رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تأثير الببتيدات على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. يسمح هذا الأسلوب للحصول على بيانات كمية عن سرعة الإغلاق الهجرة والجرح خلية السريع واستنساخه بدرجة عالية.

Abstract

والهدف من هذا العمل لإظهار طريقة جديدة لتقييم قدرة بعض الجزيئات إيمونومودولاتوري، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، حفز الهجرة الخلية. الأهم من ذلك الهجرة الخلية حدث الحد من معدل أثناء عملية التئام إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة. ميزة هذا الأسلوب على التحليل الكلاسيكي، الذي يستند إلى الصفر يدوياً صنع في أحادي الطبقة خلية، إدراج استخدام الثقافة السيليكون الخاصة توفير حجرات اثنين لإنشاء حقل تجرح شبه خالية من خلية مع عرض المعالم (500 ميكرومتر ). وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن سبب منصة تحليل صورة الآلي، سرعة الحصول على البيانات الكمية على سرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. أكثر دقة، سيظهر أثر اثنين جلد الضفدع الامبير على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. وعلاوة على ذلك، ستوفر المعالجة المسبقة لهذه الخلايا مع مثبطات محددة معلومات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأحداث.

Introduction

ومن المعروف أنه إلى حد كبير أن التئام الجروح في الحيوانات عملية أساسية إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة¹. وبالرغم من الأسطح الظهارية المعرضة للبيئة الخارجية (مثل الجلد، والجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي المسالك) تشكل حاجزاً واقيا من الشتائم الفيزيائية والكيميائية، وتشكيل الجروح يمكن أن تحدث بسهولة، لا سيما بعد الجراحة أو العدوى الميكروبية². على سبيل مثال، استعمار أنسجة الرئة بمسببات المرض البكتيري الانتهازية الزّنجاريّة Pseudomonas، خاصة في مرضى التليف الكيسي (CF)، يؤدي إلى الأضرار من ظهارة الخطوط الجوية مع ما يترتب عليه من فشل الجهاز التنفسي^{3، 4}. التئام الجروح إليه إصلاح مضيف معقدة لاستعادة الهيكل العادي النسيج المصاب⁵. ويتميز بالتهاب الأولى، تليها فترة تجديد يشمل ابيثيلياليزيشن والأوعية والأنسجة يعيد البناء مع إنتاج الكولاجين والخلية التمايز^6،7،8 . لضمان سلامة الظهارية والتحكم في انتشار الميكروبات، جميع الكائنات الحية تنتج جزيئات الدفاع، بما في ذلك مضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير)^9،10. الجرح الشفاء عملية من الصعب جداً لمحاكاة في المختبر بسبب الافتقار إلى الحطام الخلية والتفاعلات المعقدة بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، في المختبر قدرة الببتيد لتسريع إغلاق الجرح الزائفة عن طريق حفز هجرة خلايا الظهارية يدل على قدرته على الشفاء من ظهارة الشبهة. وفي الواقع، الهجرة الخلية حدث الحد من معدل في التئام الجروح، ودراسة العوامل التي يمكن أن تؤثر الهجرة الخلية سيساعد على العلاجات المستهدفة لتحسين التئام الجروح.

