JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا المقال بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي وبناء مكتبة التسلسل الفائق من المواد دار النباتات بما في ذلك الإنقاذ من الحمض النووي استثنائية ذات النوعية الرديئة.

Abstract

العشبية مصدرا لا يقدر بثمن من المواد النباتية التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ويرتبط استخدام العينات دار النباتات مع عدد من التحديات بما في ذلك عينة الحفاظ على نوعية والحمض النووي المتدهورة والمدمرة لأخذ العينات من عينات نادرة. من أجل استخدام أكثر فعالية المواد دار النباتات في المشاريع الكبيرة التسلسل، هناك حاجة إلى طريقة يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتطوير لإعداد مكتبة وعزل الحمض النووي. وتبين هذه الورقة بروتوكول قوية، وبداية لنهاية للحمض النووي والعزلة والفائق مكتبة البناء من عينات دار النباتات التي لا تحتاج إلى تعديل لعينات الأفراد. هذا البروتوكول مصمم خصيصا لتدني نوعية المجفف مصنع المواد وتحيط الاستفادة من الأساليب القائمة عن طريق تحسين طحن الأنسجة وتعديل التحديد حجم المكتبة، وإدخال خطوة ريمبليفيكيشن اختياري لمكتبات منخفضة الغلة. ريمبليفيكيشن مكتبات الحمض النووي منخفضة الغلة يمكن إنقاذ العينات المستمدة من عينات دار النباتات لا يمكن الاستغناء عنه، ويحتمل أن تكون قيمة، يلغي الحاجة إلى أخذ العينات الإضافية المدمرة ودون إدخال التحيز تسلسل واضح للمشترك تطبيقات النشوء والتطور. البروتوكول قد تم اختباره على مئات الأنواع العشب، ولكن من المتوقع أن تكون قابلة للتكيف للاستخدام في السلالات النباتية الأخرى بعد التحقق. هذا البروتوكول يمكن أن تكون محدودة بالحمض النووي المتدهورة جداً، حيث لا توجد شظايا في نطاق الحجم المطلوب، ونواتج الأيض الثانوية الموجودة في بعض المواد النباتية التي تحول دون عزل الحمض النووي نظيفة. وعموما، يدخل هذا البروتوكول طريقة سريعة وشاملة تسمح بعزل الحمض النووي وإعداد مكتبة العينات 24 في أقل من 13 h, مع فقط 8 ح وقت العملي النشط مع الحد الأدنى من التعديلات.

Introduction

مجموعات دار النباتات مصدر يحتمل أن تكون قيمة الأنواع والتنوع الجينومي للدراسات بما في ذلك السلالات1،2،3،4،علم الوراثة السكانية5، الحفظ علم الأحياء6والأنواع الغازية البيولوجيا7سمة تطور8. ويسلط الضوء على إمكانية الحصول على مجموعة متنوعة غنية من الأنواع، والسكان، والمواقع الجغرافية، والنقاط الزمنية "الكنز"9 هو دار النباتات. تاريخيا، طبيعة الحمض النووي المستمدة من دار النباتات المتدهورة قد أعاق المشاريع المستندة إلى بكر، محيلة الباحثين غالباً باستخدام علامات فقط وجدت في نسخة عالية، مثل مناطق الجينوم بلاستيدات الخضراء أو مباعدة يدون الداخلية (البحث عن) ريبوسومال الجيش الملكي النيبالي. نوعية العينات والحمض النووي تختلف على نطاق واسع على أساليب المحافظة على9،10، مع فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل وتجزئة من الحرارة المستخدمة في عملية التجفيف يجري الأشكال الأكثر شيوعاً من الأضرار، وخلق ما يسمى 90% الحمض النووي إقفال التي قد شغلت الدراسات المستندة إلى بكر11. وبصرف النظر عن التجزؤ، المسألة الثانية الأكثر انتشارا في دار النباتات علم الجينوم هو التلوث، مثل التي تستمد من الفطريات اندوفيتيك13 أو الفطريات المكتسبة بعد الوفاة بعد جمع ولكن قبل تصاعد في دار النباتات12، على الرغم هذه المشكلة يمكن حلها بيوينفورماتيكالي نظراً لقاعدة حق فطري (انظر أدناه). مشكلة الثالثة، وأقل شيوعاً، تعديل تسلسل عن طريق السيتوزين deamination (C/G→T/A)14، على الرغم من أنه يقدر أن تكون منخفضة (~ 0.03 ٪) في دار النباتات العينات11. مع ظهور التسلسل الفائق (HTS)، يمكن التغلب على مسألة التجزؤ مع القراءات قصيرة وتسلسل عمق12،15، مما يتيح الحصول على البيانات الجينومية مستوى من عينات عديدة ذات جودة منخفضة الحمض النووي، وحتى في بعض الأحيان السماح تسلسل الجينوم كله15.

