JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

Abstract

Herbaria הם מקור יקר ערך של חומר צמחי יכול לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים. השימוש של דגימות עשבייה מזוהה עם מספר אתגרים כולל איכות שימור הדגימה, DNA מפורק דגימה ההרסני של דגימות נדירות. על מנת להשתמש ביעילות רבה יותר חומר עשבייה בפרוייקטים גדולים רצף, דרושה שיטה מהימן ומדרגי הכנה בידוד וספריית הדי. מאמר זה מדגים פרוטוקול חזקות, ההתחלה-to-end לבנייה DNA בידוד, תפוקה גבוהה ספריה של דגימות עשבייה שאינה דורשת שינוי לקבלת דוגמאות בודדות. פרוטוקול זה המותאם במיוחד עבור איכות נמוכה מיובשים צמח חומר לוקח יתרון השיטות הקיימות על-ידי מיטוב רקמות שחיקה, שינוי בחירת גודל הספרייה, היכרות עם שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה. Reamplification של ספריות DNA תשואה נמוכה יכול להציל את דגימות נגזר דגימות עשבייה ללא תחליף, ערך פוטנציאלי, שלילת הצורך לדיגום הרסניים נוספים וללא היכרות עם רצף ניכרת הטיה על השכל יישומים פילוגנטי. הפרוטוקול נבדק על מאות מינים דשא, אך צפוי להיות להתאמה לשימוש אחר שושלות הצמח לאחר אימות. פרוטוקול זה יכול להיות מוגבל על ידי ה-DNA ביותר, שבו קטעים שלא קיימים בטווח הרצוי, ועל ידי מטבוליטים משניים נוכח חומר צמח המעכבות נקי בידוד ה-DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ומהירה המאפשרת בידוד ה-DNA והכנת ספריית דגימות 24 ב פחות מ 13 h, עם רק 8 שעות של זמן על הידיים פעילה עם שינויים מינימליים.

Introduction

עשבייה אוספים הם מקור ערך פוטנציאלי של מינים ושל גיוון גנומית ללימודי כולל פילוגנטיקה1,2,3, גנטיקה של אוכלוסיות4,5, שימור ביולוגיה6, מין פולש ביולוגיה7ותכונה האבולוציה8. היכולת לקבל מגוון רחב של מינים, אוכלוסיות, מיקומים גיאוגרפיים ונקודות זמן מדגיש את "אוצר"9 זה עשבייה. מבחינה היסטורית, מהות נגזר עשבייה DNA מפורק יש הפריע פרויקטים מבוססי ה-PCR, לעיתים קרובות להשכיב חוקרים באמצעות סמנים בלבד נמצאו ב העתק גבוהה, כגון אזורים של הגנום כלורופלסט או מרווח משועתקים פנימי (ITS) של ribosomal ה-RNA. האיכות של דגימות DNA להשתנות בהרחבה על השיטות לשימור9,10, עם הפסקות גדילי כפול, פיצול מהאש המשמשים בתהליך ייבוש הצורות הנפוצות ביותר של נזק, יצירת בסיס מה שנקרא 90% DNA שכלוא יש לתאר מחקרים מבוססי ה-PCR11. מלבד הפיצול, לסוגיה השנייה הכי נפוצה עשבייה גנומיקה היא זיהום, כגון זה נגזר פטריות endophytic13 או פטריות רכשה לאחר המוות לאחר אוסף אך לפני הרכבה עשבייה12, למרות זאת בעיה זו יכולה להיות bioinformatically פתור נתן את מסד הנתונים נכון פטרייתיים (ראו להלן). בעיה השלישי, פחות נפוץ, הוא שינוי רצף עד ציטוזין (C/G→T/א) דיאמינציה14, למרות מוערך יהיה נמוך (~ 0.03%) עשבייה דגימות11. עם כניסתו של תפוקה גבוהה רצף (HTS), סוגיית הפיצול ניתן להתגבר עם רצף עומק12,15, המאפשר רכישת נתונים ברמת גנומית של דגימות רבות עם איכות נמוכה של קריאות קצר ה-DNA, ואפילו לפעמים המתיר רצף הגנום כולו15.

