Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Resumo

Este artigo demonstra um protocolo detalhado para isolamento de DNA e construção de biblioteca de sequenciamento da elevado-produção de material de herbário, incluindo resgate de má qualidade excepcionalmente DNA.

Resumo

Herbários são uma fonte inestimável de materiais vegetais que podem ser usados em uma variedade de estudos biológicos. A utilização de espécimes de herbário é associada com um número de desafios, incluindo a qualidade de preservação de amostra, DNA degradado e amostragem destrutiva de espécimes raros. Para utilizar mais eficazmente o material de herbário em projetos de sequenciamento de grande, é necessário um método confiável e escalável de preparação de isolamento e biblioteca de DNA. Este artigo demonstra um protocolo robusto, início-a-ponta para DNA isolamento e elevado-throughput construção da biblioteca de amostras botânicas que não exige modificação para amostras individuais. Este protocolo é adaptado para planta baixa qualidade secada material e leva vantagem de métodos existentes através da otimização de moagem de tecido, modificando a seleção de tamanho de biblioteca e introduzindo um passo opcional reamplification para bibliotecas de baixo rendimento. Reamplification de bibliotecas de DNA de baixo rendimento pode salvar amostras provenientes de espécimes de herbário potencialmente valioso e insubstituível, eliminando a necessidade de amostragem destrutiva adicional e sem a introdução de viés de sequenciamento discernível para comum aplicações filogenéticas. O protocolo foi testado em centenas de espécies de gramíneas, mas é esperado para ser adaptável para o uso em outras linhagens de planta após verificação. Este protocolo pode ser limitado por DNA extremamente degradado, onde não existem fragmentos na faixa de tamanho desejado, e por metabólitos secundários presentes em alguns materiais vegetais que inibem limpo isolamento do DNA. Em geral, este protocolo introduz um método rápido e abrangente que permite o isolamento de DNA e preparação da biblioteca de 24 amostras em menos de 13 h, com apenas 8 h de tempo ativo de hands-on com modificações mínimas.

Introdução

Coleções de herbário são uma fonte potencialmente valiosa de espécies e diversidade genômica para estudos incluindo filogenética^1,2,3, genética de populações^4,5, conservação Biologia⁶, espécies invasoras biologia⁷e de evolução do traço⁸. A capacidade de obter uma rica diversidade de espécies, populações, localizações geográficas e pontos de tempo destaca o "tesouro"⁹ que é o herbário. Historicamente, a natureza degradada do herbário-derivada de ADN tem prejudicado projetos baseados em PCR, muitas vezes relegando pesquisadores usando apenas marcadores encontrados em cópia elevada, tais como regiões do genoma do cloroplasto ou do espaçador transcrito interno (ITS) do ribossômico RNA. Qualidade dos espécimes e DNA variam amplamente baseado em métodos de preservação^9,10, com quebras de dupla-hélice e fragmentação do calor usado no processo de secagem, sendo as formas mais comuns de danos, criando o so-called 90% DNA de lock-up que tem hipotecada estudos baseados em PCR¹¹. Além de fragmentação, a questão segundo mais prevalente no herbário genómica é contaminação, tais como que derivado de fungos endofíticos¹³ ou fungos adquiriram após a morte, após a colheita, mas antes de montar no herbário¹², embora Este problema pode ser resolvido bioinformatically dado do banco de dados bem fúngico (veja abaixo). Um terceiro e menos comum, o problema é a modificação de sequência a citosina desaminação (C/G→T/A)¹⁴, embora estima estar baixa (~ 0,03%) em espécimes de herbário¹¹. Com o advento do sequenciamento de alto rendimento (HTS), a questão da fragmentação pode ser superada com leituras curtas e sequenciamento profundidade^12,15, permitindo a aquisição de dados de nível de genômica de numerosos espécimes com baixa qualidade DNA e por vezes mesmo permitindo de sequenciamento do genoma inteiro¹⁵.