أصبحت أكثر كثيرا ما تستخدم عينات دار النباتات وهي من أكبر مكونات المشاريع النشوء والتطور16. تحدي الحالي لاستخدام العينات دار النباتات ل HTS هو استمرار الحصول على كافية مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، شرطا لازما لتسلسل البروتوكولات، من العديد من الأنواع في الوقت المناسب، دون الحاجة إلى تحسين أساليب للفرد العينات. في هذه الورقة، هو أثبت بروتوكول لاستخراج الحمض النووي وإعداد مكتبة دار النباتات عينات من أن يستفيد من الأساليب القائمة، وتقوم بتعديلها للسماح لنتائج سريعة وقابلة للتكرار. يسمح هذا الأسلوب لإكمال تجهيز من العينة إلى مكتبة عينات 24 في ح 13، مع وقت التدريب العملي على ح 8، أو ح 16، مع مرور الوقت العملي ح 9، عندما يكون مطلوباً الخطوة ريمبليفيكيشن الاختياري. المعالجة المتزامنة للمزيد من نماذج قابلة للتحقيق، على الرغم من عاملاً يحد من قدرة أجهزة الطرد المركزي، والمهارات التقنية. البروتوكول يهدف إلى تتطلب فقط نموذجي معدات المختبرات (ثيرموسيكلير وأجهزة الطرد المركزي، وتقف المغناطيسية) بدلاً من المعدات المتخصصة، مثل البخاخات أو سونيكاتور، أو لقص الحمض النووي.

نوعية الحمض النووي وحجم الشظايا والكمية تحد من عوامل لاستخدام العينات دار النباتات في تجارب التسلسل الفائق. وسائل أخرى لعزل الحمض النووي دار النباتات وإنشاء مكتبات التسلسل الفائق أثبتت جدوى استخدام أقل من 10 نانوغرام من16من الحمض النووي؛ إلا أنها تتطلب تجريبيا تحديد العدد الأمثل من بكر دورات اللازمة لإعداد المكتبة. يصبح هذا غير عملي عند التعامل مع كميات صغيرة للغاية من مزدوجة قابلة للحياة تقطعت الحمض النووي (dsDNA)، كما تنتج بعض العينات دار النباتات إلا ما يكفي الحمض النووي لإعداد مكتبة واحدة. يستخدم الأسلوب المقدمة هنا عدد واحد من الدورات بغض النظر عن نوعية العينة، حيث يتم فقدان لا الحمض النووي في مكتبة الأمثل الخطوات. بدلاً من ذلك، يتم استدعاء خطوة ريمبليفيكيشن عند المكتبات لا تفي الحد الأدنى من المبالغ اللازمة للتسلسل. العديد من دار النباتات عينات نادرة وحيازة المواد قليلة مما يجعل من الصعب تبرير أخذ العينات المدمرة في كثير من الحالات. ولمواجهة ذلك، يسمح البروتوكول المقدم دسدنا إدخال أحجام أقل من 1.25 نغ في عملية إعداد مكتبة، وتوسيع نطاق نماذج قابلة للتطبيق للتسلسل الفائق، والتقليل من الحاجة إلى أخذ العينات المدمرة للعينات.