هنا، يتم توفيرها تحليل تجريبي استنساخه بدرجة عالية استناداً إلى إدراج الثقافة السيليكون الخاص لتقييم الهجرة الخلايا في المختبر. ويستند على خلق فجوة ميكرومترات 500 (الجرح الزائفة) على أحادي الطبقة خلية المتلاقية. سوف تبدأ الخلايا عند حافة الحقل "الجرحى" الاصطناعي هاجروا إلى منطقة خالية من الخلية، وتشكيل خلية خلية اتصالات جديدة. ويمثل إدراج الثقافة أداة جديدة للجرح بسرعة شفاء التجارب. يتم توفير خزانان مفصولة بواسطة جدار 500 ميكرومتر، ويمكن وضعها بشكل صحيح في لوحة طبق 3 سم أو في بئر صفيحة 12-جيدا. ملء كل حجرة من الإدراج مع تعليق خلية يسمح للخلايا تنمو في كل مجال من المجالات المعينة حتى التقاء، بينما إزالة الإدراج سوف تولد فجوة نظيفة خالية من خلية من حوالي 500 ميكرومتر (بنفس عرض الجدار الفاصل). متوسطة ثقافة خلية الصحيحة وتستكمل مع مجمع لاختبار يمكن إضافتها فيما بعد إلى الطبق لوحة/جيدا. وبعد ذلك يمكن تصور إغلاق الفجوة في فترات زمنية مختلفة تحت مجهر مقلوب، يفضل واحدة مزودة بكاميرا فيديو للحصول على الصور. وأخيراً، سيسمح قياس التغيرات في المنطقة المغطاة بالخلية ببرنامج تحليل الصورة التلقائية المستندة إلى ويب التحديد الكمي لسرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. وعموما، هذا الأسلوب خطوة إلى الأمام فيما يتعلق بالتحليل الكلاسيكية، حيث الصفر يدوياً بواسطة إينسيسينج مونولاييرس خلية المتلاقية مع إبرة معقمة أو ماصة نصيحة¹¹. وفي الواقع، يمكن أن تدمر الإجراء الأخير أسفل الطبق البلاستيك لوحة/جيدا وطلاء السطح، خلق التجاعيد. وبالإضافة إلى ذلك، منطقة "الجرحى" لا يكون عرض المعالم على طول الفجوة، كهذا يعتمد إلى حد كبير على الضغوط التي مورست من الباحثين بالإبرة/التلميح. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزاحة كتل من الخلايا الحية والميتة في حواف الصفر؛ وعلاوة على ذلك، انتشار الخلايا الحية في منطقة "الجرحى" يمكن أن تتداخل مع سرعة الهجرة الخلية، وتوليد نتائج غير قابل لإعادة الإنتاج¹².

وبالإضافة إلى ذلك، وبفضل منصة تحليل صورة الصفر، يمكن للمستخدمين سرعة استلام (خلال دقائق) البيانات الكمية بشأن سلوك المهاجرة من الخلايا المحددة دون الحاجة إلى الحصول على برامج إضافية. هذا البرنامج قادر على تحليل التباين مرحلة الفحص المجهري الصور منخفض (~ 5 س)، والمتوسطة (~ 10 X)، والتكبير عالية (~ 20 X). بعد تحميل ملف مضغوط للصور (في *.jpg، *.jpeg، *.jp2، *.png، *.gif، تنسيق *.tiff) يجري التحليل تلقائياً لإنشاء ملف ملخص يبين النسبة المئوية للمناطق المغطاة بالخلية ومناطق الاحتكاك، وكذلك سرعة الخلية الهجرة، في فترات زمنية مختلفة.

في هذا العمل، باستخدام جلد الضفدع أمبير-مشتق، أي Esc(1-21) وفي دياستيريومير Esc(1-21)-1 ج¹³، وخط خلية الشعب الهوائية معربا عن وظيفية التليف الكيسي transmembrane الموصلية منظم (CFTR)^14،15، ويرد مثال للهجرة الخلية الببتيد المستحثة بالمقارنة مع عينات غير المعالجة (التحكم). ملاحظة أن ظهارة مجرى الهواء و CFTR تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على وظائف الرئة والجرح إصلاح¹⁶. وعلاوة على ذلك، عن طريق مثبطات انتقائية (مثلاً، AG1478)¹⁷ من مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، دليل على أن هجرة خلايا الشعب الهوائية الناجمة عن الببتيدات المشار إليها أعلاه ينطوي على تفعيل EGFR^12، ويقال ¹⁸ .

وخلاصة القول، أن الهدف من هذا الإجراء لإظهار كيفية الاستخدام من هذا القبيل إدراج الثقافة سيليكون يمثل مقايسة سريعة ويمكن الوصول إليها بسهولة لدقة تحديد الهجرة ملتصقة الخلايا (مثل الخلايا الظهارية الشعب الهوائية) والجزيئية آليات التحكم في مثل هذه الأحداث.