Amostras de herbário são cada vez mais frequentemente utilizadas e são um componente maior de projetos filogenética¹⁶. Um desafio atual da utilização de espécimes de herbário para HTS é consistentemente a obtenção suficiente DNA encalhado dobro, uma condição prévia necessária para protocolos de sequenciamento, de inúmeras espécies em tempo hábil, sem a necessidade de otimizar métodos para indivíduo espécimes. Neste trabalho, um protocolo para extração de DNA e preparação da biblioteca de espécimes de herbário é demonstrado que tira proveito dos métodos existentes e modifica-los para permitir resultados rápidos e replicáveis. Este método permite a completo de processamento de amostra para uma biblioteca de 24 amostras em 13 h, com tempo de hands-on de 8 h, ou 16 h, com tempo de hands-on 9 h, quando a etapa opcional reamplification é necessária. Processamento simultâneo de mais amostras é viável, embora o fator limitante é centrífuga capacidade e habilidade técnica. O protocolo é projetado para exigir apenas típico equipamento de laboratório (thermocycler, centrífuga e suportes magnéticos) em vez de equipamentos especializados, tais como um nebulizador ou sonicador, para a tosquia de DNA.

Qualidade de DNA, tamanho do fragmento e a quantidade estão limitando fatores para a utilização de espécimes de herbário em experimentos de sequenciamento de alto rendimento. Outros métodos para isolar o DNA de herbário e criar bibliotecas de sequenciamento de alta produtividade têm demonstrado a utilidade de usar tão pouco quanto 10 ng de DNA¹⁶; no entanto eles exigem experimentalmente determinando o número ideal de PCR ciclos necessários para a preparação de biblioteca. Isso se torna impraticável quando lidar com quantidades extremamente pequenas de duplo viável encalhado DNA (dsDNA), como alguns espécimes de herbário produzem DNA apenas suficiente para uma preparação única biblioteca. O método aqui apresentado usa um único número de ciclos, independentemente da qualidade da amostra, para que nenhum DNA é perdido em passos de otimização de biblioteca. Em vez disso, um passo de reamplification é invocado quando bibliotecas não respeitem os valores mínimos necessários para sequenciamento. Muitas amostras de herbário são raras e possuem pouco material, tornando-se difícil justificar a amostragem destrutiva em muitos casos. Para combater isso, o protocolo apresentado permite dsDNA entrada tamanhos menos de 1.25 ng para o processo de preparação de biblioteca, ampliando o escopo das amostras viáveis para alta produtividade de sequenciamento e minimizando a necessidade de amostragem destrutiva de espécimes.

O protocolo seguinte foi otimizado para gramíneas e testado em centenas de espécies diferentes de amostras de herbário, embora esperamos que o protocolo pode ser aplicado a muitos outros grupos de plantas. Ele inclui uma etapa de recuperação opcional que pode ser usada para salvar a baixa qualidade e/ou espécimes raros. Este protocolo baseado em mais de 200 espécimes de herbário testados, funciona em espécimes com tecido baixa entrada e qualidade, permitindo a preservação de espécimes raros através de amostragem destrutiva mínima. Aqui é mostrado que este protocolo pode fornecer bibliotecas de alta qualidade que podem ser sequenciadas para projetos baseados em phylogenomics.