وقد الأمثل للأعشاب البروتوكول التالي واختبارها على مئات أنواع المختلفة من عينات دار النباتات، على الرغم من أننا نتوقع أن البروتوكول يمكن أن تطبق على العديد من المجموعات النباتية الأخرى. وهو يشمل خطوة انتعاش اختيارية التي يمكن استخدامها لتوفير جودة منخفضة و/أو عينات نادرة. استناداً إلى ما يزيد على مائتي دار النباتات عينات اختبار، يعمل هذا البروتوكول على العينات مع إدخال الأنسجة منخفضة ونوعية، مما يسمح للحفاظ على عينات نادرة من خلال أخذ العينات المدمرة الحد الأدنى. ويتضح هنا أن هذا البروتوكول يمكن أن توفر مكتبات ذات جودة عالية والتي يمكن أن تكون متسلسلة للمشاريع المستندة إلى فيلوجينوميكس.

Protocol

1-وقبل أن ابدأ

  1. جعل سيتيل الطازجة تريميثيلامونيوم بروميد (كتاب) العازلة17 بإضافة 20 غراما كتاب، 10 غم من بوفيدون (حماية الأصناف النباتية) 40، مل 100.0 1 م تريس pH 8.0، 40 مل من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) pH 8.0، مل 280.0 5 "م كلوريد الصوديوم"، ومل 400.0 من المياه الكاشف معا، وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 لتر باستخدام الكاشف الصف المياه. قم بضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
    ملاحظة: يمكن إضافة الكواشف الإضافية لكتاب تبعاً للمركبات الثانوية في الأصناف الفردية. انظر الين et al. 18 للحصول على قائمة شاملة من الكواشف المضافة.
  2. إضافة 10 ميليلتر من β-mercaptoethanol الواحدة 5 مل من كتاب المخزن المؤقت.
    ملاحظة: هذا يمكن إعداده في دفعات من 50 مل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أسابيع.
    1. الحرارة الحل كتاب في حمام مائي 65 درجة مئوية.
  3. البرد ومدافع الهاون والمدقات في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  4. قم بتسمية 4 مجموعات من 2 × ن 2 مل أنابيب (حيث n = عدد العينات). وضع 1 مجموعة من الأنابيب المسماة على الجليد.
  5. الايزوبروبانول البرد على الجليد أو في ثلاجة-20 درجة مئوية.
  6. إزالة الخرز التثبيت عكسها (سبري) المرحلة الصلبة (انظر الجدول للمواد) من الثلاجة، والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة الغرفة (30 دقيقة على الأقل).
  7. تحضير الإيثانول 80%.
  8. تحديد العينات دار النباتات لاستخراج واسترجاع ~ 1 سم2أو 10 ملغ، الأنسجة في العينة، يفضل أن تكون أوراق المواد.

