一种新的体外创面愈合试验评价细胞迁移

摘要

在这里, 我们提出一个评估肽对支气管上皮细胞迁移的影响的协议。这种方法允许快速和高度重复获取的数量数据的速度的细胞迁移和伤口闭合。

摘要

这项工作的目的是显示一种新的方法来评估一些免疫调节分子, 如抗菌肽 (安培) 的能力, 以刺激细胞迁移。重要的是, 细胞迁移是创伤愈合过程中的速率限制事件, 重建损伤后组织层的完整性和正常功能。这种方法的优势, 在经典的化验, 这是基于一个手工制造的从头在细胞单层, 是使用特殊的硅胶文化插入提供两个舱室, 以创建一个无细胞的伪伤口领域, 有明确的宽度 (500 微米).此外, 由于一个自动化的图像分析平台, 有可能迅速获得定量数据的伤口闭合和细胞迁移的速度。更确切地说, 两个蛙皮放大器对支气管上皮细胞迁移的影响将显示出来。此外, 预处理这些细胞与特定抑制剂将提供信息的分子机制的基础上, 这些事件。

引言

众所周知, 动物创面愈合是重建损伤后组织层完整性和正常功能的一个基本过程¹。尽管暴露于外部环境的上皮表面 (例如,皮肤、呼吸道和胃肠道) 构成了对物理和化学侮辱的保护性屏障, 但伤口的形成很容易发生, 特别是在手术或微生物感染²。例如, 由机会性细菌病原体 (特别是囊性纤维化) (CF) 引起的肺组织的殖民化, 导致呼吸道上皮损害, 从而造成呼吸衰竭^{3, 4}。伤口愈合是一个复杂的主机修复机制, 恢复正常结构的受伤组织⁵。它的特点是初始炎症, 其次是再生期, 包括上皮, 血管生成和组织重塑与胶原蛋白生产和细胞分化^6,7,8.为确保上皮完整性和控制微生物增殖, 所有生物体都产生防御分子, 包括抗菌肽 (安培)^9,10。创伤愈合过程是非常困难的模拟在体外由于缺乏细胞碎片和复杂的相互作用在不同的细胞类型之间。然而, 肽的体外能力通过刺激上皮细胞的迁移来加速闭合假伤口, 这表明它有能力愈合受损的上皮。事实上, 细胞迁移是创伤愈合中的速率限制事件, 研究影响细胞迁移的因素将有助于改善伤口愈合的靶向治疗。

在此基础上, 提出了一种高度可重现性的实验检测方法, 它是基于特殊的硅胶培养插入来评估细胞迁移的体外。它是建立在一个500微米的缺口 (伪伤口) 的汇合细胞单层。在人工 "受伤" 领域边缘的细胞将开始迁移到无细胞区, 形成新的细胞细胞接触。文化插入代表了一个新的工具, 快速伤口愈合实验。提供两个由500微米壁隔开的储层, 它们可以适当地放置在3厘米厚的盘子里, 或者放在12井板的井中。将插入的每个隔间填满一个细胞悬浮, 允许细胞在每个指定区域内生长直至汇合, 而除去插入物将产生一个干净的无细胞间隙, 约500微米 (与隔离墙相同的宽度)。一个适当的细胞培养培养基, 辅以测试化合物, 然后可以添加到盘子里/好。然后, 在倒置显微镜下, 可以在不同的时间间隔内可视化间隙闭合, 最好是配备有摄像机进行图像采集。最后, 通过基于 web 的自动图像分析程序测量细胞覆盖区域的变化, 可以量化伤口闭合和细胞迁移的速度。总的来说, 这种方法是一个向前迈进的经典化验, 其中一个划痕是手动切割汇合细胞单膜与无菌针或吸管提示¹¹。事实上, 最后的程序可以摧毁盘子的塑料底部/井和表面涂层, 造成皱纹。此外, "受伤" 区域没有一个明确的宽度沿整个长度的差距, 因为这高度取决于研究人员的压力, 对针/尖。此外, 脱落的细胞可以形成团簇的活和死细胞在边缘的划痕;此外, 将活细胞扩散到 "受伤" 区域可能会干扰细胞迁移速度, 产生不可重现的结果¹²。