Protocolo

1. antes de iniciar

1. Fazer fresco cetyl trimetilamónio brometo (CTAB) reserva¹⁷ adicionando 20g de CTAB, 10 g de polivinilpirrolidona (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL de pH 0,5 M de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 8.0, 280,0 mL 5 M NaCl e 400,0 mL de água reagente juntos e trazer o volume total de 1 L com grau reagente água. Ajuste o pH para 8,0.
   Nota: Reagentes adicionais podem ser adicionados a CTAB dependendo de compostos secundários individuais dos táxons. Ver Allen et al ¹⁸ para obter uma lista completa de reagentes aditivos.
2. Adicione 10 µ l de β-Mercaptoetanol por 5 mL de tampão CTAB.
   Nota: isso pode ser preparado em lotes de 50 mL e armazenado à temperatura ambiente por 3 – 4 semanas.
   1. Aquece a solução CTAB num banho de água de 65 ° C.
3. Fica frio, morteiros e macacos em-20 ° C pelo menos 20 min.
4. 4 conjuntos de 2 x n 2 mL de tubos de rotular (onde n = número de amostras). Colocar 1 jogo dos tubos etiquetados no gelo.
5. Fica frio isopropanol no gelo ou em um freezer-20 ° C.
6. Remover contas de imobilização reversível (SPRI) de fase sólida (ver Tabela de materiais) da geladeira e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente (pelo menos 30 min).
7. Prepare-se 80% de etanol.
8. Selecionar amostras botânicas para extração e recuperar ~ 1 cm²ou 10 mg, de tecido por espécime, de preferência material da folha.

2. extração de DNA

1. MOA ~ 1 cm² de tecido herbário pré-selecionadas usando macacos e morteiros prechilled. Adicione nitrogênio líquido e areia de 30 – 50 mg esterilizado. Triture até o tecido se transforma em pó fino.
   Nota: 10 mg ou mais tecido é desejável, mas menos também trabalhou em alguns casos. Uma vez que o nitrogênio líquido evapora, adicione mais conforme necessário até que tecido é totalmente moído. Um outro método comum para interromper as células e tecidos é o uso de um batedor do grânulo. No entanto, esse método foi encontrado para não funcionam bem para os espécimes utilizados nesses experimentos.
2. Transferi o pó congelado para dois tubos de 2 mL (adicionar não mais da metade do volume do tubo). Adicione 600 µ l de solução CTAB quente a cada tubo e misture os tubos completamente por inversão e num Vortex.
   Nota: Desde que a quantidade e a qualidade do material de herbário é muitas vezes baixa, realizar o isolamento do DNA em duas repetições ajuda a obter rendimentos mais elevados.
3. Incube as amostras em um banho de água de 65 ° C para 1-1.5 h, num Vortex cada 15 min.
4. Centrifugar as amostras a 10.000 x g, durante 5 min. Transfira o sobrenadante para um novo conjunto de tubos etiquetados (~ 500 µ l). Descarte a pelota usando um procedimento padrão de eliminação não clorados.
5. Adicionar 4 µ l de RNase-A (10 mg/mL) a cada tubo e misture por inversão ou pipetagem. Incube as amostras a 37 ° C em um banho de água ou bloco térmico por 15 min.
6. Adicione um volume igual (~ 500 µ l) de uma mistura de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio 25:24:1 uma vez que os tubos chegaram a temperatura ambiente. Misture bem, pipetando para cima e para baixo e/ou com inversão. Centrifuga os tubos a 12.000 x g durante 15 min. transferência a camada aquosa (camada superior) para um novo conjunto de tubos etiquetados (~ 400 µ l). Descarte a camada orgânica dentro de um contentor de resíduos clorado.
   Nota: Passo 2.6 pode ser repetido se esperam-se grandes quantidades de compostos secundários em planta.
7. Adicione um volume igual (~ 400 µ l) de uma mistura de álcool de 24:1. o clorofórmio: isoamílico. Misture bem, pipetando para cima e para baixo e/ou com inversão. Centrifuga os tubos a 12.000 x g durante 15 min. transferência a camada aquosa (camada superior) para um novo conjunto de tubos prechilled, etiquetados (~ 300 µ l). Descarte a camada orgânica dentro de um contentor de resíduos clorado.
8. Adicione um volume igual (~ 300 µ l) de isopropanol prechilled e 12 µ l de acetato de sódio 2,5 M para cada tubo. Incube as amostras a-20 º C por 30 a 60 min.
   Nota: Os tempos de incubação podem ser estendidos (até incubação durante a noite), mas a qualidade de DNA irá diminuir quanto mais incubam as amostras.
9. Leve as amostras fora do congelador e centrifugar os tubos a 12.000 x g, durante 15 min. remover e descartar o sobrenadante, suavemente, sem perturbar o sedimento. Lave o pellet por suspensão com etanol a 70% fresco (aproximadamente 300 – 500 µ l). Para cada amostra duplicada, consolide as duas pastilhas individuais em um com acompanhamento de etanol.
   Nota: As amostras devem ser consolidadas em um tubo utilizando etanol primeiro e prossiga. Não é necessário lavar cada amostra com etanol separadamente.
10. Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 10 min. remover e descartar o sobrenadante, suavemente, sem perturbar o sedimento. Ar seco as pelotas.
    Nota: As amostras podem ser secadas mais rápido usando um bloco de calor seco (não exceda 65 ° C). Certifique-se que as amostras não seque em demasiado, como isso pode diminuir o rendimento final do DNA.
11. Suspenda o DNA isolado em 50 µ l de TE 1x. Armazenar em freezer-20 ° C para armazenamento a longo prazo ou a 4 ° C, para uso na semana seguinte.