2. استخراج الحمض النووي

  1. طحن ~ 1 سم2 من الأنسجة دار النباتات المختارة باستخدام مدافع الهاون بريشيليد والمدقات. إضافة النتروجين السائل والرمال 30-50 مغ تعقيمها. طحن حتى الأنسجة يتحول إلى مسحوق ناعم.
    ملاحظة: 10 مغ أو الأنسجة أكثر من المرغوب فيه، ولكن أقل وعملت أيضا في بعض الحالات. عندما يتبخر النيتروجين السائل، إضافة المزيد حسب الحاجة حتى الأنسجة هو الأرض تماما. أسلوب مشترك آخر لتعطيل الخلايا والأنسجة هو استخدام الخافق حبة. ومع ذلك، وجدت هذا الأسلوب لا تعمل جيدا للعينات المستخدمة في هذه التجارب.
  2. نقل المسحوق المجمدة في اثنين من أنابيب 2 مل (إضافة أي أكثر من نصف الحجم في الأنبوب). إضافة 600 ميليلتر من الحارة كتاب الحل لكل أنبوبة ومزج الأنابيب جيدا بانعكاس وفورتيكسينج.
    ملاحظة: نظراً لكمية ونوعية المواد دار النباتات غالباً منخفضة، أداء عزل الحمض النووي في اثنين من التكرار يساعد على الحصول على مردود أعلى.
  3. احتضان هذه العينات في حمام مائي 65 درجة مئوية ح 1 – 1.5، فورتيكسينج كل 15 دقيقة.
  4. نقل عينات من أجهزة الطرد المركزي في 10,000 ز x للحد الأدنى 5 المادة طافية على مجموعة جديدة من أنابيب المسمى (~ 500 ميليلتر). تجاهل بيليه استخدام إجراء قياسي التخلص غير المكلورة.
  5. إضافة 4 ميليلتر رناسي-أ (10 مغ/مل) لكل أنبوبة ومزج بعكس أو بيبيتينج. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية في حمام كتلة أو الماء حرارة لمدة 15 دقيقة.
  6. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 500 ميليلتر) من خليط الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1 مجرد الأنابيب قد وصلت إلى درجة حرارة الغرفة. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً و/أو مع انعكاس. الأنابيب في س 12,000 ز 15 دقيقة لنقل الطبقة المائية (الطبقة العليا) إلى مجموعة جديدة من أجهزة الطرد المركزي المسمى أنابيب (~ 400 ميليلتر). تجاهل الطبقة العضوية في حاوية نفايات مكلورة.
    ملاحظة: الخطوة 2.6 يمكن أن تتكرر إذا كان من المتوقع كميات كبيرة من المركبات الثانوية في المواد النباتية.
  7. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 400 ميليلتر) من خليط الكحول كلوروفورم 24:1: إيسواميل. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً و/أو مع انعكاس. الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,000 ز عن 15 دقيقة نقل الطبقة المائية (الطبقة العليا) إلى مجموعة جديدة من أنابيب بريشيليد، المسمى (~ 300 ميليلتر). تجاهل الطبقة العضوية في حاوية نفايات مكلورة.
  8. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 300 ميليلتر) الايزوبروبانول بريشيليد وميليلتر 12 من خلات الصوديوم 2.5 م لكل أنبوبة. احتضان عينات من-20 درجة مئوية لمدة 30 – 60 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تمديد أوقات الاحتضان (حتى الحضانة بين عشية وضحاها)، ولكن ستنخفض جودة الحمض النووي يعد احتضان العينات.
  9. أخذ العينات من الثلاجة وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 12,000 س ز على 15 دقيقة إزالة وتجاهل المادة طافية بلطف دون إزعاج بيليه. أغسل بيليه بتعليق مع الإيثانول 70% الطازجة (حوالي 300 – 500 ميليلتر). لكل عينة الضعف، توطيد الكريات الفردية اثنين إلى واحد مع مرافقة الإيثانول.
    ملاحظة: العينات ينبغي أن تدمج في أنبوب واحد استخدام الإيثانول أولاً وثم المتابعة. فإنه ليس من الضروري أن يغسل كل عينة مع الإيثانول بشكل منفصل.
  10. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 12,000 س ز لأدنى 10 إزالة وتجاهل المادة طافية بلطف دون إزعاج بيليه. الهواء الجاف الكريات.
    ملاحظة: نماذج يمكن أن تجفف أسرع باستخدام كتلة حرارة جافة (لا تتجاوز 65 درجة مئوية). تأكد من أن العينات لا الإفراط الجاف، وهذا يمكن أن يقلل العائد النهائي للحمض النووي.
  11. تعليق الحمض النووي المعزولة في 50 ميليلتر 1 x الشركة المصرية للاتصالات. تخزن في الثلاجة-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو 4 درجات مئوية لاستخدامها في الأسبوع التالي.