עשבייה דגימות נעשה שימוש בתדירות גבוהה יותר, הם מרכיב גדול של פרויקטים פילוגנטי16. אתגר הנוכחי של משתמש עשבייה דגימות HTS היא בעקביות קבלת מספיק DNA נטושים כפול, תנאי הכרחי עבור רצפי פרוטוקולים, ממינים רבים מבעוד, ללא צורך לייעל שיטות עבור הפרט דגימות. בנייר זה, הוכח עבור הפקת דנ א והכנת ספריית דגימות עשבייה פרוטוקול זה מנצל שיטות קיימות ומשנה אותם כדי לאפשר תוצאות מהר ו לטבלה הניתנת לשכפול. שיטה זו מאפשרת להשלים עיבוד הדגימה לספריה של דגימות 24 h 13, עם הזמן על הידיים של 8 שעות, או ח 16, עם הזמן על הידיים 9 h, כאשר השלב reamplification אופציונלית נדרשת. עיבוד סימולטני של דגימות נוספות הוא בר השגה, אבל הגורם המגביל הוא יכולת צנטריפוגה, מיומנות טכנית. הפרוטוקול נועד דרוש רק טיפוסי ציוד מעבדה (thermocycler צנטריפוגה, דוכני מגנטי) במקום ציוד מיוחד, כגון מפוחים או sonicator, עבור הטיית ה-DNA.

איכות ה-DNA, פרגמנט גודל וכמות המגבילים את הגורמים לשימוש של עשבייה דגימות בניסויים רצף תפוקה גבוהה. שיטות נוספות לבודד דנ א עשבייה ויצירת רצף תפוקה גבוהה ספריות הראו את התועלת של שימוש רק 10 ng של הדנ א16; אולם הם דורשים השפעול קביעת המספר האופטימלי של PCR מחזורי הנדרש להכנה הספרייה. זה הופך מעשית כאשר להתמודד עם כמויות קטנות מאוד של קיימא כפול תקועים דנ א (dsDNA), כמו הדגימות עשבייה לייצר רק מספיק דנ א הכנה בספריה מסוימת. השיטה המוצגת כאן משתמש מספר בודד של מחזורים ללא קשר לאיכות הדגימה, כך אין דנ א הוא איבד ספריית אופטימיזציה שלבים. במקום זאת, צעד reamplification מופעל כאשר ספריות אינן עונות על הכמויות המינימליות לצורך עריכה ברצף. דוגמאות עשבייה רבים נדירים ושולט קצת חומר מקשה להצדיק את הדגימה הרסני במקרים רבים. כדי לשנות זאת, פרוטוקול הציג מאפשר dsDNA קלט מידות פחות מ 1.25 ng לתוך תהליך הכנה ספריה, הרחבת הטווח של דגימות קיימא עבור תפוקה גבוהה רצף וצמצום הצורך דגימה ההרסני של דגימות.

להלן כללי התנהגות יש כבר אופטימיזציה עבור עשבי, נוסה על מאות מינים שונים מדגימות עשבייה, אף אנו צופים כי ניתן להחיל את הפרוטוקול להרבה קבוצות אחרות של הצמח. הוא כולל שלב אופציונלי שחזור יכול לשמש כדי לחסוך באיכות נמוכה ו/או דגימות נדירות. בהתבסס על דגימות עשבייה מעל מאתיים נבדק, פרוטוקול זה פועל על דגימות עם קלט רקמות נמוכה ואיכות, המאפשר השימור של דגימות נדירות באמצעות דגימה הרסני מינימלי. הנה היא מופיעה בפרוטוקול זה יכול לספק ספריות באיכות גבוהה יכול להיות רציף לפרויקטים מבוססי phylogenomics.