3. controle de qualidade (QC)

1. Execute um gel de agarose para verificação de qualidade.
   1. Prepare um buffer de Tris/borato/EDTA (TBE) 1x, acrescentando 54g Tris base, o ácido bórico 27,5 g e 3,75 g EDTA sal dissódico, trazendo o volume total de 5 L, usando água de grau reagente.
   2. Preparar um gel de agarose 1%, adicionando-se 1 g agarose para 100 mL de 1 x TBE. Microondas a solução até que nenhum agarose é visível. Adicionar 0,01% gel de ácido nucleico mancha (ver Tabela de materiais). Deixe arrefecer o balão até que está quente ao toque. Misture bem por agitação. Despeje uma bandeja de gel de agarose e deixe descansar até que ela se solidifica.
   3. Mix 3 µ l de amostra, 2 µ l de água de grau reagente e 1 µ l de 6 x tintura de carregamento. Carrega as amostras na matriz do gel, observando sua ordem.
   4. Execute os exemplos de 60 – 70 min a 60-70 V. imagem o gel sob luz UV com foco e exposição correta.
      Nota: A presença de uma banda clara de alto peso molecular é um sinal de DNA de alta qualidade, enquanto manchas geralmente indicam a degradação do DNA. A maioria dos espécimes de herbário são degradados.
2. Executar uma análise de quantificação de dsDNA (consulte tabela de materiais) para determinar a quantidade de double encalhado DNA.
   1. Use 2 µ l de amostra para análise.
      Nota: As diluições não são necessários para a análise de quantificação de material de herbário como eles tendem a ser em quantidades mínimas. Bibliotecas bem sucedidas foram feitas de tão pouco como 1.26 ng dsDNA total desta etapa.

4. o DNA de corte

Nota: Esta é uma versão otimizada de um comercial fragmentase double-stranded protocolo (consulte Tabela de materiais).

1. Enzima de fragmentação de dsDNA lugar no gelo após a utilização do Vortex para 3 s.
2. Em um tubo de reação em cadeia (PCR) de polimerase estéril 0,2 mL, mistura 1 – 16 µ l isolado DNA com 2 µ l de tampão de reação de fragmentação de acompanhamento. Trazer o volume total de 18 µ l, adicionando água livre de nuclease. Adicionar 2 µ l da enzima de fragmentação dsDNA e vortex mistura por 3 s.
   Nota: A quantidade de DNA necessária varia dependendo da concentração de DNA (objectivo para 200 total ng no tubo).
3. Incube as amostras a 37 ° C para 8,5 min. Em seguida, adicione 5 µ l de EDTA 0,5 M para os tubos.
   Nota: Este passo precisa ser executada assim que o período de incubação é sobre a encerrar a reação e impedir a excesso de corte de amostras de DNA.