3-مراقبة الجودة (مراقبة الجودة)

  1. تشغيل [اغروس] هلام لفحص الجودة.
    1. إعداد المخزن مؤقت تريس/بورات/يدتا (TBE) 1 x بإضافة قاعدة تريس ز 54 وحمض البوريك ز 27.5 يدتا ز 3.75 ملح ثنائي الصوديوم، يصل الحجم الإجمالي إلى 5 لتر باستخدام الكاشف الصف المياه.
    2. تعد من 1% [اغروس] هلام بإضافة [اغروس] ز 1 إلى 100 مل 1 x TBE. الميكروويف الحل حتى [اغروس] لا يكون مرئياً. إضافة 0.01 ٪ الحمض النووي جل وصمة عار (انظر الجدول للمواد). السماح لتبرد قارورة حتى تصبح دافئة عند لمسها. مزيج جيد من إثارة. صب [اغروس] في علبة جل والسماح لها الجلوس حتى أنه يتصلب.
    3. خلط 3 ميليلتر من عينة و 2 ميليلتر من المياه الصف الكاشف 1 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ. تحميل العينات في مصفوفة هلام، مشيراً إلى ترتيبها.
    4. تشغيل العينات لمدة 60 – 70 دقيقة في 60-70 ف صورة الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع التعرض الصحيح، والتركيز.
      ملاحظة: وجود عصابة واضحة عالية الوزن الجزيئي علامة على الحمض النووي ذات جودة عالية، بينما مسحات عادة ما تشير إلى تدهور الحمض النووي. هي تتحلل معظم دار النباتات العينات.
  2. تشغيل تحليل الكمي دسدنا (انظر الجدول للمواد) لتحديد كمية مزدوج تقطعت الحمض النووي.
    1. استخدام 2 ميليلتر من عينة للتحليل.
      ملاحظة: تخفيف غير مطلوبة للتحليل الكمي للمواد دار النباتات كما أنها تميل إلى أن تكون بمبالغ ضئيلة. بذلت المكتبات الناجحة من قدر ضئيل من 1.26 دسدنا مجموع نانوغرام من هذه الخطوة.

4-الحمض النووي القص

ملاحظة: هذا إصدار محسن من فراجمينتاسي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التجارية البروتوكول (انظر الجدول للمواد).

  1. مكان دسدنا تجزئة الإنزيم على الجليد بعد فورتيكسينج 3 ق.
  2. في أنبوب تفاعل المتسلسل (PCR) معقم 0.2 مل بوليميريز، عزل ميليلتر ميكس 1 – 16 الحمض النووي مع 2 ميليلتر من المصاحبة لتجزئة رد فعل المخزن المؤقت. جعل مجموع حجم ميليلتر 18 بإضافة نوكلاس المياه مجاناً. إضافة ميليلتر 2 إنزيم تجزئة دسدنا ودوامه الخليط ل 3 s.
    ملاحظة: يختلف مقدار الحمض النووي اللازمة تبعاً لتركيز الحمض النووي (هدف 200 نانوغرام مجموع في الأنبوب).
  3. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 8.5. قم بإضافة 5 ميليلتر يدتا 0.5 M للأنابيب.
    ملاحظة: تحتاج هذه الخطوة التي يتعين القيام بها في أقرب وقت هو فترة الحضانة على إنهاء رد فعل والحيلولة دون الإفراط قص عينات من الحمض النووي.