Protocol

1. לפני להתחיל

  1. להפוך צטאריל טריים trimethylammonium ברומיד (CTAB) מאגר17 על-ידי הוספת 20 גר' CTAB, 10 גרם של פוליוינילפירולידון (PVP) 40, 100.0 mL 1 מ' טריס pH 8.0, 40 מ של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 8.0, 280.0 מ ל 5 M NaCl ולאחר 400.0 מיליליטר מים ריאגנט יחד, ולהביא הנפח הכולל באמצעות ריאגנט כיתה 1 ליטר מים. להתאים את ה-pH ל 8.0.
    הערה: ריאגנטים נוספים ניתן להוסיף CTAB בהתאם תרכובות משניות taxa בודדים. לראות את אלן. et al. 18 עבור רשימה מקיפה של ריאגנטים מוספים.
  2. להוסיף 10 µL של β-mercaptoethanol לכל 5 מ של מאגר CTAB.
    הערה: זה יכול להיות מוכן באצוות של 50 מ ל, לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 3-4 שבועות.
    1. מחממים את הפתרון CTAB באמבט מים 65 ° C.
  3. מקררים מרגמות, בקווקז ב-20 ° C למשך 20 דקות לפחות.
  4. תווית 4 סטים של 2 x צינורות 2-mL n (כאשר n = מספר דוגמאות). לשים 1 סט של הצינורות עם תוויות על קרח.
  5. מקררים אלכוהול איזופרופיל על קרח או במקפיא-20 ° C.
  6. להסיר מעבדתי הפיך הנייח (אלוהים אדירים) חרוזים (ראה טבלה של חומרים) מהמקרר, לאפשר להם equilibrate לטמפרטורת החדר (לפחות 30 דקות).
  7. להכין את 80% אתנול.
  8. בחר עשבייה דגימות לחילוץ ולאחזר ~ 1 ס מ2או 10 מ ג, רקמת לכל הדגימה, רצוי עלים בחומר.