5. grânulo limpar

1. Homogeneizar os grânulos SPRI vortexing.
2. Trazer o volume total do DNA cortado a 50 µ l, adicionando 25 µ l de água livre de nuclease. Adicione µ l 45 de grânulos SPRI temperatura (90% do volume) de 50 µ l de DNA cortado e a mistura completamente pipetando para cima e para baixo.
   Nota: Adicionar contas em 90% do volume total da amostra é feito para remover o menor dos fragmentos de ADN, muitas vezes abaixo de 200 pares de bases.
3. Deixe as amostras incubam por 5 min. Coloque os tubos num prato magnético e deixe-os descansar por 5 min. cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.
   Nota: Tenha cuidado para não perturbar as contas, pois eles contêm os alvos de DNA desejados.
4. Adicione 200 µ l de etanol fresco de 80% para os tubos enquanto estava no tribunal magnético. Incubar a temperatura ambiente por 30 s e então cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Repita este passo uma vez. Ar seco os grânulos por 5 min, enquanto o tubo é a depor magnético com a tampa aberta.
   Nota: Evite ressecamento os grânulos. Isso pode resultar em menor recuperação de ADN.
5. Retire os tubos do ímã. Eluir o DNA de grânulos em µ l 55 de 0.1 x et e homogeneiza pipetando para cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente por 5 min. tubos de lugar no stand magnético e esperar que a solução para transformar clara (~ 2 min).
6. Tire 52 µ l do sobrenadante. Execute uma análise de quantificação de DNA em amostras para verificar a recuperação e a concentração inicial que entra na preparação de biblioteca.
   Nota: As bibliotecas foram feitas com total dsDNA, estima-se que menos de 1.25 ng, embora em cada caso reamplification era necessário.

6. Biblioteca preparação

Nota: Esta é uma versão modificada de um kit biblioteca comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais protocolo).