5-حبة تنظيف

  1. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج.
  2. إحضار الحجم الإجمالي للحمض النووي المنفصمة إلى 50 ميليلتر بإضافة 25 ميليلتر نوكلاس المياه مجاناً. إضافة ميليلتر 45 من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز (90% حجم) إلى 50 ميليلتر المنفصمة الحمض النووي ومزيج دقيق بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: إضافة الخرز في 90% حجم العينة الكلية هو القيام بإزالة أصغر من شظايا من الحمض النووي، غالباً ما دون 200 قاعدة أزواج.
  3. اسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس للحد الأدنى 5 بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز، كما أنها تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
  4. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع لها غطاء مفتوحة.
    ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
  5. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الحمض النووي من الخرز إلى 55 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
  6. سحب قبالة ميليلتر 52 من المادة طافية. تشغيل تحليل الكمي الحمض النووي على عينات للتحقق من الانتعاش وتركيز أولى أن يذهب إلى المكتبة الإعدادية.
    ملاحظة: بذلت المكتبات مع مجموع دسدنا تقدر بأقل من 1.25 نغ، في كل حالة ريمبليفيكيشن وأن كان المطلوب.

6-إعداد المكتبة

ملاحظة: هذا نسخة معدلة من مجموعة المكتبة متاحة تجارياً (انظر الجدول من مواد البروتوكول).

  1. نهاية الإعدادية
    1. إضافة 3 ميليلتر من اندونوكليسي والفوسفات المخلفات الإنزيمات وميليلتر 7 المصاحبة رد فعل المخزن المؤقت إلى 50 ميليلتر من الحمض النووي تنظيفها، والمنفصمة. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. وتدور هذه الأنابيب لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي 60 ميليلتر.
    2. وضع العينات في ثيرموسيكلير مع البرنامج التالي: 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية، 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تم تعيين غطاء دافئ إلى إيه سيفن فايف درجة مئوية
  2. ربط محول
    1. تمييع المحول حظيرة 25-50 (يعمل محول تركيز 0.6 – 0.3 ميكرومتر). إضافة 30 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط و 1 ميليلتر من ربط محسن ميليلتر 2.5 من محول لتسلسل قراءة قصيرة الفائق للأنابيب.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي 93.5 ميليلتر.
    2. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. وتدور هذه الأنابيب لإزالة الفقاعات. احتضان هذه الأنابيب في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. إضافة 3 ميليلتر من الخليط التجاري اليوراسيل DNA glycosylase (UDG) و "الثامن اندونوكليسي" جليكوسيلاسي لياز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) للأنابيب. التأكد من أن حجم مجموع 96.5 ميليلتر. مزيج دقيق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة باستخدام ثيرموسيكلير.
      ملاحظة: يجب تعيين الغطاء إلى إيه فور سيفن درجة مئوية. النسخة الأصلية للبروتوكول التجاري على اختيار حجم بعد الخطوة ربط محول، يليه تنظيف حبة كخطوة أخيرة. تبديل ترتيب الخطوات هذا البروتوكول، الذي يحقق زيادة الغلات، وينفذ اختيار الحجم كخطوة أخيرة.
  3. تنظيف لإزالة شظايا صغيرة والأنزيمات
    1. مجانسة الخرز المغناطيسية التي فورتيكسينج.
    2. إضافة ميليلتر 78 من حبات مغناطيسية سبري (حجم 80%)، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
      ملاحظة: إضافة الخرز في 80% حجم العينة الكلية هو القيام بإزالة شظايا أصغر من الحمض النووي، التي غالباً ما تكون أقصر من 250 قاعدة أزواج. إزالة أكثر صرامة من شظايا صغيرة من الحمض النووي هو (ط) إزالة محولات الفائض (ثانيا) التشديد على تضخيم شظايا الكبيرة في الخطوات التالية.
    3. العينات احتضانها لأدنى 5 وضع الأنابيب في لوحة مغناطيسية للحد الأدنى 5 بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية يحتوي على الحمض النووي خارج نطاق الحجم المطلوب.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
    4. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع الغطاء مفتوحاً.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
    5. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الهدف الحمض النووي من الخرز بإضافة 17 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    6. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
    7. سحب قبالة ميليلتر 15 من المادة طافية.
  4. [بكر] تضخيم
    1. إضافة 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي PCR عالية الدقة و 5 ميليلتر من قراءة قصيرة الفائق تسلسل مكتبة الإعدادية 5 'التمهيدي 5 ميليلتر من تسلسل قراءة قصيرة الفائق المكتبة الإعدادية 3' التمهيدي، إلى 15 ميليلتر من تنظيفها متصلة محول الحمض النووي.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم إجمالي 50 ميليلتر.
    2. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج. وضع العينات في ثيرموسيكلير استخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 1: إعداد التضخيم ثيرموسيكلير.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى عدد كبير من الدورات بسبب انخفاض كمية الحمض النووي الإدخال.
دورة خطوةدرجة الحرارة.الوقتدورات
تمسخ الأولى98 درجة مئوية30 s1
تمسخ98 درجة مئوية10 s12
الصلب/ملحق65 درجة مئوية75 s12
التمديد النهائي65 درجة مئوية5 دقيقة1
عقد4 درجة مئوية

