Un romanzo In Vitro ferita guarigione test per valutare la migrazione cellulare

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'effetto dei peptidi sulla migrazione di cellule epiteliali bronchiali. Questo metodo consente l'ottenimento rapido e altamente riproducibile di dati quantitativi sulla velocità di chiusura della ferita e migrazione cellulare.

Abstract

Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare un nuovo metodo per valutare la capacità di alcune molecole di immunomodulatori, quali peptidi antimicrobici (amp), per stimolare la migrazione cellulare. D'importanza, migrazione delle cellule è un evento limitante durante il processo di guarigione della ferita per ristabilire l'integrità e la funzione normale di strati di tessuto dopo la ferita. Il vantaggio di questo metodo oltre l'analisi classica, che si basa su un graffio fatto manualmente in un monostrato di cellule, è che l'utilizzo della cultura di silicone speciale inserisce fornendo due scomparti per creare un campo di pseudo-ferito senza cellula con una larghezza ben definita (500 μm ). Inoltre, a causa di una piattaforma di analisi di immagine automatizzato, è possibile ottenere rapidamente i dati quantitativi sulla velocità di migrazione delle cellule e la chiusura della ferita. Più precisamente, verrà mostrato l'effetto di due amplificatori di pelle di rana sulla migrazione di cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, il pretrattamento di queste cellule con inibitori specifici fornirà informazioni sui meccanismi molecolari alla base di tali eventi.

Introduzione

È ampiamente noto che la guarigione arrotolata negli animali è un processo fondamentale per ristabilire l'integrità e la funzione normale di strati di tessuto dopo lesioni¹. Nonostante le superfici epiteliali esposte all'ambiente esterno (ad es., pelle, vie respiratorie e tratti gastrointestinali) formano una barriera protettiva dagli insulti chimici e fisici, la formazione di ferite può facilmente verificarsi, soprattutto dopo chirurgia o infezioni microbiche². Ad esempio, la colonizzazione del tessuto polmonare di agente patogeno batterico opportunistico Pseudomonas aeruginosa, soprattutto in chi soffre di fibrosi cistica (CF), porta a danni dell'epitelio airways con conseguente insufficienza respiratoria^{3, 4}. La guarigione della ferita è un meccanismo di riparazione complessi host per ripristinare la normale architettura di un tessuto danneggiato⁵. È caratterizzata da infiammazione iniziale, seguita da un periodo di rigenerazione che comprende epithelialization, angiogenesi e rimodellamento tissutale con la produzione di collagene e cellule differenziazione^6,7,8 . Per garantire l'integrità epiteliale e per controllare la proliferazione microbica, tutti gli organismi viventi producono molecole di difesa, tra cui peptidi antimicrobici (amp)^9,10. Il processo di guarigione della ferita è molto difficile da simulare in vitro a causa della mancanza di detriti cellulari e delle complesse interazioni tra diversi tipi di cellule. Tuttavia, la capacità in vitro di un peptide di accelerare la chiusura di una pseudo-ferita di stimolando la migrazione delle cellule epiteliali è indicativa della sua capacità di guarire un epitelio compromesso. Infatti, migrazione delle cellule è un evento di tasso-di limitazione nella guarigione delle ferite, e studiare i fattori che possono influenzare la migrazione cellulare vi aiuterà a terapie target per una migliore cicatrizzazione.