1. Preparação final
   1. Adicione 3 µ l de endonuclease e fosfato seguindo as enzimas e 7 µ l de amortecedor da reação de acompanhamento de 50 µ l de DNA limpo, cortado. Homogeneiza pipetando para cima e para baixo. Gire os tubos para remover as bolhas.
      Nota: O volume total deve ser de 60 µ l.
   2. Colocar as amostras em um thermocycler com o seguinte programa: 30 min em 30 min a 65 ° C, 20 ° C, em seguida, mantenha a 4 ° C.
      Nota: A tampa aquecida foi definida como ≥75 ° C
2. Adaptador de ligadura
   1. Diluir o adaptador dobra de 25 – 50 (trabalhando a concentração de adaptador de 0,6-0,3 µM). Adicione 30 µ l do mix de mestre da ligadura, 1 µ l de potenciador da ligadura e 2,5 µ l de adaptador para sequenciamento de leitura curto de alta produtividade para os tubos.
      Nota: O volume total deve ser 93,5 µ l.
   2. Homogeneiza pipetando para cima e para baixo. Gire os tubos para remover as bolhas. Incube os tubos a 20 ° C por 15 min.
   3. Adicione 3 µ l da mistura comercial de uracil DNA glycosylase (UDG) e o DNA glycosylase-liase Endonuclease VIII (ver Tabela de materiais) para os tubos. Certifique-se de que o volume total é 96,5 µ l. homogeneizar e incubar a 37 ° C por 15 min, usando um thermocycler.
      Nota: A tampa deve ser definida como ≥47 ° C. A versão original do protocolo comercial tem seleção de tamanho após a etapa de ligadura do adaptador, seguida de uma limpeza do grânulo como etapa final. Este protocolo, que alcança rendimentos mais elevados, alterna a ordem dessas etapas e implementa seleção de tamanho como uma etapa final.
3. Limpeza para remover as enzimas e pequenos fragmentos
   1. Homogeneizar os grânulos magnéticos vortexing.
   2. Adicione µ l 78 de grânulos magnéticos de SPRI (80% do volume) e homogeneiza pipetando para cima e para baixo.
      Nota: Adicionar contas em 80% do volume total da amostra é feito para remover os fragmentos de DNA menores, que muitas vezes são inferiores a 250 pares de bases. A remoção mais rigorosa de pequenos fragmentos de DNA é (i) remover adaptadores excedentes e (ii) enfatizam a amplificação de fragmentos maiores nas etapas a seguir.
   3. Deixe que as amostras incubam durante 5 min. Coloque os tubos num prato magnético 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante que contém o DNA fora do intervalo do tamanho desejado.
      Nota: Tenha cuidado para não perturbar os grânulos que contêm os alvos de DNA desejados.
   4. Adicione 200 µ l de etanol fresco de 80% para os tubos enquanto estava no tribunal magnético. Incubar a temperatura ambiente por 30 s e então cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Repita este passo uma vez. Ar seco os grânulos por 5 min, enquanto o tubo é a depor magnético com a tampa aberta.
      Nota: Evite sobre os grânulos de secagem. Isso pode resultar em menor recuperação de ADN.
   5. Retire os tubos do ímã. Eluir o alvo do DNA da missanga adicionando 17 µ l de 0.1 x et e homogeneiza pipetando para cima e para baixo.
   6. Incubar a temperatura ambiente por 5 min. tubos de lugar no stand magnético e esperar que a solução para transformar clara (~ 2 min).
   7. Tire 15 µ l do sobrenadante.
4. Amplificação por PCR
   1. Adicione 25 µ l de mistura mestre de PCR de alta fidelidade, 5 µ l do elevado-throughput curta leitura biblioteca prep 5' da primeira demão de sequenciamento e 5 µ l de sequenciamento de leitura curto elevado-throughput biblioteca prep 3' primer, a 15 µ l do DNA limpo adaptador-ligados.
      Nota: O volume Total deve ser 50 µ l.
   2. Misture bem por num Vortex. Colocar as amostras em um thermocycler usando as configurações encontradas na tabela 1: configuração de amplificação Thermocycler.
      Nota: Um grande número de ciclos é necessária devido a baixa quantidade de DNA de entrada.

Etapa do ciclo	Temp.	Tempo	Ciclos de
Desnaturação inicial	98 ° C	30 s	1
Desnaturação	98 ° C	10 s	12
Recozimento/extensão	65 ° C	75 s	12
Extensão final	65 ° C	5 min	1
Segure	4 ° C

Tabela 1: protocolo de PCR desnaturação, recozimento e extensão de tempos e temperaturas. Temperatura e tempos foram otimizados para os reagentes apresentados no presente protocolo. Se os reagentes são alterados, temperaturas e tempos devem ser otimizados novamente.

