상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

요약

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

초록

이 작품의 목표는 일부 immunomodulatory 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어) 셀 마이그레이션 자극 등의 능력을 평가 하는 새로운 방법을 보여줍니다. 중요 한 것은, 셀 마이그레이션은 속도 제한 이벤트를 조직 계층의 일반 기능과 무결성 손상 후 상처 치유 과정. 셀 단층에서 수동으로 만든된 스크래치에 기반은, 고전적인 분석 결과,이 방법의 장점은 특별 한 실리콘 문화의 사용 삽입 필드를 만드는 한 셀-무료 의사 상처 잘 정의 된 폭 (500 μ m 2 개의 구획을 제공 하는 ). 또한, 자동된 이미지 분석 플랫폼으로 그것은 빠르게 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도에 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 더 정확 하 게, 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 두 개구리 피부 앰프의 효과가 표시 됩니다. 또한, 특정 억제제와 이러한 셀의 전처리 등 기본 분자 메커니즘에 정보를 제공 합니다.

서문

동물에서 상처 치유 하는 것이 부상¹무결성 및 조직 층의 정상 기능을 다시 설정 하는 기본 프로세스는 크게 알려져 있습니다. 물리적, 화학적 모욕에서 보호 장벽을 형성 상피 표면 외부 환경 (예를 들어, 호흡기, 피부 및 위장 책자)에 노출에 불구 하 고, 상처의 형성 수 있습니다 쉽게 발생 하는, 특히 후 수술 또는 미생물 감염². 예를 들어, 기회 주의 세균성 병원 체 녹 농 균, 특히 낭 성 섬유 증 (CF) 환자에에서 의해 폐 조직의 식민 이끌어 낸다 필연적인 호흡^{3, 기도 상피 세포의 손상 4}. 상처 치유 부상된 조직⁵의 정상적인 구조를 복원 하는 복잡 한 호스트 복구 메커니즘입니다. 그것은 초기 염증, 포괄 epithelialization, 신생, 콜라겐 생산 및 세포 분화^{6,7,8 개장 하는 조직 재생 기간 다음에 의해 특징} . 상피의 무결성을 보장 하 고 미생물 증식 제어 모든 살아있는 유기 체 방어 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어)^9,10를 포함 하 여 생산. 상처 치유 과정은 체 외에서 세포 파편 및 다른 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 부족으로 인해 시뮬레이션 하기 매우 어렵습니다. 그러나, 생체 외에서 의 능력 펩 티 드를 자극 하 여 의사는 상처의 폐쇄를 가속 상피 세포의 손상 된 상피 세포를 치유 하는 능력의 지표입니다. 실제로, 셀 마이그레이션 상처 치유, 속도 제한 이벤트 이며 향상 된 상처 치유에 대 한 대상 치료에 도움이 될 것입니다 공부 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 요인.

여기, 높은 재현성 실험 분석 결과 셀 마이그레이션 시험관을 평가 하기 위해 특수 실리콘 문화 삽입에 따라 제공 됩니다. 그것은 500 μ m 간격 (의사 상처)에 confluent 셀 단층의 생성을 기반으로 합니다. 인공 "상처" 필드의 가장자리에 셀 셀 없는 지역으로 이주, 새로운 셀 연락처 형성 시작 됩니다. 문화 삽입 빠른 상처 치유 실험을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 500 μ m 벽으로 구분 된 두 개의 저수지 제공 됩니다, 그리고 그들이 배치 될 수 있습니다 제대로 3 cm 접시 접시 또는 12-잘 접시의 우물에서. 세포 현 탁 액으로 삽입의 각 구획을 작성 하면서 삽입의 제거 (분리 벽으로 동일한 폭) 약 500 μ m의 깨끗 한 셀 프리 갭 생기게 됩니다 합류까지 각 지정 된 지역에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 보충 시험 화합물과 적절 한 세포 배양 접시에 다음 추가할 수 접시/잘. 나중에, 간격 폐쇄는 거꾸로 한 현미경, 이미지 수집에 대 한 비디오 카메라를 갖춘 선호 하나에서 다른 시간 간격 구상 될 수 있다. 마지막으로, 웹 기반 자동화 이미지 분석 프로그램에 의해 셀 적용 지역에 있는 변화의 측정 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도의 정량화를 허용할 것 이다. 전반적으로,이 방법은 고아 한 분석 결과, 스크래치를 무 균 바늘 confluent 셀 monolayers incising에 의해 수동으로 이루어집니다 또는 한 피 펫 팁¹¹에 관하여 앞으로 단계입니다. 실제로, 마지막 절차 접시의 플라스틱 바닥을 파괴할 수 있는 플레이트/잘 하 고 주름을 만드는 표면 코팅. 또한, "상처" 지역은 없습니다, 간격의 전체 길이 따라 잘 정의 된 폭이 매우 바늘/팁에 연구원에 의해 적용 된 압력에 따라 달라 집니다. 또한, 빠질된 셀 스크래치;의 가장자리에서 생존 및 죽은 세포의 덩어리를 형성할 수 있다 또한, "상처" 영역으로 살아있는 세포의 확산 방해할 수 있습니다 세포 이동, 재현할 수 없는 결과¹²생성의 속도.