2. הפקת דנ א

  1. לטחון ~ 1 ס מ2 רקמת עשבייה שנבחרו מראש באמצעות מרגמות prechilled בקווקז. מוסיפים חנקן נוזלי וחול 30 – 50 מ ג מחוטא. לטחון עד רקמות הופך אבקה.
    הערה: 10 מ ג או יותר רקמות רצוי, אך פחות עבד גם במקרים מסוימים. ברגע החנקן הנוזלי מתאדה, להוסיף עוד לפי הצורך עד רקמות באופן מלא האדמה. שיטה נפוצה נוספת לשיבוש תאים ורקמות הוא השימוש של מכה חרוז. עם זאת, שיטה זו נמצאה לא פועלות היטב עבור דגימות בשימוש בניסויים אלה.
  2. להעביר את האבקה קפוא לתוך שני צינורות 2 מ"ל (להוסיף לא יותר ממחצית נפח של הצינור). להוסיף 600 µL של פתרון CTAB חמים כל שפופרת ומערבבים הצינורות ביסודיות על ידי היפוך ו vortexing.
    הערה: כיוון כמות ואיכות החומר עשבייה לעתים קרובות נמוכה, ביצוע בידוד ה-DNA של שתי חזרות מסייעת להשגת תשואות גבוהות.
  3. דגירה בדגימות באמבט מים 65 ° C עבור 1-1.5 h, vortexing כל 15 דקות.
  4. צנטריפוגה דגימות ב 10,000 g x עבור 5 דק. להעביר את תגובת שיקוע קבוצה חדשה של תוויות צינורות (~ 500 µL). להתעלם בגדר תוך שימוש בתהליך סילוק ללא כלור רגיל.
  5. להוסיף 4 µL של RNase-A (10 mg/mL) כל שפופרת ומערבבים על-ידי היפוך או pipetting. דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט חום בלוק או מים למשך 15 דקות.
  6. להוסיף אמצעי שווה (~ 500 µL) של תערובת אלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl 25:24:1, ברגע הצינורות הגיעו בטמפרטורת החדר. מערבבים ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה ו/או עם היפוך. צנטריפוגה שהצינורות ב g 12,000 x במשך 15 דקות להעביר את השכבה המימית (השכבה העליונה) קבוצה חדשה של תוויות צינורות (~ 400 µL). למחוק את השכבה אורגניים לתוך מיכל פסולת למשפחה עם ילדים.
    הערה: שלב 2.6 ניתן לחזור אם כמויות גדולות של חומרים משני צפויים ב לשתול חומר.
  7. הוסף אמצעי שווה (~ 400 µL) של תערובת אלכוהול כלורופורם 24:1: isoamyl. מערבבים ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה ו/או עם היפוך. Centrifuge הצינורות ב g 12,000 x במשך 15 דקות העברה השכבה המימית (השכבה העליונה) על קבוצה חדשה של prechilled, שכותרתו צינורות (~ 300 µL). למחוק את השכבה אורגניים לתוך מיכל פסולת למשפחה עם ילדים.
  8. להוסיף אמצעי שווה (~ 300 µL) של אלכוהול איזופרופיל prechilled ו- µL 12 של 2.5 מטר סודיום אצטט כל שפופרת. דגירה בדגימות ב-20 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
    הערה: הזמנים הדגירה ניתן להאריך (עד הדגירה לילה), אבל איכות דנ א יקטן ככל דגירה בדגימות.
  9. לקחת את הדוגמאות המקפיא ואת צנטריפוגה הצינורות ב g x 12,000 במשך 15 דקות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע בעדינות מבלי להפריע בגדר. לשטוף את צניפה מאת הבולם עם 70% טרי אתנול (כ 300 – 500 µL). עבור כל דגימה כפולים, לאחד את שני כדורי בודדים לתוך אחד עם ליווי אתנול.
    הערה: הדוגמאות צריך להיות מאוחד לתוך שפופרת אחת באמצעות אתנול תחילה ולאחר מכן המשך. אין צורך לשטוף כל דגימה עם אתנול בנפרד.
  10. Centrifuge הצינורות ב g x 12,000 במשך 10 דקות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע בעדינות מבלי להפריע בגדר. האוויר יבש כדורי.
    הערה: דוגמאות ניתן לייבש מהר יותר באמצעות גוש חום יבש (לא יעלה על 65 ° C). ודא כי הדגימות לא מתייבשים יתר על המידה, כמו זה יכול להקטין את התשואה הסופית של ה-DNA.
  11. להשעות את ה-DNA מבודדות ב- 50 µL של 1 x טה. מאחסנים במקפיא-20 ° C לאחסון לטווח ארוך או 4 ° C לשימוש בשבוע הבא.

3. בקרת איכות (QC)

  1. לרוץ עם ג'ל agarose לבדיקת איכות.
    1. להכין בופר טריס/בוראט/EDTA (TBE) 1 x על-ידי הוספת בסיס טריס 54 g 27.5 g פנמיות, 3.75 g EDTA ניתרן מלח, להביא את הנפח הכולל 5 L באמצעות ריאגנט כיתה מים.
    2. הכנת ג'ל agarose 1% על-ידי הוספת 1 g agarose 100 מ של 1 x TBE. מיקרוגל הפתרון עד agarose לא יהיה גלוי. להוסיף 0.01% חומצות גרעין ג'ל כתם (ראה טבלה של חומרים). ומצננים את הבקבוק עד שהיא חמה למגע. מערבבים היטב על ידי ערבוב. יוצקים agarose מגש ג'ל ולתת לו לשבת עד.
    3. מערבבים 3 µL מדגם µL 2 של ריאגנט כיתה מים, 1 µL של 6 x טוען לצבוע. לטעון את הדגימות המטריצה ג'ל, וציין את הסדר שלהם.
    4. להפעיל הדגימות 60-70 דקות ב- 60-70 (פ') התמונה הג'ל תחת אור UV עם חשיפה נכונה ונוחות.
      הערה: נוכחות של להקה משקל מולקולרי גבוהה היא סימן של ה-DNA באיכות גבוהה, בעוד מריחות מציינות בדרך כלל DNA השפלה. רוב דגימות עשבייה אתה יורד.
  2. להפעיל ניתוח כימות dsDNA (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע את כמות כפולה תקועים הדנ א.
    1. השתמש µL 2 מדגם לניתוח.
      הערה: דילולים לא נדרשים עבור ניתוח כימות של חומר עשבייה כפי שהם נוטים להיות בכמויות מינימליות. ספריות מוצלחת נעשו מתוך מעט ככל 1.26 ng dsDNA הכולל של שלב זה.