5. Seleção de tamanho para o tamanho desejado da biblioteca
   Nota: Este passo do grânulo irá remover fragmentos acima e abaixo da faixa alvo.
   1. Homogeneizar os grânulos SPRI vortexing.
   2. Adicione 25 µ l (50% do volume) dos grânulos magnético de temperatura ambiente e homogeneizar pipetando para cima e para baixo. Deixe as amostras incubam por 5 min. Coloque os tubos num prato magnético e deixe-os descansar por 5 min. cuidadosamente remover e transferir o sobrenadante para um novo conjunto de tubos etiquetados.
      Nota: Este volume pode ser ajustado com base no tamanho da biblioteca desejada. O sobrenadante contém fragmentos do ADN do tamanho desejado. Na primeira incubação de grânulo, os grânulos são vinculativas fragmentos maiores de biblioteca. Estes são removidos para focalizar aqueles na faixa de 400-600 pares de base. O sobrenadante contém fragmentos menores.
   3. Adicione 6 µ l de grânulos SPRI de temperatura para o sobrenadante e misture completamente pipetando para cima e para baixo. Deixe que as amostras incubam por 5 min. Coloque os tubos num prato magnético e deixe-os descansar por 5 min.
      Nota: Este volume pode ser ajustado com base no tamanho da biblioteca desejada nos termos passo 6.5.2.
   4. Cuidadosamente, remover e descartar o sobrenadante.
      Nota: Tenha cuidado para não perturbar os grânulos que contêm o DNA desejado. Na segunda incubação do grânulo, os grânulos são vinculativas para os fragmentos que deixou após a remoção inicial do DNA maior fragmentos. Este conjunto de fragmentos é geralmente na faixa de tamanho desejado.
   5. Adicione 200 µ l de etanol fresco de 80% para os tubos enquanto estava no tribunal magnético. Incubar a temperatura ambiente por 30 s, então cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Repita. Ar seco os grânulos por 5 min, enquanto o tubo é a depor magnético com a tampa aberta.
      Nota: Evite ressecamento os grânulos. Isso pode resultar em menor recuperação de ADN.
   6. Retire os tubos do ímã. Eluir o alvo do DNA de grânulos em µ l 33 de 0.1 x et e homogeneiza pipetando para cima e para baixo.
   7. Incubar a temperatura ambiente por 5 min. tubos de lugar no stand magnético e esperar que a solução para transformar clara (~ 2 min). Retire 30 µ l do sobrenadante e transferência para tubos de 2 mL (ver Tabela de materiais) para armazenamento.
      Nota: As bibliotecas podem ser mantidas a-20 ˚ c para armazenamento a longo prazo.
6. Controle de qualidade
   1. Faça um teste de controle de qualidade sobre as bibliotecas de DNA. Consulte os passos 3.1 e 3.2.
      Nota: Para bibliotecas de DNA, execute o gel para ~ 45 min em 96 V.
7. Reamplification biblioteca: opcional, se a quantidade de biblioteca não é suficiente.
   Nota: Amostras com concentrações de biblioteca abaixo de 10 nM pode ser reamplified usando as seguintes etapas. Reamplification de bibliotecas de baixa concentração pode alcançar resultados praticáveis para sequenciamento, mas reamplification pode causar uma mudança modesta na diversidade de composição base, embora se reuniram dados (tabela 3) sugerem que isso é insignificante para determinadas métricas .
   1. Dilua os primers universal reamplification 10-fold usando 0.1 x TE.
   2. Adicione 25 µ l de mistura mestre de PCR de alta fidelidade, 5 µ l de primer reamplification universal diluído 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) e 5 µ l de primer reamplification universal diluído (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) de 2 a 15 µ l de bibliotecas de baixa concentração. Nota: O volume Total deve ser de 50 µ l.
   3. Misture bem por num Vortex. Colocar as amostras em um thermocycler usando as configurações encontradas na tabela 1: configuração de amplificação Thermocycler
      Nota: O grande número de ciclos é necessária devido à baixa quantidade de DNA de entrada.
   4. Limpeza do grânulo
   5. Homogeneizar os grânulos SPRI vortexing. Adicionar 45 µ l de grânulos SPRI temperatura (90% do volume) e homogeneiza pipetando para cima e para baixo.
   6. Deixe as amostras incubar durante 5 min. Coloque os tubos num prato magnético por 5 min.
   7. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante que contém o DNA indesejado.
      Nota: Tenha cuidado para não perturbar os grânulos que contêm os alvos de DNA desejados.
   8. Adicione 200 µ l de etanol fresco de 80% para os tubos enquanto estava no tribunal magnético. Incubar a temperatura ambiente por 30 s e então cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
   9. Ar seco os grânulos por 5 min, enquanto o tubo é a depor magnético com a tampa aberta.
      Nota: Evite ressecamento os grânulos. Isso pode resultar em menor recuperação do alvo de DNA.
   10. Retire os tubos do ímã. Eluir o alvo do DNA de grânulos em µ l 33 de 0.1 x et e homogeneiza pipetando para cima e para baixo.
   11. Incubar a temperatura ambiente por 5 min. tubos de lugar no stand magnético e esperar que a solução para transformar clara (~ 2 min).
   12. Retire 30 µ l do sobrenadante. As bibliotecas podem ser armazenadas a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
8. Controle de qualidade
   1. Faça um teste de controle de qualidade sobre as bibliotecas de DNA. Consulte os passos 3.1 e 3.2. Para bibliotecas de DNA, funcione o gel para ~ 45 min em 96 V.
      Nota: Se uma dupla banda é vista no gel, esta é provavelmente uma consequência do esgotamento da primeira demão da etapa reamplification. As bandas podem ser removidas por 6,9 de repetição, mas usando apenas um ciclo do programa de PCR descrita na tabela 1.