또한, 스크래치 이미지 분석 플랫폼 덕분에 사용자 빠르게 받을 수 (분) 이내 추가 소프트웨어를 습득의 필요성 없이 선택한 셀의 철새 행동에 양적 데이터. 이 플랫폼은 낮은 (~ 5 배)의 위상 대비 현미경 이미지, 중간 (~ 10 배), 및 높은 (~ 20 X) 확대 분석 가능 하다. Zip 파일 (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 형식)에서 이미지의 업로드 후 분석 자동으로 실시 셀 적용 지역 및 스크래치 영역 비율 뿐만 아니라 셀의 속도 보여 주는 요약 파일을 생성 하려면 마이그레이션, 고유 시간 간격입니다.

개구리 피부 앰프-파생, 즉 Esc(1-21) 및 그것의 diastereomer Esc(1-21)-1 c¹³및 표현 기능 CF 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)^14,15, 기관지 세포 라인을 사용 하 여이 작품에 치료 (제어) 샘플에 비해 펩타이드-유도 된 세포 이동의 예로 제공 됩니다. 기도 상피 세포 및 CFTR 폐 기능을 유지 하는 중요 한 역할을 재생 및 수리¹⁶상처. 또한, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 상기 펩 티 드에 의해 유도 된 기관지 세포의 마이그레이션 EGFR^{12의 활성화를 포함 하는 증거의 선택적 억제제 (예, AG1478)17 에 의하여 18} 보고 됩니다.

요약 하자면,이 절차의 목표는 어떻게 이러한 실리콘 문화 삽입 사용 정확 하 게 부착 세포 (예를 들어, 기관지 상피 세포)와 분자의 결정을 신속 하 고 쉽게 접근할 수 있는 분석 결과 나타냅니다 표시 이러한 이벤트를 제어 하는 메커니즘.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 항생제 (0.1 mg/mL 페니실린과 스의), 그리고 puromycin 플러스 2.5x10⁶ 셀 10 mL의 최소 필수 매체 (MEM) 2mm 글루타민 (MEMg), 보충에 씨앗 (0.5 µ g/l로 선택 및 유지 보수는 셀 라인) T75 플라스 크에. 2 일 동안 37 ° C, 5% CO₂ 플라스 크를 품 어. 시작 하기 전에 실험, 거꾸로 현미경 세포의 합류를 확인 하십시오.
   참고: 실험을 위해 사용 하는 셀 불멸 하 게 인간의 기관지 상피 세포 lentiviral 벡터 puromycin 저항을 부여로 불리고 있습니다. 그들은 안정적으로 기능적인 CFTR^14,15를 표현 한다.
2. 세포의 합류에는 90-100%에 도달 했습니다, 일단 플라스 크에서 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 폐 병으로 그것을 폐기. 6 mL의 인산 염 버퍼와 셀 씻어 염 분 칼슘 및 마그네슘 (CMF-PBS) 없이. 부드럽게 플라스 크를 수동으로 바위와 CMF PBS를 삭제.
   참고:을 피펫으로와 셀 단층을 건드리지 않도록 주의 해야 합니다.
3. CMF PBS의 10 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 플라스 크를 품 어.
4. CMF PBS를 발음 하 고 그것을 폐기. 플라스 크에 트립 신/EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
5. 부드럽게 바위 플라스 크, 셀, 코트 고 셀은 가시 현미경으로 분리 될 때까지 10 분 동안 37 ° C, 5% CO₂ 플라스 크를 품 어 완전히 솔루션을 허용.
   참고: 보육 시간의 끝에, 셀 둥근 및 플라스틱 표면에 얽매이지 않는 표시 됩니다. 셀 잘 분리 된 경우, 수동 동요 필요할 수 있습니다.
6. MEMg 플러스 10%의 10 mL을 추가 FBS 트립 신을 비활성화 하 고 플라스 크의 하단을 세척 하 여 세포를 수집. 원뿔 50 mL 튜브에 볼륨을 전송.
7. 80 x g에 5 분 동안 튜브 원심
8. 상쾌한 발음 하 고 다시 6 ml MEMg 플러스 10%의 세포를 중단 FBS. 반복적으로 어떤 덩어리 헤어 플라스틱.
9. 10 µ L는 micropipette와 셀 서 스 펜 션의 밖으로가 고 이전 Burker 또는 Neubauer 챔버에 넣어 커버 유리 아래 볼륨을 주입.
10. 휴대폰 번호를 계산 합니다.