4. DNA הטיה

הערה: זה הוא גרסה אופטימיזציה של fragmentase כפול גדילי מסחרי פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).

  1. המקום dsDNA פיצול האנזים על הקרח לאחר vortexing עבור 3 s.
  2. בשפופרת סטרילי 0.2 מ"ל פולימראז תגובת שרשרת (PCR), מיקס 1 – 16 µL מבודדים DNA עם 2 µL של המלווה פיצול תגובה מאגר. להביא את הנפח הכולל 18 µL על-ידי הוספת נוקלאז מים חינם. להוסיף 2 µL של אנזים פיצול dsDNA ו מערבולת התערובת 3 s.
    הערה: כמות הדנ א הדרוש משתנה בהתאם ריכוז ה-DNA (aim על סך 200 ng בצינור).
  3. דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך דקות 8.5. לאחר מכן להוסיף 5 µL של 0.5 M EDTA הצינורות.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע ברגע תקופת הדגירה הוא מעל כדי לסיים את התגובה ולמנוע דגימות די אן איי יתר הטיה.

5. ניקיון חרוז

  1. Homogenize את החרוזים אלוהים אדירים על-ידי vortexing.
  2. להביא את הנפח הכולל של ה-DNA הוטו 50 µL על-ידי הוספת µL 25 של נוקלאז מים חינם. להוסיף µL 45 של חרוזים אלוהים אדירים בטמפרטורת החדר (90% נפח) µL 50 של הוטו DNA ו לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    הערה: הוספת חרוזים על 90 אחוז נפח המדגם נעשית כדי להסיר הקטן ביותר של מקטעי דנ א, לעתים קרובות מתחת 200 בסיסי זוגות.
  3. תן הדגימות דגירה עבור 5 דק. לשים את הצינורות על צלחת מגנטית ולתת להם לשבת במשך 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
    הערה: להיזהר שלא להפריע את החרוזים, כפי שהם מכילים את מטרות DNA הרצוי.
  4. להוסיף 200 µL טריים 80% אתנול השפופרות בעוד לדוכן מגנטי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ואז בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת. האוויר יבש את החרוזים עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על הדוכן מגנטי עם מכסה פתוח.
    הערה: למנוע ייבוש יתר על המידה את החרוזים. התוצאה יכולה להיות שחזור התחתון של ה-DNA.
  5. הסר את הצינורות של המגנט. Elute ה-DNA של החרוזים לתוך µL 55 של 0.1 x טה ומערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צינורות המקום לדוכן מגנטי ונקה ולחכות הפתרון לפנות (~ 2 דקות).
  6. משוך את µL 52 של תגובת שיקוע. להפעיל ניתוח כימות הדנ א על הדגימות לבדיקת ההתאוששות וריכוז הראשוני שנכנס הספרייה במכינה.
    הערה: ספריות נעשו עם dsDNA הכולל מוערך פחות מ 1.25 ng, למרות כל reamplification במקרה היה נדרש.

6. ספריית הכנה

הערה: זה הוא גרסה מותאמת של ערכת ספריית זמינים מסחרית (ראו פרוטוקול שולחן של חומרים ).