Resultados

Isolamento de DNA e o rendimento Final da biblioteca
Neste estudo, demonstrou-se a eficácia do protocolo para o isolamento do DNA de herbário e a recuperação das bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade usando 50 amostras diferentes com os mais antigos de 1920 e o mais novo a partir de 2012 (tabela 2). Para cada amostra, cerca de 10 mg de tecido foliar foi usado para isolamento de DNA. Tecido de folha verde foi favorecido, se disponível, e ...

Discussão

O protocolo aqui apresentado é um método abrangente e robusto para isolamento de DNA e sequenciamento de preparação da biblioteca de amostras de planta seca. A consistência do método e necessidade mínima de alterá-lo baseado em amostra qualidade fazer escalável para projetos de sequenciamento de grande baseada no herbário. A inclusão de uma etapa opcional reamplification para baixo rendimento bibliotecas permite a inclusão de baixa qualidade, baixa quantidade, rara ou historicamente importantes amostras que n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4452300	96 well
Gel Imaging System	Azure Biosystems	c300
Microfuge 20 Series	Beckman Coulter	B30137
Digital Dry Bath	Benchmark Scientific	BSH1001
Electrophoresis System	EasyCast	B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)	ELGA	89204-092
DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108078	2 ml
Mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Vortex-Genie 2	Fisher Scientific	12-812
Mortar	Fisher Scientific	S02591	porcelain
Pestle	fisher Scientific	S02595	porcelain
Centrifuge tubes	fisher Scientific	21-403-161
Microwave	Kenmore	405.7309231
Qubit Assay Tubes	Invitrogen	Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR	VWR	20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Balance	Mettler Toledo	PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage	Nalgene	F9401
Magnetic-Ring Stand	ThermoFisher Scientific	AM10050	96 well
Water Bath	VWR	89032-210
Hot Plate Stirrers	VWR	97042-754
Liquid Nitrogen	Airgas	UN1977
1 X TE Buffer	Ambion	AM9849	pH 8.0
CTAB	AMRESCO	0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL	AMRESCO	0482-200ML
Ribonuclease A	AMRESCO	E866-5ML	10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63882
Sodium Chloride	bio WORLD	705744
Isopropyl Alcohol	bio WORLD	40970004-1
Nuclease Free water	bio WORLD	42300012-2
Isoamyl Alcohol	Fisher Scientific	A393-500
Sodium Acetate Trihydrate	Fisher Scientific	s608-500
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder	Gold Biotechnology	D003-500
EDTA, Disodium Salt	IBI Scientific	IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32854
TRIS	MP Biomedicals	103133	ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)	New England BioLabs	B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England BioLabs	M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina	New England BioLabs	E7600S	Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus	Omega bio-tek	M1386-02
GelRed 10000 X	Pheonix Research	41003-1
Phenol solution	SIGMA Life Science	P4557-400ml
PVP40	SIGMA-Aldrich	PVP40-50G
Chloroform	VWR	EM8.22265.2500
Ethanol	Koptec	V1016	200 Proof
Silica sand	VWR	14808-60-7
Reamplification primers	Integrated DNA Technologies	see text
Sequencher v.5.0.1	GeneCodes