Protocol

1-إعداد الخلية

1. البذور 2.5x10⁶ خلايا في 10 مل من المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع الجلوتامين 2 مم (ميمج)، بالإضافة إلى 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية (0.1 مغ/مل من البنسلين وستربتوميسين) بوروميسين (0.5 ميكروغرام/ملليلتر لاختيار وصيانة الخلية خط) في قارورة T75. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة يومين. قبل البدء التجربة، تحقق التقاء الخلايا تحت مجهر مقلوب.
   ملاحظة: الخلايا المستخدمة للتجربة هي مخلدة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان عشر ترانسدوسيد مع ناقل لينتيفيرال منح المقاومة إلى بوروميسين. ستابلي يعربون عن^14،CFTR فنية¹⁵.
2. بمجرد التقاء الخلايا وصلت إلى 90-100%، نضح المتوسطة من قارورة وتخلص منه في زجاجة نفايات تحت فئة سلامة بيولوجية مجلس الوزراء ثانيا. تغسل الخلايا مع 6 مل فوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (مركز المرأة والأسرة-برنامج تلفزيوني). بلطف روك قارورة يدوياً وتجاهل الأسرة-برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: كن حذراً لا للمس المونولاير الخلية مع الماصة.
3. أضف 10 مل من مركز المرأة والأسرة-برنامج تلفزيوني واحتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 10 دقائق.
4. نضح الأسرة-برنامج تلفزيوني وتجاهل ذلك. ثم أضف 2 مل من التربسين/أدتا إلى قارورة.
5. روك بلطف قارورة، مما يتيح حل تماما معطف الخلايا، واحتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 10 دقائق حتى يتم فصل الخلايا مرئية تحت مجهر.
   ملاحظة: في نهاية فترة الحضانة، وينبغي أن تظهر الخلايا مدورة ولا تعلق على سطح البلاستيك. إذا كانت الخلايا غير منفصلة تماما، قد يلزم الانفعالات اليدوي.
6. أضف 10 مل من ميمج بالإضافة إلى 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا بغسل الجزء السفلي قارورة. تحويل وحدة التخزين إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
7. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 80 x ز.
8. نضح المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في 6 مل ميمج بالإضافة إلى 10% FBS. ماصة مرارا وتكرارا تفريق أي كتل.
9. تأخذ 10 ميليلتر من تعليق خلية مع ميكروبيبيتي وحقن الحجم إطار الزجاج غطاء وضع سابقا أكثر من دائرة باركر أو نويباور.
10. حساب عدد الخلايا.

2-خلية البذر في الثقافة بإدراج

1. في كل من لوحة 12-جيدا جيدا، نقل إدراج الثقافة مع ملاقط معقمة (الشكل 1). استخدام الملقط للضغط على طول حواف إدراج بغية إصلاحها على سطح اللوحة.
   ملاحظة: قد يدرج الجانب السفلي لزجة تسمح الالتصاق.

الشكل 1 : التمثيل التخطيطي من إدراج ثقافة السيليكون، وضعت بشكل صحيح في آبار صفيحة 12-جيدا- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. يضعف بشكل صحيح تعليق خلية في ميمج بالإضافة إلى 10% FBS. ملء كل حجرة من الإدراج مع 70 ميليلتر من تعليق خلية (حوالي 3.5x10⁴ خلايا/الدائرة).
   ملاحظة: كثافة الخلايا التي تطبق في كل حجرة يعتمد على نوع الخلايا. من المستحسن استخدام كثافة خلايا يؤدي إلى إكمال التقاء خلال 24 ساعة.
3. تحت المجهر، تحقق من عدم حدوث أي تسرب من المقصورات إدراج الخلايا واحتضان لوحة 12-جيدا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون₂.

3-شبه تجرح المقايسة الشفاء

1. وبعد الحضانة، تصور الخلايا تحت المجهر المقلوب للتحقق من أنه تم تشكيل خلية المتلاقية مونولاييرس.
2. تعليق إعادة المركبات الاختبار (مثلاً الامبير) في 1 مل ميمج.
   ملاحظة: يعد تخفيف الامبير جديدة بدءاً من حل الأسهم المخزنة في-20 درجة مئوية.
3. إزالة بلطف إدراج بملاقط معقمة. أن يكون حريصا على عدم كسر مونولاييرس الخلية. نقل إدراج على ورقة ماصة.
   ملاحظة: لإعادة استخدام إدراج نفس، وبهدف لهم في الإيثانول 70% على الأقل من 3 ح. من المستحسن للتخلص منها بعد ذلك.
4. لإزالة الخلايا غير ملتصقة، أضف 1 مل ميمج الواحدة وكذلك استخدام ميكروبيبيتي. إغلاق اللوحة والصخرة بلطف.
   ملاحظة: لا تقم بإضافة المتوسطة مباشرة على رأس الخلية مونولاييرس تفادي تعطل بهم.
5. نضح على المديين المتوسط واستبدله مع 1 مل ميمج في البئر. إغلاق اللوحة وتصور الفجوات الخلية الحرة (الذي أنشأته إدراج) تحت المجهر المقلوب في 4 X التكبير، مجهزة بكاميرا فيديو. الحصول على الصور في وقت صفر (T0) وحفظها في تنسيق.jpg.
6. إزالة المتوسطة من الآبار وغسلها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتجاهل ذلك.
7. إضافة اختبار المركبات (أعدت في النقطة 3، 2) للآبار. لعينات مراقبة غير المعالجة، وإضافة 1 مل ميمج. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
8. بعد 15، 20، ومعاملة ح 24، مراقبة الهجرة الخلية تحت المجهر في 4 X التكبير والحصول على الصور.
   ملاحظة: خلال هذه الخطوة، في محاولة لالتقاط الصور في نفس المناطق وبالنسبة T0. اختيار الفترات الزمنية التي يتم التقاط الصور يعتمد على سرعة الهجرة الخلية.
9. لدراسة تأثير بعض مثبطات انتقائية، أي AG1478، على الهجرة الخلية، نضح المتوسطة من كل حجرة إدراج قبل إزالة إدراجات.
   1. تغسل كل حجرة مع ميمج جديدة وملء مع 70 ميليلتر من ميمج وتستكمل مع AG1478.
   2. وبعد 30 دقيقة من الحضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂، المضي قدما كما هو موضح من 3.3 نقطة.
      ملاحظة: أثناء خطوة الغسيل والمعالجة المسبقة للخلية مونولاييرس مع مثبطات محددة، يكون حريصا على عدم إزالة تدرج.

4. تحليل الصورة

1. عند الانتهاء من هذه التجربة، حدد صور العينات الأكثر تمثيلاً لمختلف المجموعات التجريبية، وإنشاء ملف مضغوط يحتوي على صور واحدة في ح T0، T15، T20، و T24.
   ملاحظة: تؤخذ صور واحدة في الفترات الزمنية المحددة لجميع العينات. قم بتشغيل تريبليكاتيس لكل تجربة، والذي يتكرر ثلاث مرات على الأقل. في النهاية، للمجموعات التجريبية كل شيء، الحد ني صور 3 ("أ"، "ب"، "ج"، إلخ، المستمدة من كل تجربة مستقلة) عند كل نقطة الوقت يتم تحليلها.
2. تحميل ملف مضغوط إلى برمجيات تحليل الصورة التي تقدم عن طريق البريد الإلكتروني تلقائياً ملف ملخص جدول بيانات التي تحتوي على البيانات التجريبية للمناطق المغطاة بالخلية والصفر (كنسبة مئوية) عند نقطة زمنية محددة.
   ملاحظة: يستند الاعتراف بالحافة الأمامية ومنطقة الفجوة إلى حد كبير على طريقة الكشف عن حافة (الرامية إلى تحديد النقاط التي يتغير سطوع الصورة حادا).
3. حفظ البيانات وجمعها. تطبيع جميع البيانات فيما يتعلق بقيمة متوسط الوقت صفر. حساب قيمة المتوسط للبيانات الموحدة لجميع replicates عند كل نقطة الوقت والخطأ القياسي النسبي (SEM). باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA)، إجراء تحليل إحصائي مع برامج الإحصائية مناسبة. تعتبر الاختلافات بين مجموعات معاملة الببتيد ومجموعات التحكم في فترات زمنية مختلفة لتكون إحصائيا significant ف< 0.05.
4. رسم البيانات التي تم الحصول عليها في رسم بياني كالرسم بياني، الذي يبين النسبة المئوية للمنطقة المغطاة بخلية لكل عينة المجموعات مقابل الفواصل الزمنية المحددة.

النتائج

هذا البروتوكول المستخدم لتحديد الجرح الشفاء أثر Esc(1-21) و Esc(1-21)-1 ج من حيث نشاط الهجرة الخلية التي يسببها في الخلايا الظهارية الشعب الهوائية معربا عن CFTR الوظيفية. ووضعت في هذا التحليل، إدراج الثقافة في آبار صفيحة 12-جيدا، وكل حجرة وكان المصنف مع خلايا 35,000 في ميمج وتستكمل مع 10%...

Discussion

الهجرة الخلية عملية أساسية في العديد من الأحداث الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك التئام الجروح، التطور الجنيني، وسرطان خبيث. ويشمل الإجراء الأساسي لدراسة الخلية الهجرة في المختبر : (ط) إنشاء خلية أحادي الطبقة، (ثانيا) إنتاج الجرح الزائفة في الطبقة المتلاقية للخلايا، يتم التوصل إلى ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0