الجدول 1: بكر البروتوكول مرات تمسخ، والصلب، والإرشاد، ودرجات الحرارة- درجة الحرارة وأوقات كانت الأمثل الكواشف عرضت في هذا البروتوكول. إذا كان يتم تبديل الكواشف، ينبغي أن يكون الأمثل درجات الحرارة والأوقات مرة أخرى.

  1. اختيار حجم لحجم المكتبة المطلوبة
    ملاحظة: هذه الخطوة حبة سيزيل شظايا فوق وتحت نطاق الهدف على حد سواء.
    1. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج.
    2. إضافة 25 ميليلتر (المجلد 50 ٪) من درجة حرارة الغرفة المغناطيسي الخرز ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. اسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس للحد الأدنى 5 بعناية إزالة ونقل المادة طافية على مجموعة جديدة من أنابيب المسمى.
      ملاحظة: هذا الحجم يمكن تعديلها استناداً إلى حجم المكتبة المطلوبة. تحتوي المادة طافية على شظايا من الحمض النووي للحجم المطلوب. في الحضانة حبة الأول، ملزمة الخرز أكبر مكتبة شظايا. تتم إزالة هذه إلى التركيز على تلك الموجودة في نطاق 400 – 600 زوج قاعدي. وتتضمن المادة طافية أجزاء أصغر.
    3. إضافة 6 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز إلى المادة طافية ومزيج دقيق بيبيتينج صعودا وهبوطاً. العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا الحجم يمكن تعديلها استناداً إلى حجم المكتبة المطلوبة وفقا للخطوة 6.5.2.
    4. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي المطلوب. في الحضانة حبة الثاني، تقوم بربط الخرز شظايا تركت بعد إزالة الأولية من الحمض النووي أكبر عدد الأجزاء. هذه المجموعة من الشظايا عادة في نطاق الحجم المطلوب.
    5. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع الغطاء مفتوحاً.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
    6. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الهدف الحمض النووي من الخرز إلى 33 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    7. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة). سحب قبالة 30 ميليلتر من المادة طافية ونقل إلى أنابيب 2 مل (انظر الجدول للمواد) للتخزين.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المكتبات في ˚C-20 للتخزين على المدى الطويل.
  2. مراقبة الجودة
    1. تشغيل اختبار مراقبة الجودة على "مكتبات الحمض النووي". الرجوع إلى الخطوات 3.1 و 3.2.
      ملاحظة: لمكتبات الحمض النووي، تشغيل الجل ~ 45 دقيقة في 96 الخامس.
  3. مكتبة ريمبليفيكيشن: اختياري إذا كان مكتبة كمية غير كافية.
    ملاحظة: عينات مع مكتبة تركيزات أقل من 10 نانومتر ويمكن ريمبليفيد باستخدام الخطوات التالية. ريمبليفيكيشن مكتبات التركيز المنخفض يمكن تحقيق نتائج قابلة للتطبيق بالنسبة للتسلسل، ولكن ريمبليفيكيشن قد يسبب تحولاً متواضعة في تكوين قاعدة التنوع، على الرغم من أن جمع البيانات (الجدول 3) تشير إلى أن هذا الأمر لا يعتد بها لبعض المقاييس .
    1. تمييع الإشعال ريمبليفيكيشن العالمي 10 إضعاف استخدام 0.1 x TE.
    2. إضافة 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي PCR عالية الدقة و 5 ميليلتر من ريمبليفيكيشن العالمي المخفف التمهيدي 1 (آتجاتاكجكجاككاككجا) و 5 ميليلتر من ريمبليفيكيشن العالمي المخفف التمهيدي 2 (كاجكاجاجاكجكاتاكجا) إلى 15 ميليلتر من مكتبات التركيز المنخفض. ملاحظة: ينبغي أن يكون الحجم الإجمالي في 50 ميليلتر.
    3. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج. وضع العينات في ثيرموسيكلير استخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 1: إعداد التضخيم ثيرموسيكلير
      ملاحظة: هناك حاجة إلى عدد كبير من الدورات بسبب انخفاض كمية الحمض النووي الإدخال.
    4. تنظيف حبة
    5. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج. إضافة ميليلتر 45 من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز (حجم 90%)، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    6. واسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية لمدة 5 دقائق.
    7. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية يحتوي على الحمض النووي غير المرغوب فيه.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
    8. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، وبعد ذلك بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    9. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع لها غطاء مفتوحة.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الهدف الحمض النووي.
    10. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوتي الهدف الحمض النووي من الخرز إلى 33 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    11. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
    12. سحب قبالة 30 ميليلتر من المادة طافية. يمكن تخزينها في المكتبات في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  4. مراقبة الجودة
    1. تشغيل اختبار مراقبة الجودة على "مكتبات الحمض النووي". الرجوع إلى الخطوات 3.1 و 3.2. لمكتبات الحمض النووي، تشغيل الجل ~ 45 دقيقة في 96 الخامس.
      ملاحظة: إذا نظر إلى عصابة مزدوجة في الهلام، هذا المرجح نتيجة لاستنفاد التمهيدي من الخطوة ريمبليفيكيشن. يمكن إزالة العصابات بتكرار 6.9، ولكن باستخدام دورة واحدة فقط في البرنامج بكر المبينة في الجدول 1.

