Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.

Resumen

El objetivo de este trabajo es mostrar un nuevo método para evaluar la capacidad de algunas moléculas inmunomoduladoras, como péptidos antimicrobianos (AMPs), para estimular la migración celular. Lo importante, migración celular es un evento de limitación de velocidad durante el proceso de cicatrización para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión. La ventaja de este método sobre el análisis clásico, que se basa en un rasguño hecho manualmente en una monocapa de células, es que el uso de la cultura de silicona especial inserta proporcionando dos compartimientos para crear un campo de pseudo-herido libre con un ancho bien definido (500 μm ). Además, debido a una plataforma de análisis de imagen automatizado, es posible obtener rápidamente datos cuantitativos sobre la velocidad de la herida cierre y migración celular. Más precisamente, se mostrará el efecto de dos amplificadores de piel de rana en la migración de células epiteliales bronquiales. Además, el tratamiento previo de estas células con inhibidores específicos proporcionará información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a este tipo de eventos.

Introducción

En gran parte es conocido que la cicatrización de heridas en los animales es un proceso fundamental para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión¹. A pesar de superficies epiteliales expuestas al medio externo (por ejemplo, la piel, vías respiratoria y tracto gastrointestinal) forman una barrera protectora de insultos físicos y químicos, la formación de heridas puede ocurrir fácilmente, especialmente después cirugía o infecciones microbianas². Por ejemplo, la colonización del tejido pulmonar por el bacteriano patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, sobre todo en enfermos de fibrosis quística (FQ), lleva a daño del epitelio de las vías aéreas con la consecuente insuficiencia respiratoria^{3, 4}. La cicatrización es un mecanismo de reparación de host complejo para restaurar la arquitectura normal de un tejido lesionado⁵. Se caracteriza por la inflamación inicial, seguida de un período de regeneración abarca epithelialization, angiogénesis y remodelación tisular con la producción de colágeno y de la célula diferenciación^6,7,8 . Para asegurar la integridad epitelial y para controlar la proliferación microbiana, todos los organismos vivos producen moléculas de defensa, incluyendo péptidos antimicrobianos (AMPs)^9,10. El proceso de cicatrización es muy difícil simular en vitro debido a la falta de restos celulares y las interacciones complejas entre diferentes tipos de células. Sin embargo, la capacidad en vitro de un péptido para acelerar el cierre de una herida pseudo estimulando la migración de células epiteliales es indicativa de su capacidad para sanar un epitelio comprometido. De hecho, migración celular es un evento de limitación de velocidad en la cicatrización de heridas, y estudiar los factores que pueden afectar la migración celular ayudará a terapias objetivo para mejorar la cicatrización.

Aquí, un ensayo experimental altamente reproducible se proporciona basado en silicona especial cultura insertos para evaluar la migración de células in vitro. Se basa en la creación de un espacio μm 500 (pseudo-herida) sobre una monocapa celular confluente. Las células en el borde del campo artificial "herido" comenzará a migrar a la zona libre de células, formando nuevos contactos célula-célula. La inserción de la cultura representa una nueva herramienta para experimentos de cicatrización rápida. Se proporcionan dos depósitos separados por una pared μm 500, y pueden ser colocados correctamente en una placa de 3 cm plato o en el pozo de una placa de 12 pozos. Llena cada compartimiento del parte movible con una suspensión permite a las células crecer en cada área designada hasta confluencia, mientras que la extracción del inserto generará un espacio libre de células de aproximadamente 500 μm (el mismo ancho que el muro de separación). Un medio de cultivo celular adecuada complementado con un compuesto de prueba puede añadirse al plato placa/bien. Luego, el cierre de la brecha puede ser visualizado en diferentes intervalos de tiempo bajo un microscopio invertido, preferiblemente uno equipado con una cámara de vídeo para la adquisición de la imagen. Por último, medición de los cambios en el área de célula cubierta por el programa de análisis de imagen automatizado basado en web permite la cuantificación de la velocidad de la herida cierre y migración celular. En general, este método es un paso adelante en relación con el análisis clásico, donde un cero se hizo manualmente mediante la incisión de monocapas confluentes de células con una aguja estéril o pipeta tip¹¹. De hecho, el último procedimiento puede destruir el plástico inferior del plato placa/pozo y el revestimiento de la superficie, creando arrugas. Además, el área de "herido" no tiene un ancho bien definido a lo largo de toda la longitud de la brecha, como esto depende altamente de la presión aplicada por los investigadores a la punta de aguja. Además, las células desalojadas pueden formar cúmulos de células vivas y muertas en los bordes del scratch; por otra parte, la propagación de las células vivas en el área de "herido" puede interferir con la velocidad de migración de la célula, generando resultados no reproducibles¹².