此外, 由于一个划痕图像分析平台, 用户可以迅速收到 (几分钟内) 的数量数据的迁移行为的选定细胞, 而不需要获得额外的软件。该平台能够分析低 (~ 5 x)、中等 (~ 10 x) 和高 (~ 20 x) 放大倍数的相位对比显微镜图像。上传图像的 zip 文件后 (在 * 中. jpg, *. jp2, *. png, *. tiff 格式) 将自动进行分析, 以生成一个摘要文件, 显示单元格覆盖区域和划痕区域的百分比, 以及单元格的速度迁移, 在不同的时间间隔。

在这项工作中, 通过使用青蛙皮肤安培导数,即esc (1-21) 和它的 diastereomer esc (1-21)-1 c¹³, 和一个支气管细胞线表达功能 CF 跨膜电导调节器 (CFTR)^14,15,以多肽诱导的细胞迁移为例, 与未处理的 (对照) 样品进行比较。注意, 气道上皮和 CFTR 在维持肺功能和伤口修复方面起着至关重要的作用¹⁶。此外, 通过选择性抑制剂 (例如, AG1478), 表皮生长因子受体 (EGFR) 的¹⁷ , 证据表明, 上述肽诱导的支气管细胞迁移涉及激活 EGFR^12,报告了¹⁸ 。

总之, 这个过程的目的是显示如何使用这种硅胶培养插入物代表一个快速和容易接近的检测, 以准确地确定黏附分子的迁移 (例如,支气管上皮细胞) 和控制此类事件的机制。

研究方案

1. 细胞制剂

1. 种子 2.5x10⁶细胞在10毫升的最低基本培养基 (内存) 补充2毫米谷氨酰胺 (MEMg), 加上10% 胎牛血清 (血清), 抗生素 (0.1 毫克/毫升青霉素和链霉素), 和嘌呤霉素 (0.5 µg/毫升的选择和维护细胞线) 在一个 T75 瓶。将烧瓶在37摄氏度和 5% CO₂孵化2天。在开始实验之前, 检查细胞在倒置显微镜下的汇合。
   注: 用于实验的细胞是永生化的人支气管上皮细胞转基因与慢病毒载体的载体, 赋予嘌呤霉素抗性。他们稳定地表达功能 CFTR^14,15。
2. 一旦细胞的汇合达到 90-100%, 从烧瓶中吸取培养基, 并将其丢弃在生物安全柜 ii 类的废物瓶中。用6毫升磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞, 不含钙和镁。手动摇动烧瓶并丢弃。
   注意: 小心不要用吸管接触细胞单层。
3. 添加10毫升的37摄氏度和 5% CO₂的烧瓶和孵化的瓶, 10 分钟。
4. 把它吸掉, 然后扔掉它。然后在烧瓶中加入2毫升的胰蛋白酶/EDTA。
5. 轻轻地摇动烧瓶, 允许溶液完全涂上细胞, 在37摄氏度和 5% CO₂上孵化出的烧瓶10分钟, 直到细胞在显微镜下可见分离。
   注: 在孵化时间结束时, 细胞应呈圆形, 不附着在塑料表面。如果细胞没有很好的分离, 人工搅拌可能是必要的。
6. 加入10毫升的 MEMg 加10% 的血清, 以灭活胰蛋白酶, 并通过洗涤烧瓶的底部收集细胞。将体积转换成锥形50毫升管。
7. 在 80 x g上离心管5分钟。
8. 在6毫升的 MEMg 加10% 的血清中, 吸入上清并重新悬浮细胞。用吸管反复分解任何团簇。
9. 用微取出10µL 细胞悬浮液, 并在先前放在 Burker 或 Neubauer 室的盖玻璃下注入体积。
10. 计算单元格数。

2. 细胞播种在文化插入

1. 在12井板的每一个井, 转移文化插入与无菌镊子 (图 1)。使用镊子按下插入边, 以便将它们固定在板材的表面。
   注: 插入有一个粘性的底部, 允许粘合。

图 1: 硅树脂培养基的示意图表示, 正确放入12井板的井中.请单击此处查看此图的较大版本.