Qui, un'analisi sperimentale altamente riproducibile viene fornita in base su inserti in silicone speciale cultura per valutare di migrazione delle cellule in vitro. Si basa sulla creazione di un 500 μm gap (pseudo-ferita) su un monostrato di cellule confluenti. Le cellule al bordo del campo artificiale "ferito" inizierà la migrazione nell'area senza cellula, formando nuovi contatti cellula-cellula. L'inserto di cultura rappresenta un nuovo strumento per esperimenti di cicatrizzazione veloce. Sono forniti due serbatoi separati da una parete di 500 μm, e possono essere inseriti correttamente in una piastra di 3 cm piatto o nel pozzetto di una piastra 12-pozzetti. Ogni vano dell'inserto di riempimento con una sospensione cellulare permette alle cellule di crescere in ogni area designata fino alla confluenza, mentre la rimozione dell'inserto e concernente un gap pulito privo di cella di circa 500 μm (la stessa larghezza come il muro di separazione). Un mezzo di coltura cellulare adeguata completato con un composto in esame può essere quindi aggiunto nel piatto piatto/pozzetto. In seguito, la chiusura del divario possa essere visualizzata a intervalli di tempo differenti sotto un microscopio invertito, preferibilmente uno dotato di una videocamera per acquisizione di immagini. Misurazione delle variazioni nella zona cella-coperti dal programma di analisi di immagine automatizzata basata su web consentirà, infine, la quantificazione della velocità di migrazione delle cellule e la chiusura della ferita. Nel complesso, questo metodo è un passo avanti per quanto riguarda il dosaggio classico, dove un graffio fatta manualmente dal pungere monostrati confluenti di cellule umane con un ago sterile o una pipetta¹¹suggerimento. Infatti, l'ultima procedura può distruggere il fondo in plastica del piatto piatto/pozzetto ed il rivestimento di superficie, creando le rughe. Inoltre, l'area "ferito" non ha una larghezza ben definita lungo l'intera lunghezza del gap, come questo altamente dipende dalla pressione applicata dai ricercatori alla punta dell'ago. Inoltre, le cellule sloggiate possono formare grumi di cellule vive e morte ai bordi del graffio; Inoltre, la diffusione delle cellule viventi nell'area "ferito" può interferire con la velocità della migrazione cellulare, generando risultati non riproducibili¹².

Inoltre, grazie ad una piattaforma di analisi di immagine gratta e Vinci, gli utenti possono rapidamente ricevere (in minuti) dati quantitativi sul comportamento migratorio delle celle selezionate senza la necessità di acquisizione di software aggiuntivo. Questa piattaforma è in grado di analizzare le immagini di microscopia di contrasto di fase di bassa (~ 5 X), media (~ 10x) e alto (~ 20 X) ingrandimento. Dopo aver caricato un file zip di immagini (in *. jpg, *. jpeg, *.jp2, *. png, *. gif, formato TIFF) l'analisi è condotta automaticamente per generare un file di riepilogo che mostra la percentuale di zone coperte di cella e di aree gratta e Vinci, così come la velocità della cella migrazione, a intervalli di tempo distinti.

In questo lavoro, utilizzando un Rana-pelle AMP-derivato, cioè Esc(1-21) e relativo diastereomer Esc(1-21) - 1C¹³e una linea di cellule bronchiali esprimendo il funzionale CF conduttanza transmembrana regolatore (CFTR)^14,15, viene fornito un esempio di migrazione cellulare indotta da peptide in confronto con campioni non trattati (controllo). Si noti che l'epitelio delle vie aeree e la CFTR gioca un ruolo cruciale nel mantenimento della funzione polmonare e la ferita riparazione¹⁶. Inoltre, per mezzo di inibitori selettivi (ad es., AG1478)¹⁷ del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), prova che la migrazione di cellule bronchiali indotta dai peptidi di cui sopra comporta l'attivazione di EGFR^{12, 18} è segnalato.

In sintesi, l'obiettivo di questa procedura è di dimostrare come l'utilizzo di tali inserti di cultura in silicone rappresenta un'analisi veloce e facilmente accessibile per determinare con precisione la migrazione di cellule aderenti (ad es., cellule epiteliali bronchiali) e molecolare meccanismi di controllo di tali eventi.