2. 세포는 문화에서 시드 삽입

1. 에 12-잘 접시의 각 잘 멸 균 핀셋 (그림 1)으로 문화 삽입 전송. 핀셋을 사용 하 여 격판덮개의 표면에 그들을 해결 하기 위해 삽입 가장자리를 따라 누릅니다.
   참고: 삽입 스티커 밑면 접착 수 있다.

그림 1 : 12-잘 접시의 우물에 넣어 제대로 실리콘 문화 삽입의 도식 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 제대로 MEMg 플러스 10%에 세포 현 탁 액을 희석 FBS. (약 실/3.5x10⁴ 셀) 셀 서 스 펜 션의 70 µ L로 삽입의 각 구획을 채우십시오.
   참고: 각 구획에 적용 하는 셀의 밀도 세포의 종류에 따라 다릅니다. 합류 24 시간 이내 완료 리드 셀 밀도 사용 하는 것이 좋습니다.
3. 현미경, 셀 삽입 구획에서 유출 되지 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 24 h에 대 한 12-잘 접시를 품 어 확인 합니다.

3. 가짜 상처 치유 분석 결과

1. 부 화, 후 confluent 셀 monolayers 형성 되었습니다 확인 하는 거꾸로 한 현미경 아래 셀을 시각화.
2. 다시 MEMg의 1 mL에 테스트 화합물 (예를 들어, 앰프)를 일시 중단 합니다.
   참고:-20 ° c.에 저장 된 재고 솔루션에서 시작 하는 신선한 앰프 희석 준비
3. 부드럽게 멸 균 핀셋으로 삽입을 제거 합니다. 수 셀 monolayers 휴식 하지 않도록 주의 하십시오. 흡수 성 종이에 삽입 전송.
   참고: 다시 사용 하려면 동일한 삽입, 소독 그들 적어도 3 h 70% 에탄올에. 이후에 멀리 그들을 던져 하는 것이 좋습니다.
4. 비 부착 한 세포를 제거 하는 micropipette를 사용 하 여 잘 당 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 접시를 닫고 부드럽게 바위.
   참고: 팬 들은 그들의 혼란을 피하기 위해 셀 monolayers 위에 직접 매체의 정보를 추가 하지 마십시오.
5. 매체를 발음 하 고 잘 당 MEMg의 1 mL와 함께 그것을 대체. 접시를 닫고 비디오 카메라를 갖춘 4 배 확대에 거꾸로 현미경 (삽입 하 여 만든) 셀 무료 간격을 시각화 합니다. 이미지에서 시간 0 (T0)을.jpg 형식으로 그들을 저장 합니다.
6. 우물에서 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS와 함께 그들을 씻어 버리십시오.
7. 우물에 테스트 화합물 (포인트 3.2에서 준비)를 추가 합니다. 치료 컨트롤 샘플에 대 한 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂접시를 품 어.
8. 15, 20, 24 h 치료 후 셀 마이그레이션에 4 배 확대 현미경을 관찰 하 고 이미지.
   참고:이 단계 동안 T0에 관해서는 동일한 지역에서 이미지를 캡처 하려고 합니다. 셀 이동 속도에 따라 이미지 캡처됩니다 시간 간격 선택 합니다.
9. 공부 하 고 몇 가지 선택적 저 해제의 효과, 즉 AG1478, 셀 마이그레이션에 삽입을 제거 하기 전에 각 삽입 구획에서 중간 발음.
   1. 신선한 MEMg과 각 구획을 세척 하 고 MEMg AG1478와 보충의 70 µ L로 그것을 채우십시오.
   2. 37 ° C, 5% CO₂에서 외피의 30 분 후 포인트 3.3에서에서 설명 된 대로 진행 합니다.
      참고: 세척 단계 및 특정 억제제와 셀 monolayers의 전처리 하는 동안 수 삽입을 제거 하지 않도록 주의 하십시오.