2. 适当稀释 MEMg 中的细胞悬浮液加10% 的血清。用70µL 细胞悬架 (大约 3.5x10⁴细胞/室) 填充插入物的每个隔间。
   注意: 每个隔间中应用的细胞密度取决于细胞的类型。建议使用一个细胞密度, 导致24小时内完全汇合。
3. 在显微镜下, 检查细胞是否从插入隔间漏出, 并在37摄氏度和 5% CO₂上孵化12井板24小时。

3. 伪创伤愈合试验

1. 孵化后, 在倒置显微镜下对细胞进行可视化, 以验证是否形成了汇合细胞膜。
2. 在1毫升的 MEMg 中重新挂起测试化合物 (例如,安培)。
   注: 准备新鲜安培稀释从库存解决方案存储在-20 °c。
3. 用无菌镊子轻轻取出刀片。小心不要打破细胞膜。将插入物转移到吸水性纸上。
   注: 要重新使用相同的刀片, 在70% 乙醇消毒, 至少3小时。建议以后把它们扔掉。
4. 要去除非黏附的细胞, 增加1毫升 MEMg 每井使用微。关上盘子, 轻轻地摇动它。
   注: 请勿直接在细胞膜上添加培养基, 以避免其破裂。
5. 吸入培养基, 并用1毫升 MEMg。关闭板和可视化的无细胞间隙 (由插入创建) 下倒置显微镜下4X 放大, 配备了一个视频摄像头。获取图像的时间为零 (T0), 并将其保存为. jpg 格式。
6. 从水井中取出介质, 用1毫升的 PBS 冲洗, 然后丢弃。
7. 将测试化合物 (3.2 点准备) 添加到油井中。对于未经处理的对照样品, 添加1毫升的 MEMg。在37摄氏度和 5% CO₂上孵化板材。
8. 15、20、24小时治疗后, 观察显微镜下的细胞迁移4X 倍放大, 获取图像。
   注意: 在此步骤中, 尝试在与 T0 相同的区域中捕获图像。捕捉图像的时间间隔的选择取决于细胞迁移速度。
9. 为了研究某些选择性抑制剂的影响,即AG1478 在细胞迁移过程中, 在移除插入物之前从每个插入间隔中吸入介质。
   1. 用新鲜的 MEMg 清洗每个车厢, 并用70µL MEMg 补充 AG1478。
   2. 在37°c 和 5% CO₂的孵化30分钟后, 按照从点3.3 的说明进行操作。
      注: 在洗涤步骤和前处理的细胞膜与特定抑制剂, 小心不要删除插入。

4. 图像分析

1. 实验完成后, 选择各种实验组最具代表性的样本, 并在 T0、T15、T20 和 T24 h 上创建一个包含单个图像的 zip 文件。
   注意: 在选定的时间间隔内为所有样本拍摄单个图像。运行 triplicates 为每个实验, 这是重复至少三次。最后, 对所有实验组, 分析了每一个时间点的至少3张图像 ("a"、"b"、"c"、等等, 分别从每个独立实验中推导出来)。
2. 将 zip 文件上载到图像分析软件中, 通过电子邮件自动提供电子表格摘要文件, 其中包含所选时间点上的单元格覆盖和划痕区域的实验数据 (百分比)。
   注意: 对前缘和间隙区域的识别主要是基于边缘检测方法 (旨在识别图像亮度急剧变化的点)。
3. 保存数据并收集它们。在时间零处正常化所有数据的平均值。计算每个时间点上所有复制的规范化数据的平均值和相对标准误差 (SEM)。通过对方差进行双向分析, 用适当的统计软件进行统计分析。不同时间间隔的肽治疗组和对照组之间的差异被认为是对p< 0.05 的统计 significant。
4. 将获得的数据绘制为一个直方图, 该图显示所有样本组的单元格覆盖区域的百分比 ( vs选定的时间间隔)。

结果

本协议用于确定1-21 和 esc (1-21)-1 c 在表达功能 CFTR 的支气管上皮细胞的细胞迁移活动中的创面愈合效果。在这项试验中, 将培养物插入12井板的井中, 每个隔间都有3.5万个细胞 MEMg, 辅以10% 的血清。细胞在24小时之内到达了完全汇合, 然后产生了500微米的缝隙, 每个井都充满了含有不同浓度肽的 MEMg。实验重复了四次。如图 2所示, 在细胞单层中产生的伪?...

讨论

细胞迁移是许多生理和病理事件中必不可少的过程, 包括伤口愈合、胚胎发育和肿瘤转移。研究细胞迁移的基本过程体外涉及: (一) 建立细胞单层, (ii) 在细胞的汇合层内产生伪伤口, (iii) 在达到伤口闭合之前, 在不同时间间隔捕获图像。, 并 (iv) 对图像序列进行分析, 以量化所选细胞的迁移速度。

研究结果表明, 培养基的应用是定量评价细胞迁移特性的客观可靠的实验技?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimal essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0