הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

Abstract

מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.

Introduction

היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה¹. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים². לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר^{3, 4}. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים⁵. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול^6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)^9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.

כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה "הפצוע" מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס"מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה¹¹. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור "הפצוע" לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור "הפצוע" יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור¹².

בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.

בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) - 1c¹³, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)^14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון¹⁶. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)¹⁷ של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR^{12, 18} הוא דיווח.

לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.

Protocol

1. תא הכנה

1. זרע 2.5x10⁶ תאים 10 מ"ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ג/מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, בדוק המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
   הערה: התאים המשמשים את הניסוי הם מונצחים הסמפונות אפיתל תאי אדם transduced עם וקטור lentiviral היוועצות התנגדות puromycin. הם מבטאים stably תפקודית CFTR^14,15.
2. לאחר זרימה התאים הגיעה 90-100%, תשאף האמצעי הבקבוקון ואת למחוק אותו לתוך בקבוק פסולת תחת מחלקה בקבינט בטיחות ביולוגית II. לשטוף את התאים עם 6 מ של פוספט buffered מלוחים ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS). בעדינות סלע את הבקבוקון ידנית ולמחוק CMF-PBS.
   הערה: יש להיזהר לא לגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה.
3. להוסיף 10 מ ל- CMF-PBS, דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 10 דקות.
4. האחות CMF-PBS וזורקים אותו. לאחר מכן להוסיף 2 מ של טריפסין/EDTA הבקבוקון.
5. רוק בעדינות את הבקבוק, המאפשר את הפתרון לחלוטין את התאים ולאחר דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ 10 דקות עד התאים מנותקים בעליל תחת מיקרוסקופ.
   הערה: בסוף זמן הדגירה, התאים אמורה להופיע מעוגל, לא קשור משטח הפלסטיק. אם התאים נמצאים טוב מנותקת, עצבנות ידנית ייתכן שיהיה צורך.
6. להוסיף 10 מ של MEMg בתוספת 10% FBS בטל טריפסין ולאסוף את התאים ע י שטיפת החלק התחתון של הבקבוק. להעביר את עוצמת הקול לתוך צינור חרוטי 50 מ.
7. Centrifuge את הצינור עבור 5 דקות ב x 80 גרם.
8. וארוקן את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 6 מ של MEMg בתוספת 10% FBS. פיפטה שוב ושוב כדי לשבור את כל הגושים.
9. להוציא 10 µL של התא השעיה עם micropipette ולהזריק את אמצעי האחסון תחת הזכוכית המכסה בעבר לשים מעל תא Burker או Neubauer.
10. לספור את מספר התאים.

2. התא זריעה בתרבות מוסיף

1. ב כל טוב של צלחת 12-. טוב, העבר את תותב תרבות עם פינצטה סטרילי (איור 1). השתמש פינצטה כדי ללחוץ לאורך שולי מוסיף על מנת לתקן אותם על פני השטח של הצלחת.
   הערה: מוסיף יש התחתון דביק המאפשר הדבקה.

איור 1 : ייצוג סכמטי של התוספות תרבות סיליקון, מכניסים כראוי בארות של צלחת 12-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. כראוי לדלל התליה תא MEMg בתוספת 10% FBS. ממלאים כל תא של הקדמי µL 70 תא השעיה (על 3.5x10⁴ תאים/תא).
   הערה: הצפיפות של תאים המוחלת בכל תא תלוי בסוג של תאים. מומלץ להשתמש צפיפות תא שמוביל להשלים זרימה בתוך 24 שעות.
3. תחת המיקרוסקופ, בדוק כי תאים לא דולפים מן התאים הוספה דגירה לצלחת 12-ובכן במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%₂.

3. מדומים הפצע Assay הריפוי

1. לאחר דגירה, דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי נוצר תא confluent monolayers.
2. מחדש להשעות את מבחן תרכובות (למשל, מגברים) ב 1 מ"ל של MEMg.
   הערה: להכין טרי דילולים אמפר החל מהפתרון מניות המאוחסנים ב-20 ° C.
3. הסר בעדינות את המכסים על ידי פינצטה סטרילי. יש להיזהר לא לשבור את התא monolayers. להעביר את המכסים על נייר סופג.
   הערה: כדי להשתמש מחדש את המכסים אותו, לעקר אותם 70% אתנול במשך לפחות 3 שעות. מומלץ לזרוק אותם לאחר מכן.
4. כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, להוסיף 1 מ"ל של MEMg לכל שימוש טוב של micropipette. סגור את הצלחת, בעדינות לזעזע אותו.
   הערה: לא להוסיף בינוני ישירות מעל תא monolayers כדי למנוע הפרעה שלהם.
5. האחות המדיום ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של MEMg לכל טוב. לסגור את הצלחת והמחש את הפערים נטול תאים (שנוצרו על ידי התוספות) תחת המיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 4, מצוידים עם מצלמת וידיאו. לרכוש תמונות בזמן אפס (T0) ולשמור אותם בתבנית. jpg.
6. להסיר את המדיום מן הבארות, לשטוף אותם עם 1 מ"ל ל- PBS, למחוק אותו.
7. הוסף את תרכובות מבחן (להכין בשלב 3.2) הבארות. דגימות הבקרה אינו מטופל, הוסיפו 1 מ"ל של MEMg. דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%₂.
8. לאחר 15, 20, וטיפול 24 שעות, להתבונן על נדידת תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 4, לרכוש תמונות.
   הערה: במהלך שלב זה, לנסות ללכוד תמונות בהאזורים באשר T0. הבחירה של מרווחי זמן שבו נלכדים תמונות תלוי מהירות ההעברה של התא.
9. כדי לחקור את ההשפעה של כמה מעכבי סלקטיבית, כלומר AG1478, על נדידת תאים, תשאף המדיום של כל תא הוספה לפני הסרת מוסיף.
   1. לשטוף כל תא עם MEMg טריים ולמלא אותו 70 µL של MEMg בתוספת AG1478.
   2. לאחר 30 דקות של דגירה-37 ° C ו- 5% CO₂, המשך כמתואר מנקודת 3.3.
      הערה: במהלך שלב כביסה, רעלני של תאים monolayers עם מעכבי ספציפית, יש להיזהר לא להסיר את התוספות.

4. תמונות ניתוח

1. עם סיום הניסוי, בחר תמונות של הדגימות הייצוגי ביותר של הקבוצות השונות ניסיוני, וליצור קובץ zip המכיל תמונות יחיד ב- T0, T15, T20, T24 h.
   הערה: תמונות יחיד נלקחות במרווחי זמן נבחר עבור כל הדגימות. הפעל את triplicates עבור כל ניסוי, אשר חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים. בסוף, לקבוצות בכל ניסיוני, מינימום של 3 תמונות ("a", "b", "c", וכד', הנובע ניסוי עצמאית) בנקודת זמן כל מנותחות.
2. להעלות קובץ ה-zip לתוך התוכנה ניתוח תמונה אשר מספק באופן אוטומטי באמצעות דואר אלקטרוני קובץ סיכום הגיליון האלקטרוני המכילה את הנתונים ניסיוני של אזורים מכוסי תא, גירוד (באחוזים) בנקודות זמן נבחר.
   הערה: ההכרה בחוד החנית ואת אזור הפער מבוססת במידה רבה על שיטת זיהוי קצה (המכוון לזיהוי נקודות בו בהירות התמונה חדה משתנה).
3. לשמור את הנתונים ולאסוף אותם. לנרמל את כל הנתונים ביחס הערך הממוצע בזמן אפס. חישוב הערך הממוצע של הנתונים המנורמל של משכפל כל כל נקודת זמן, השגיאה הסטנדרטית היחסי (SEM). באמצעות ניתוח דו כיוונית השונות (ANOVA), לבצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנת הסטטיסטיקה נכונה. הבדלים בין קבוצות שטופלו פפטיד וקבוצות שליטה במרווחי זמן שונים נחשבים מבחינה סטטיסטית significant עבור p< 0.05.
4. להתוות נתונים המתקבלים גרף כמו היסטוגרמה, אשר מציג אחוז מכוסי תא שטח של כל מדגם קבוצות לעומת ממרווחי הזמן שנבחר.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) - 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך...

Discussion

נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimal essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0