Además, gracias a una plataforma de análisis de imagen cero, los usuarios pueden rápidamente recibir (en minutos) datos cuantitativos sobre el comportamiento migratorio de las celdas seleccionadas sin necesidad de adquirir software adicional. Esta plataforma es capaz de analizar imágenes de microscopía de contraste de fase de baja (~ 5 X), mediana (~ 10 X) y aumento alto (~ 20 X). Después de subir un archivo zip de imágenes (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, formato *.tiff) automáticamente se realizaron el análisis para generar un archivo de resumen que muestra el porcentaje de zonas cubiertas de células y zonas cero, así como la velocidad de la célula migración, a intervalos de tiempo distintos.

En este trabajo, mediante el uso de un amplificador-derivado de la piel de rana, es decir, Esc(1-21) y su diastereomer Esc(1-21) - 1 c¹³y una línea de células bronquiales expresando el funcional CF conductancia transmembrana (CFTR) del regulador^14,15, se proporciona un ejemplo de la migración celular inducida por el péptido en comparación con las muestras sin tratamiento (control). Tenga en cuenta que el epitelio de las vías respiratorias y el CFTR desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la función pulmonar y¹⁶de la reparación de la herida. Además, mediante inhibidores selectivos (por ejemplo, AG1478)¹⁷ de receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), evidencia que la migración de las células bronquiales inducida por los péptidos mencionados implica activación de EGFR^{12, 18} se divulga.

En Resumen, el objetivo de este procedimiento es mostrar cómo el uso de estos rellenos de silicona cultura representa un ensayo rápido y de fácil acceso para determinar con precisión la migración de células adherentes (p. ej., células epiteliales bronquiales) y molecular mecanismos que controlan este tipo de eventos.

Protocolo

1. preparación de la célula

1. Semilla de 2.5x10⁶ células en 10 mL del mínimo esencial Medium (MEM) suplementado con glutamina 2 mM (MEMg), más 10% de suero bovino fetal (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina y estreptomicina) y puromicina (0,5 μg/mL para la selección y mantenimiento de la línea de la célula) en un matraz T75. Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 2 días. Antes de comenzar el experimento, comprobar la confluencia de las células bajo un microscopio invertido.
   Nota: Las células utilizadas para el experimento son las células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas transduced con un vector lentivirales que confiere resistencia a puromicina. Estable expresan CFTR funcional^14,15.
2. Una vez alcanzada la confluencia de las células 90-100%, Aspire el medio del frasco y deséchela en una botella de residuos bajo una clase gabinete de seguridad biológica II. Lavar las células con 6 mL de tampón fosfato salino sin calcio y magnesio (CMF-PBS). Suavemente el matraz de la roca manualmente y deseche CMF-PBS.
   Nota: Tenga cuidado de no tocar la monocapa de células con la pipeta.
3. Añadir 10 mL de PBS de CMF e Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 10 minutos.
4. Aspire CMF-PBS y deséchela. Luego agregar 2 mL de tripsina/EDTA al matraz.
5. Muévalo suavemente el matraz, permitiendo que la solución completamente las células de la capa, y se Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 10 minutos hasta que las células son separadas visiblemente bajo el microscopio.
   Nota: Al final de la incubación, las células deben aparecen redondeados y no adheridos a la superficie de plástico. Si las células no están bien separadas, agitación manual puede ser necesario.
6. Añadir 10 mL de MEMg plus 10% FBS para inactivar tripsina y recoger las células por el fondo del matraz de lavado. Transferir el volumen a un tubo cónico de 50 mL.
7. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 80 x g.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de MEMg plus 10% FBS. Pipeta varias veces para dispersar cualquier grumos.
9. Extraiga 10 μl de suspensión celular con una micropipeta e inyectar el volumen bajo la cubierta de vidrio puesto anteriormente sobre una cámara de Bürker, Neubauer.
10. Contar el número de celular.

2. siembra en el cultivo de célula inserta

1. En cada pocillo de una placa de 12 pozos, transferencia de la inserción de la cultura con una pinza estéril (figura 1). Use pinzas para presionar a lo largo de los bordes de insertos para fijar a la superficie de la placa.
   Nota: Los insertos tienen un superficie inferior pegajoso que permite la adherencia.

Figura 1 : Representación esquemática de los insertos de silicona cultura, bien poner en pocillos de una placa de la pozo 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Diluir correctamente la suspensión celular en MEMg plus 10% FBS. Llene cada compartimento del parte movible con 70 μl de suspensión celular (aproximadamente 3.5x10⁴ células/cámara).
   Nota: La densidad de células en cada compartimiento depende del tipo de células. Se recomienda utilizar una densidad celular que conduce a completar la confluencia dentro de 24 h.
3. Bajo el microscopio, comprobar que las células no son fugas de los compartimentos de insertar e incuban la placa de la pozo de 12 por 24 h a 37 ° C y 5% CO₂.

3. pseudo-herida curativo ensayo

1. Después de la incubación visualizar las células bajo el microscopio invertido para verificar que se han formado las monocapas confluentes de células.
2. Vuelva a suspender los compuestos de prueba (e.g., amperios) en 1 mL de MEMg.
   Nota: Preparar frescas diluciones de AMPs a partir de la solución stock almacenada a-20 ° C.
3. Suavemente Quite los insertos pinzas estériles. Tenga cuidado de no romper las monocapas de células. La transferencia de los rellenos sobre papel absorbente.
   Nota: Para volver a usar los insertos de la misma, esterilizarlas en etanol al 70% durante al menos 3 horas. Se recomienda desecharlos luego.
4. Para eliminar las células no adherentes, añadir 1 mL de MEMg por bien utilizando una micropipeta. Cerrar la placa y suavemente la roca.
   Nota: No agregue medio directamente sobre monocapas de células para evitar su interrupción.
5. Aspire el medio y sustituirlo con 1 mL de MEMg por pozo. Cerrar la placa y visualizar los espacios acelulares (creados por los insertos) bajo el microscopio invertido con 4 aumentos, equipada con una cámara de vídeo. Adquisición de imágenes en el tiempo cero (T0) y guardarlas en formato jpg.
6. Retire el medio de los pozos de lavado con 1 mL de PBS y deséchela.
7. Agregue los compuestos de prueba (preparados en el punto 3.2) a los pocillos. Para las muestras control sin tratar, añadir 1 mL de MEMg. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO₂.
8. Después de 15, 20 y 24 h tratamiento, observar la migración de la célula al microscopio con aumentos de 4 y adquirir imágenes.
   Nota: Durante este paso, trata de plasmar imágenes en las mismas áreas en cuanto a T0. La elección de los intervalos de tiempo en el cual se capturan imágenes depende de la velocidad de migración celular.
9. Para estudiar el efecto de algunos inhibidores selectivos, es decir, AG1478, en la migración celular, aspirar el medio de cada compartimiento de inserción antes de quitar partes movibles.
   1. Lavado de cada compartimento con MEMg fresco y llenar con 70 μl de MEMg suplementado con AG1478.
   2. Después de 30 min de incubación a 37 ° C y 5% CO₂, proceda como se describe desde el punto 3.3.
      Nota: Durante el paso de lavado y tratamiento previo de monocapas de células con los inhibidores específicos, tenga cuidado de no quitar los insertos.

4. Análisis de la imagen

1. Al finalizar el experimento, seleccionar imágenes de las muestras más representativas de los diferentes grupos experimentales y crear un archivo zip que contiene imágenes en h T0, T15, T20 y T24.
   Nota: Imágenes estan tomadas a intervalos de tiempo seleccionados para todas las muestras. Ejecute triplicados para cada experimento, que se repite al menos tres veces. Al final, para grupos todo experimentales, un mínimo de 3 imágenes ("a", "b", "c", etc., derivadas de cada experimento independiente) en cada momento son analizados.
2. Subir el archivo zip en el software de análisis de imagen que proporciona automáticamente por correo electrónico un archivo Resumen de hoja de cálculo que contiene los datos experimentales de áreas cubiertas de la célula y del rasguño (en porcentaje) en los puntos de tiempo seleccionado.
   Nota: El reconocimiento de la vanguardia y el gap se basa en el método de detección de borde (dirigido a identificar los puntos en que el brillo de la imagen cambia abruptamente).
3. Guardar los datos y recogerlos. Normalizar todos los datos con respecto al valor promedio en el tiempo cero. Calcular el valor promedio de los datos normalizados de todas las repeticiones en cada punto del tiempo y el error estándar relativo (SEM). Mediante el uso de dos vías de análisis de varianza (ANOVA), realizar análisis estadísticos con un software estadístico apropiado. Diferencias entre los grupos tratados con péptido y grupos de control en diferentes intervalos de tiempo son consideradas estadísticamente significativa para un p< 0.05.
4. Representar los datos obtenidos en un gráfico como un histograma, que muestra el porcentaje de área cubierta de la célula de todos muestra grupos versus los intervalos de tiempo seleccionados.

Resultados

Este protocolo se utilizó para determinar el efecto de Esc(1-21) y Esc(1-21) - 1 c en términos de actividad de la migración celular inducida en las células epiteliales bronquiales expresando la CFTR funcional de cicatrización. En este ensayo, cultura insertos fueron colocadas en los pocillos de una placa de 12 pozos, y cada compartimiento fue sembrado con 35.000 células en MEMg suplementado con 10% FBS. Las células alcanzaron confluencia completa dentro de 24 horas después, se gen...

Discusión

Migración celular es un proceso esencial en muchos eventos fisiológicos y patológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y metástasis del cáncer. El procedimiento básico para el estudio de la migración de la célula en vitro implica: (i) la creación de una monocapa de células, (ii) la producción de una pseudo-herida en la capa confluente de células, (iii) la captura de imágenes en diferentes intervalos de tiempo hasta que la herida cierre se alcanza y (iv) el análisis d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0