  1. בסוף ההכנה
    1. הוסף 3 µL endonuclease, פוספט עוקב אנזימים µL 7 ללוות התגובה המאגר כדי µL 50 מהדנ א נקי, הוטו. לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה. לסובב את הצינורות כדי להסיר בועות.
      הערה: לנפח הכללי צריך להיות 60 µL.
    2. הכנס את הדגימות thermocycler עם התוכנית הבאה: 30 דקות ב- 20 ° C, 30 דקות ב- 65 ° C, אז להחזיק ב 4 º C.
      הערה: המכסה מחוממת הוגדר ≥75 ° C
  2. מתאם מצדו
    1. לדלל המתאם קיפול 25 – 50 (עובד מתאם ריכוז של 0.6-0.3 מיקרומטר). להוסיף 30 µL של מיקס מאסטר מצדו, µL 1 של מצדו משפר ו- 2.5 µL של מתאם עבור תפוקה גבוהה רצף קריאה קצרה הצינורות.
      הערה: לנפח הכללי צריך להיות 93.5 µL.
    2. לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה. לסובב את הצינורות כדי להסיר בועות. דגירה הצינורות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. להוסיף 3 µL של תערובת מסחרית של אורציל דנ א glycosylase (UDG) ו השמיני Endonuclease של דנ א glycosylase-lyase (ראה טבלה של חומרים) את הצינורות. ודא כי אמצעי האחסון הכולל 96.5 µL. לערבב ביסודיות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמצעות של thermocycler.
      הערה: המכסה צריך להיות מוגדר ≥47 מעלות צלזיוס. הגירסה המקורית של פרוטוקול מסחרי יש מבחר גודל לאחר השלב מצדו מתאם, ואחריו ניקיון חרוז כשלב הסופי. פרוטוקול זה, אשר משיג תשואות גבוהות, בוררים את סדר השלבים ומיישם שאוסף המידות כשלב הסופי.
  3. ' ניקוי ' כדי להסיר אנזימים רסיסים קטנים
    1. Homogenize beads מגנטי על-ידי vortexing.
    2. להוסיף µL 78 של אלוהים אדירים beads מגנטי (80% נפח) ולערבב היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: הוספת חרוזים ב 80% נפח המדגם נעשית כדי להסיר שברי DNA הקטן ביותר, שלעיתים קרובות קצר יותר 250 בסיסים. הסרת מחמירים יותר קטן שברי DNA היא (i) להסיר מתאמים עודפים (ii) להדגיש הגברה של שברים גדולים יותר בשלבים הבאים.
    3. תן שהדגימות תקופת דגירה של 5 דק לשים הצינורות על צלחת מגנטי עבור 5 דק בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע המכיל את ה-DNA מחוץ לטווח יגיע לגודל הרצוי.
      הערה: תיזהר שלא להפריע את החרוזים שמכילים את מטרות DNA הרצוי.
    4. להוסיף 200 µL טריים 80% אתנול השפופרות בעוד לדוכן מגנטי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ואז בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת. האוויר יבש את החרוזים עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על הדוכן מגנטי עם מכסה פתוח.
      הערה: להימנע על ייבוש החרוזים. התוצאה יכולה להיות שחזור התחתון של ה-DNA.
    5. הסר את הצינורות של המגנט. Elute המטרה הדנ א של החרוזים על-ידי הוספת µL 17 של 0.1 x טה ומערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    6. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צינורות המקום לדוכן מגנטי ונקה ולחכות הפתרון לפנות (~ 2 דקות).
    7. משוך את µL 15 של תגובת שיקוע.
  4. PCR-הגברה
    1. להוסיף 25 µL של דיוק גבוה PCR מיקס מאסטר, µL 5 של תפוקה גבוהה קריאה קצרה רצף ספריית ההכנה 5' תחל ו µL 5 של רצף קריאה קצרה תפוקה גבוהה ספריית הכנה 3' פריימר, 15 µL של ה-DNA נקי ובין אם-לא מתאם.
      הערה: הנפח הכולל צריך להיות 50 µL.
    2. מערבבים היטב בעזרת vortexing. למקם את הדגימות thermocycler באמצעות ההגדרות נמצאו טבלה 1: הגדרת הגברה Thermocycler.
      הערה: מספר גדול של מחזורי נדרש עקב כמות נמוכה של DNA קלט.
שלב מחזורTemp.זמןמחזורים
דנטורציה הראשונית98 ° C30 s1
דנטורציה98 ° C10 s12
חישול/הרחבה65 ° C75 s12
סיומת הסופי65 ° C5 דקות1
. תחזיק4 ° C

טבלה 1: PCR פרוטוקול פעמים דנטורציה, חישול, וסיומת וטמפרטורות. טמפרטורה ושעות אופטימציה להצגה ריאגנטים הוצג פרוטוקול זה. אם שונו ריאגנטים, טמפרטורות ושעות צריך להיות מותאם שוב.