النتائج

عزل الحمض النووي والعائد النهائي من مكتبة
في هذه الدراسة، تجلى فعالية البروتوكول لعزل الحمض النووي دار النباتات والانتعاش لمكتبات تسلسل عالية الجودة باستخدام عينات مختلفة الخمسون مع أقدم من عام 1920 وأصغر من 2012 (الجدول 2). لكل عينة، تم استخدام حوالي 10 م?...

Discussion

البروتوكول المعروضة هنا طريقة شاملة وقوية لعزل الحمض النووي وتسلسل إعداد مكتبة من العينات النباتية المجففة. تناسق الأسلوب والحد الأدنى من الحاجة إلى تغيير على أساس جعل نوعية العينة أنها قابلة للتطوير للمشاريع الكبيرة التسلسل القائم على دار النباتات. إدراج خطوة ريمبليفيكيشن الاختياري ل?...

Disclosures

الكتاب يعلن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونحن نشكر تايلور أوبوتشون-الأكبر، تيشير الأردن، وزودوك كريستينا للمساعدة في جمع العينات العينات دار النباتات، وحديقة ميسوري للنباتات للحصول على عينات من دار النباتات لأخذ العينات المدمرة. وكان هذا العمل الدعم بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية" (ديب-1457748).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porcelain
Pestlefisher ScientificS02595porcelain
Centrifuge tubesfisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologiessee text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

References

  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  25. . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
  30. . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved