo.
11. Después de pelar la capa de la semilla de todos los granos, devolverlos a la placa de vermiculita. Incubar los granos pelados embryoless a 24 ° C durante 16-20 horas.
12. Antes de usar los granos para el bombardeo, eliminar la humedad superficial por agitación entre papeles de filtro en una placa Petri.

3. preparación de plásmido ADN para el bombardeo

1. Etiquetar un tubo de 1,5 mL para cada tratamiento que se incluirán en el experimento de bombardeo. Añadir a cada tubo 2.5 μg de UBI:: plásmido de control interno deluciferasa , 2,5 μg de un plásmido de reportero GUS y la cantidad deseada (generalmente 0.025 μg 2.5 μg) de un plásmido de efector. Añadir agua para hacer el volumen total de 5 μl.
2. Preparar 1,6 microcarriers μm oro (véase Tabla de materiales) siguiente publicado protocolos⁶.
3. Para cada tratamiento, añada 50 μl de suspensión microcarriers en tubo de 1,5 mL que contiene el DNA plasmídico. Capa microcarriers con ADN plásmido según protocolos^{6 fabricante}.
4. En el paso final, cuando el microcarriers revestido de plásmido se suspenden en 48 μl 100% de etanol, pipeta 8 μL de microcarriers suspendido en cada una de cinco macrocarriers y deje al aire seco.

4. partícula bombardeo de granos de cebada Embryoless

1. Configurar el aparato de bombardeo de partículas (véase Tabla de materiales)⁶.
2. Montar en el instrumento y coloque un disco de ruptura de 1550 psi en la tapa de retención.
3. Coloque una macrocarrier que contiene la combinación deseada de plásmido (junto con una pantalla de parada) en la Asamblea de lanzamiento de potencia. Inserte el montaje en la ranura superior de la cámara de bombardeo. Ajuste la distancia entre el disco de ruptura conserva la tapa y la tapa de macrocarrier a la distancia estándar (6 mm) y coloque el soporte de la pantalla de parada en la posición media (estándar), lo que permite un recorrido macrocarrier de 11 mm (figura 2A).
4. Colocar 8 granos embryoless en un patrón radial apretado (con los extremos más delgados apuntando hacia dentro) en un círculo de papel de filtro que se graba hacia abajo del plano a la tapa de una caja de Petri 90 mm (ver figura 2B).
5. Coloque el plato con los granos en la cámara de bombardeo, a una distancia de 6 cm de la pantalla de parada.
6. Evacuar la cámara bombardeo a 95 kPa y luego bombardear la muestra.
7. Después de lanzar el vacío, transferir los granos bombardeados a un etiquetado 60 mm placa de Petri que contiene 4 mL de solución bebiendo 1 mg/ml de cloranfenicol.
8. Repita hasta que todos los bombardeos se han completado. Incubar a 24 ° C 24 horas (en una plataforma de agitación a 100 rpm).

5. extracción de la proteína Soluble de los granos bombardeados

1. Con unas pinzas, quitar los 8 granos bombardeados de un plato de petri de 60 mm y borra los seca en una toalla de papel. Dividir los granos en dos tubos etiquetados 2,0 mL (4 granos por tubo), cada una con 800 μL tampón pulir (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 μg/mL leupeptin, 20% de glicerol) y una tira de acero inoxidable de 5 mm. Repita este proceso para todos los granos bombardeados.
2. Colocar tubos de 2.0 mL (hasta 48) en las dos parrillas del homogenizador de grano (véase Tabla de materiales). Montar los estantes en el homogenizador.
3. Agitar las muestras en 30 Hz durante 3 minutos.
4. Retire los soportes de homogeneizador de la homogeneizadora y coloque en hielo (5 min) para volver a enfriar las muestras.
5. Instale los estantes en el homogenizador - en la orientación opuesta. Agitar nuevamente las muestras a 30 Hz durante 3 minutos.
6. Enfriar las parrillas en el hielo, repita los pasos 5.3 a 5.5. Esto se suman un total de 12 minutos de agitación.
7. Centrifugar los extractos de grano a 16.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
8. Inmediatamente después de la centrifugación, decantar el sobrenadante claro en un segundo conjunto de tubos de microcentrífuga. Dar cada tubo vortex rápido. Almacenar los tubos en hielo.
9. Después de transferir el sobrenadante, recuperar los granos de acero de los pellets para ser lavados y reutilizados.

6. medición de la actividad de luciferasa de extractos de grano de

1. Para cada tubo del extracto de grano a ensayar, preparar un tubo de ensayo de vidrio 12 x 75 mm que contiene 200 μL de la mezcla de ensayo de luciferasa (45 mM Tris pH 7.7, 15 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 1, 5 mM EDTA, luciferin de 1 mM, 1 mM ATP del sulfato).
2. Añada 100 μL del extracto de grano primera al primer tubo de ensayo. Vórtice rápidamente para mezclar bien. Inmediatamente Coloque el tubo en el soporte del tubo de luminómetro y cierre la puerta. Una vez terminada la medición, retire el tubo del luminómetro, dejando la puerta abierta para la colocación del tubo siguiente.
3. Repita este proceso hasta que todas las muestras han sido medidas.

7. medición de la actividad de GUS de extractos de grano de

1. Añadir 200 μL de tampón de ensayo de GUS (50 mM Na fosfato, pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 μg/mL leupeptin, metanol 20%, 0,02% de azida sódica) a cada pocillo de una placa bien 96.
2. Depositar 50 μL de cada extracto de grano en el correspondiente bien. Después de agregar la mezcla con la punta. Selle la parte superior con la película.
3. Incube la placa bien 96 a 37 ° C en la oscuridad durante 20 horas.
4. Centrifugue la placa bien 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos y coloque en hielo.
5. Añadir 250 μL de 0,2 M de Na₂CO₃ en cada pocillo de una placa bien negro 96.
6. Añadir 6,25 μL de cada mezcla de ensayo centrifugado de GUS a los correspondientes (que contiene 0,2 M Na₂CO₃) pozo del negro 96 bien la placa. Después de agregar la mezcla con la punta. Son pozos con 6,25 μL de 10 μM, 40 μM y 100 μM 4-methylumbelliferone como estándares.
7. Coloque la placa negra en un fluorómetro de placa y leer la fluorescencia de methylumbelliferone. Tomar las lecturas a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de la emisión de 460 nm. Establecer la ganancia del instrumento de forma que un bien que contienen 6.25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone y 250 μL de 0,2 M de Na₂CO₃ dan una lectura de 1000 unidades de fluorescencia.

8. Análisis de datos

1. Introduzca los valores de los análisis de GUS y luciferasa en una hoja de cálculo. Excluir de consideración cualquier muestra con una lectura de luciferase de inferior a 20.000 luminiscencia relativa unidades s^-1, esto indica que las construcciones de genes no fueron entregadas con éxito a las células de la aleurona.
2. Para cada grano bombardeado con éxito extraer (representando a un grupo de cuatro granos embryoless), calcular la expresión de GUS normalizada de los datos brutos de GUS y luciferasa como sigue: normalizado GUS = [(expresión de GUS - GUS en blanco) x (2.000.000)] / (luciferase expresión-luciferasa en blanco).
   Nota: Esto normaliza la cantidad de actividad de GUS lo hubiera observado en un bombardeo que dio una lectura de luciferase de 2.000.000.
3. Informe el nivel relativo de expresión de una construcción particular reportero en presencia de construcciones efectoras o tratamientos hormonales, siendo probados por comparación con el nivel de expresión en la ausencia de efectores o las hormonas.

Resultados

La técnica descrita aquí puede utilizarse para introducir cualquier prueba gen construcción en células de aleurona de granos de cebada. El nivel de expresión del gen de la prueba puede entonces ser medido convenientemente (figura 2). El protocolo de rendimiento más alto descrito aquí grandemente aumenta la eficiencia de la molienda de la semilla y pasos de análisis de enzima. Este método se ha utilizado para evaluar la capacidad del factor de transcr...

Discusión

La introducción del gen efector construye mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero es una estrategia valiosa para el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA y en el gen de la hormona regulada resultante de la disección expresión.
Sin embargo, los protocolos existentes para llevar a cabo tales experimentos en cebada aleurona células^2,3,4...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800