4. 이미지 분석

1. 완료 되 면 실험, 다양 한 실험적인 그룹의 가장 대표적인 샘플의 이미지를 선택 하 고 T0, T15, T20, 및 T24 h에 단일 이미지를 포함 하는 zip 파일을 만듭니다.
   참고: 단일 이미지 모든 샘플에 대 한 선택한 시간 간격에서가지고 간다. 세 번 이상 반복 되는 각 실험에 대 한 triplicates를 실행 합니다. 끝에서 모든 실험 그룹, 최소 3 이미지 ("a", "b", "c", 등등, 각각 독립적인 실험에서 파생)에 대 한 각 시간 지점에서 분석 된다.
2. 자동으로 선택한 시간 지점에서 (백분율로) 셀 적용 및 스크래치 영역의 실험 데이터를 포함 하는 스프레드시트 요약 파일 이메일로 제공 하는 이미지 분석 소프트웨어에 zip 파일을 업로드 합니다.
   참고: 앞 가장자리와 격차 인식 크게 기반 edge 검출 방식 (포인트는 이미지 밝기 급격히 변경 식별 목적).
3. 데이터를 저장 하 고 그들을 수집 합니다. 시간 0에 평균 값에 따라 모든 데이터를 정상화. 상대 표준 오차 (SEM) 각 시간 지점에서 모든 복제의 정규화 된 데이터의 평균 값을 계산 합니다. 양방향 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어와 통계 분석을 수행 합니다. 펩 티 드 처리 그룹 및 다른 시간 간격 제어 그룹 사이 다름 간주 됩니다 통계적으로 p에 대 한 significant < 0.05.
4. 선택한 시간 간격 모든 샘플 그룹 대 의 셀 적용 영역의 비율을 표시 한 히스토그램으로 얻은 데이터 그래프에 플롯 합니다.

결과

이 프로토콜은 상처 치유 기능 CFTR 표현 하는 기관지 상피 세포에서 유도 된 세포 마이그레이션 활동 측면에서 Esc(1-21)와 Esc(1-21)-1 c의 효과 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 결과에서 문화 삽입 12-잘 접시의 우물에 배치 하 고 각 구획은 MEMg 10% 보충에 35000 셀 시드 FBS. 셀 24 h. 이내 완벽 한 합류를 나중에 도달, 500 μ m 간격 생성 된 고 각 잘 다른 농도에서 펩 티 드를 포?...

토론

셀 마이그레이션 상처 치유, 배아 개발 및 암 전이 포함 하 여 많은 생리 적 및 병 적인 행사에 필수 과정입니다. 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 기본적인 절차는 포함 한다: (i) 세포 단층, (ii) 셀, confluent 계층에는 의사의 생산의 창조 (iii) 캡처 이미지 상처까지 여러 시간 간격의 폐쇄에 도달 그리고 (iv) 선택한 셀의 마이그레이션 속도 측정 하기 위해 이미지 시퀀스의 분석.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimal essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0