  1. בחירת גודל עבור גודל הספרייה הרצויה
    הערה: שלב זה חרוז יסיר שברי גם מעל וגם מתחת לטווח היעד.
    1. Homogenize אלוהים אדירים חרוזים מאת vortexing.
    2. להוסיף 25 µL (50% נפח) של beads מגנטי בטמפרטורת החדר, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה. תן הדגימות דגירה עבור 5 דק. לשים את הצינורות על צלחת מגנטית ולתת להם לשבת במשך 5 דק בזהירות להסיר ולהעביר את תגובת שיקוע קבוצה חדשה של תוויות צינורות.
      הערה: אמצעי אחסון זה ניתן להתאים בהתבסס על גודל הספרייה הרצויה. תגובת שיקוע מכיל DNA שברי לגודל הרצוי. ב הדגירה חרוז הראשון, מחייבות החרוזים שברים ספריית גדולים יותר. אלה יוסרו להתמקד אלה בטווח זוג בסיסים של 400 – 600. תגובת שיקוע מכיל שברים קטנים יותר.
    3. להוסיף 6 µL של חרוזים אלוהים אדירים בטמפרטורת החדר תגובת שיקוע, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה. תן שהדגימות דגירה עבור 5 דק. לשים את הצינורות על צלחת מגנטית ולתת להם לשבת במשך 5 דקות.
      הערה: אמצעי אחסון זה ניתן להתאים בהתבסס על גודל הספרייה הרצויה לפי שלב 6.5.2.
    4. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: תיזהר שלא להפריע את החרוזים המכילים את ה-DNA הרצוי. ב הדגירה חרוז השני, החרוזים הם מחייב את השברים עזב לאחר הסרת ה-DNA הגדול הראשונית שברים. קבוצה זו של שברי הוא בדרך כלל בטווח יגיע לגודל הרצוי.
    5. להוסיף 200 µL טריים 80% אתנול השפופרות בעוד לדוכן מגנטי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s, ואז בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע. חזור. האוויר יבש את החרוזים עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על הדוכן מגנטי עם מכסה פתוח.
      הערה: למנוע ייבוש יתר על המידה את החרוזים. התוצאה יכולה להיות שחזור התחתון של ה-DNA.
    6. הסר את הצינורות של המגנט. Elute המטרה הדנ א של החרוזים לתוך µL 33 של 0.1 x טה ומערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    7. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צינורות המקום לדוכן מגנטי ונקה ולחכות הפתרון לפנות (~ 2 דקות). משוך את 30 µL של תגובת שיקוע, העברה ל 2 mL צינורות (ראה טבלה של חומרים) עבור אחסון.
      הערה: ניתן לשמור את הספריות ב-20 הלעפה תרוטרפמט לאחסון לטווח ארוך.
  2. בקרת איכות
    1. להפעיל מבחן בקרת איכות ספריות ה-DNA. עיין שלבים 3.1 ו- 3.2.
      הערה: עבור ספריות ה-DNA, הפעל את הג'ל ~ 45 דקות ב 96 V.
  3. ספריית reamplification: אופציונלי אם כמות ספריה אינה מספיקה.
    הערה: דוגמאות עם ספריית ריכוזים מתחת 10 ננומטר יכול להיות reamplified באמצעות השלבים הבאים. Reamplification של ספריות ריכוז נמוך יכול להשיג תוצאות מעשי רצף, אך reamplification עלולה לגרום שינוי צנוע הבסיס ההרכב המגוון, למרות אסף נתונים (טבלה 3) מציע כי זה זניח עבור מדדים מסוימים .
    1. לדלל את תחל reamplification אוניברסלי 10-fold באמצעות 0.1 x טה.
    2. להוסיף 25 µL של דיוק גבוה PCR מיקס מאסטר, µL 5 של פריימר reamplification אוניברסלי מדולל 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) ו- 5 µL של reamplification אוניברסלי מדולל פריימר 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) 15 µL של ספריות ריכוז נמוך. הערה: הנפח הכולל צריך להיות 50 µL.
    3. מערבבים היטב בעזרת vortexing. למקם את הדגימות thermocycler באמצעות ההגדרות נמצאו טבלה 1: הגדרת הגברה Thermocycler
      הערה: המספר הגדול של מחזורי נדרש עקב כמות נמוכה של DNA קלט.
    4. ניקיון חרוז
    5. Homogenize אלוהים אדירים חרוזים מאת vortexing. להוסיף µL 45 של חרוזים אלוהים אדירים בטמפרטורת החדר (90% נפח) ולערבב היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    6. תן את הדגימות תקופת דגירה של 5 דק. את הצינורות על צלחת מגנטית למשך 5 דקות.
    7. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע המכיל את ה-DNA לא רצויים.
      הערה: תיזהר שלא להפריע את החרוזים שמכילים את מטרות DNA הרצוי.
    8. להוסיף 200 µL טריים 80% אתנול השפופרות בעוד לדוכן מגנטי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 s, ואז בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.
    9. האוויר יבש את החרוזים עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על הדוכן מגנטי עם מכסה פתוח.
      הערה: למנוע ייבוש יתר על המידה את החרוזים. התוצאה יכולה להיות שחזור התחתון של היעד הדנ א.
    10. הסר את הצינורות של המגנט. Elute המטרה הדנ א של החרוזים לתוך µL 33 של 0.1 x טה ומערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    11. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צינורות המקום לדוכן מגנטי ונקה ולחכות הפתרון לפנות (~ 2 דקות).
    12. משוך את 30 µL של תגובת שיקוע. ניתן לאחסן את הספריות ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
  4. בקרת איכות
    1. להפעיל מבחן בקרת איכות ספריות ה-DNA. עיין שלבים 3.1 ו- 3.2. עבור ספריות ה-DNA, הפעל את הג'ל ~ 45 דקות ב 96 V.
      הערה: אם להקה זוגי נתפסת הג'ל, זה ככל הנראה תוצאה של תשישות פריימר מהשלב reamplification. הלהקות ניתן להסיר על ידי חוזר 6.9, אלא באמצעות מחזור אחד בלבד בתוכנית ה-PCR מתוארים בטבלה1.