Protocollo

1. cella preparazione

1. Semi 2.5x10⁶ celle in 10 mL di minimo essenziale medio (MEM) completato con glutamina 2mm (MEMg), più 10% siero bovino fetale (FBS), antibiotici (0,1 mg/mL di penicillina e streptomicina) e con puromicina (0,5 µ g/mL per la selezione e la manutenzione dei linea cellulare) in un matraccio da T75. Incubare la beuta a 37 ° C e 5% CO₂ per 2 giorni. Prima di iniziare l'esperimento, verifica la confluenza delle cellule sotto un microscopio invertito.
   Nota: Le celle utilizzate per l'esperimento sono cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate trasformate con un vettore lentivirale che conferiscono resistenza agli con puromicina. Essi esprimono stabilmente un funzionale CFTR^14,15.
2. Una volta che ha raggiunto la confluenza delle cellule 90-100%, aspirare il mezzo dal pallone e gettarlo in una bottiglia dei rifiuti nell'ambito di una classe di armadio di sicurezza biologica II. Lavare le cellule con 6 mL di tampone fosfato salino senza calcio e magnesio (CMF-PBS). Delicatamente la boccetta della roccia manualmente ed eliminare CMF-PBS.
   Nota: Fare attenzione a non toccare il monostrato cellulare con la pipetta.
3. Aggiungere 10 mL di PBS CMF e incubare la beuta a 37 ° C e 5% di CO₂ per 10 min.
4. CMF-PBS di aspirare ed eliminare. Quindi aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA al pallone.
5. Scuotere delicatamente il matraccio, lasciare che la soluzione completamente ricoprire le cellule ed incubare la beuta a 37 ° C e 5% di CO₂ per 10 min, fino a quando le cellule sono visibilmente staccate sotto un microscopio.
   Nota: Al termine del tempo di incubazione, le cellule dovrebbero apparire arrotondato e non attaccato alla superficie plastica. Se le cellule non sono ben staccate, agitazione manuale può essere necessario.
6. Aggiungere 10 mL di MEMg maggiorato del 10% FBS per inattivare tripsina e raccogliere le cellule lavando il fondo del pallone. Trasferire il volume in una provetta conica 50 mL.
7. Centrifugare la provetta per 5 min a 80 x g.
8. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 6 mL di MEMg plus 10% FBS. Pipettare ripetutamente per eliminare eventuali grumi.
9. Prendere 10 µ l di sospensione cellulare con una micropipetta e iniettare il volume sotto il vetro di copertura precedentemente messo sopra una camera di Burker o Neubauer.
10. Contare il numero di cellulare.

2. semina nella coltura cellulare inserti

1. In ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti, trasferire l'inserto di cultura con pinzette sterili (Figura 1). Utilizzare una pinzetta per premere lungo i bordi di inserti per ripararli alla superficie della piastra.
   Nota: Gli inserti hanno un lato appiccicoso che permette l'adesione.

Figura 1 : Rappresentazione schematica degli inserti in silicone cultura, correttamente messo in pozzetti di una piastra 12-pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Diluire correttamente la sospensione cellulare in MEMg maggiorato del 10% FBS. Riempire ogni scomparto dell'inserto con 70 µ l di sospensione cellulare (circa 3.5x10⁴ cellule/camera).
   Nota: La densità delle cellule applicata in ogni compartimento dipende dal tipo delle cellule. Si consiglia di utilizzare una densità delle cellule che conduce per completare confluenza entro 24 h.
3. Sotto il microscopio, verifica che le cellule non sono perdite dai comparti inserto e incubare la piastra 12-pozzetti per 24 h a 37 ° C e 5% CO₂.

3. pseudo-ferita guarigione Assay

1. Dopo l'incubazione, visualizzare le cellule al microscopio invertito per verificare che sono stati formati strati monomolecolari della cellula confluenti.
2. Risospendere le sostanze da testare (ad es., AMPs) in 1 mL di MEMg.
   Nota: Preparare diluizioni di AMPs freschi a partire dalla soluzione stock conservata a-20 ° C.
3. Rimuovere delicatamente gli inserti di pinzette sterili. Fare attenzione a non rompere i monostrati di cellule umane. Trasferire gli inserti sulla carta assorbente.
   Nota: Per riutilizzare gli stessi inserti, sterilizzarli in etanolo al 70% per almeno 3 ore. Si consiglia di buttarli via in seguito.
4. Per rimuovere le cellule non-aderenti, aggiungere 1 mL di MEMg al bene utilizzando una micropipetta. Chiudere la piastra e scuoterla delicatamente.
   Nota: Non aggiungere il terreno direttamente sulla cima di monostrati di cellule umane per evitare il loro malfunzionamento.
5. Aspirare il mezzo e sostituirlo con 1 mL di MEMg per bene. Chiudere la piastra e visualizzare le lacune senza cellula (create dagli inserti) sotto il microscopio invertito con un ingrandimento 4x, dotato di una videocamera. Acquisire immagini a tempo zero (T0) e salvarli in formato. jpg.
6. Rimuovere il supporto dai pozzi, lavarli con 1 mL di PBS e scartarla.
7. Aggiungere le sostanze da testare (preparati al punto 3.2) ai pozzetti. Per i campioni di controllo non trattato, aggiungere 1 mL di MEMg. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO₂.
8. Dopo 15, 20 e 24 trattamenti di h, osservare la migrazione delle cellule sotto il microscopio con un ingrandimento 4x e acquisire immagini.
   Nota: Durante questo passaggio, tenta di catturare immagini nelle stesse zone per quanto riguarda T0. La scelta di intervalli di tempo in cui le immagini sono acquisite dipende dalla velocità di migrazione delle cellule.
9. Per studiare l'effetto di alcuni inibitori selettivi, cioè AG1478, sulla migrazione cellulare, aspirare il mezzo da ogni alloggiamento prima di rimuovere inserti.
   1. Lavare ogni vano con MEMg fresco e riempirlo con 70 µ l di MEMg completati con AG1478.
   2. Dopo 30 min di incubazione a 37 ° C e 5% CO₂, procedere come descritto dal punto 3.3.
      Nota: Durante la fase di lavaggio e di pretrattamento di monostrati di cellule umane con inibitori specifici, fare attenzione a non rimuovere gli inserti.

4. image Analysis

1. Al termine dell'esperimento, selezionare le immagini dei campioni più rappresentativi dei vari gruppi sperimentali e creare un file zip contenente immagini singole a T0, T15, T20 e T24 h.
   Nota: Le singole immagini sono presi intervalli di tempo selezionati per tutti i campioni. Eseguire triplici copie per ogni esperimento, che viene ripetuto almeno tre volte. Alla fine, per gruppi tutti sperimentali, un minimo di 3 immagini ("a", "b", "c", ecc., derivanti da ogni esperimento indipendente) in ogni punto del tempo vengono analizzati.
2. Caricare il file zip nel software di analisi di immagine che fornisce automaticamente via e-mail un file di foglio di calcolo di riepilogo contenente i dati sperimentali delle zone rivestite in cella e gratta e Vinci (come percentuale) presso i punti di tempo selezionato.
   Nota: Il riconoscimento della leading edge e la zona di gap è in gran parte basato su metodo di rilevamento del bordo (volto a identificare i punti in cui la luminosità dell'immagine cambia bruscamente).
3. Salvare i dati e raccoglierli. Normalizzare tutti i dati per quanto riguarda il valore medio a tempo zero. Calcolare il valore medio dei dati normalizzati di tutte le repliche a ogni punto del tempo e l'errore standard relativo (SEM). Mediante analisi della varianza (ANOVA) bidirezionale, effettuare analisi statistiche, con un software di statistiche adeguate. Differenze tra gruppi di peptide-trattati e controllo a diversi intervalli di tempo sono considerate essere statisticamente significativo per una p< 0.05.
4. Tracciare i dati ottenuti in un grafico come un istogramma che mostra la percentuale di area delle cellule di tutti i campione gruppi contro gli intervalli di tempo selezionati.

Risultati

Questo protocollo è stato usato per determinare l'effetto di Esc(1-21) ed Esc(1-21) - 1C in termini di attività di migrazione delle cellule indotto in cellule epiteliali bronchiali che esprimono la proteina CFTR funzionale di cicatrizzazione. In questo saggio, inserti di cultura sono stati collocati nei pozzetti di una piastra 12-pozzetti, e ogni scomparto è stato seminato con 35.000 cellule in MEMg supplementato con 10% FBS. Le cellule raggiunto confluenza completa entro 24 h. in segu...

Discussione

Migrazione delle cellule è un processo essenziale in molti eventi fisiologici e patologici, tra cui la guarigione della ferita, lo sviluppo embrionale e metastasi del cancro. La procedura di base per studiare la migrazione delle cellule in vitro comporta: (i) la creazione di un monostrato di cellule, (ii) la produzione di una pseudo-ferita nello strato confluente di cellule, (iii) l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo diversi fino a quando ferita chiusura viene raggiunto e (iv) l'analisi della sequen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0