תוצאות

בידוד ה-DNA ועם תשואה ספריית הסופי
במחקר זה, הדגימו את היעילות של הפרוטוקול עבור הבידוד של דנ א עשבייה ושחזור של ספריות רצף באיכות גבוהה באמצעות כחמישים דוגמאות שונות עם הבכור משנת 1920 הצעיר ביותר מ-2012 (טבלה 2). עבור כל דגימה, כ 10 מ ג של רקמת העלה שימש עבור ב?...

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה מקיפה וחזק עבור ספריית הכנה של צמחים מיובשים דגימות DNA בידוד וסדר. העקביות של השיטה, מינימלי צורך לשנות אותו מבוסס על יצירת איכות הדגימה זה מדרגי לפרויקטים גדולים מבוססי עשבייה רצף. ההכללה של שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה מאפשר הכללת באיכות נמ?...

Disclosures

המחברים מצהירים שיש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים טיילור AuBuchon-אלדר, ירדן Teisher, קריסטינה Zudock לעזרה בארגון דגימה עשבייה דגימות, ואת הגן הבוטני מיזורי לגישה עשבייה דגימות לדיגום הרסני. עבודה זו הייתה תמיכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע (דב-1457748).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porcelain
Pestlefisher ScientificS02595porcelain
Centrifuge tubesfisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologiessee text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

References

  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  25. . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
  30. . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133DNAmuseomicsphylogenomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved