JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.

Özet

Herbaria biyolojik çalışmalar çeşitli kullanılan bitki materyali paha biçilmez bir kaynaktır. Sulak örnekler kullanımı zorlukları örnek koruma kalitesi, bozulmuş DNA ve nadir örneklerin yıkıcı örnekleme dahil olmak üzere, bir dizi ile ilişkilidir. Daha etkili bir şekilde sulak malzeme büyük sıralama projelerde kullanmak için güvenilir ve ölçeklenebilir yöntemi DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlanması gereklidir. Bu kağıt bir sağlam, başına sonuna protokol değişikliği için bireysel örnekleri gerektirmeyen DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi Kütüphane yapımı için sulak örnekler üzerinden gösteriyor. Bu iletişim kuralı, Kütüphane boyutu seçimi değiştirme ve düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım tanıtımı doku kabuğu optimize ederek düşük kaliteli kurutulmuş bitki malzeme ve alır avantajı mevcut yöntemler için hazırlanmıştır. Reamplification düşük verim DNA kütüphanelerinin yeri doldurulamaz ve potansiyel olarak değerli sulak numuneler, ihtiyaç için ek yıkıcı örnekleme ve fark edilebilir sıralama önyargı için ortak tanıtımı olmadan inkâr türetilen örnekleri kurtarabilirsiniz Filogenetik uygulamaları. Protokol çim türleri yüzlerce üzerinde test edilmiştir, ancak doğrulama sonra diğer bitki soy kullanmak için adapte olması bekleniyor. Bu iletişim kuralı nerede parçaları istediğiniz boyuta aralığında var olmayan, son derece bozulmuş DNA ve temiz DNA izolasyon inhibe Sekonder metabolitler bazı bitki malzeme mevcut sınırlı olabilir. Genel olarak, bu protokol bırakmak için DNA izolasyon ve az 13 h, 24 örnekleri kitaplığı hazırlanması sadece 8 h minimal değişiklikler ile aktif uygulamalı zaman ile hızlı ve kapsamlı bir yöntem sağlar.

Giriş

Sulak koleksiyonları tür ve genomik çeşitlilik filogenetik1,2,3, Populasyon genetiği4,5, koruma çalışmaları için potansiyel olarak değerli bir kaynaktır Biyoloji6, istilacı türlerin Biyoloji7ve özellik evrim8. Zengin bir çeşitlilik türlerin, nüfus, coğrafi yer ve zaman puan elde etmek için yeteneğini sulak olduğunu "hazine sandığı"9 vurgulamaktadır. Tarihsel olarak, bozulmuş doğa sulak elde edilen DNA PCR tabanlı projeler genellikle yalnızca bölgeleri kloroplast genom veya ribozomal, iç kopya etmek Rondela (ITS) gibi yüksek bir kopyasını buldum işaretçileri kullanarak araştırmacılar relegating engel RNA. Örnekler ve DNA kalitesini kapsamlı koruma9,10, çift iplikçikli sonları ve parçalanma hasar en yaygın formları olmak, oluşturma kurutma işleminde kullanılan ısı ile yöntemleri göre değişir sözde % 90'ı DNA kilit-up bu çalışmalar PCR tabanlı11ipotekli. Parçalanma bir yana, ikinci en yaygın sulak genomik kirlenme, bu endophytic mantarlar13 türetilmiş veya mantar toplama sonra ama yine de içinde sulak12, montaj önce öldükten sonra edinilen gibi sorundur Bu sorun çözüldü bioinformatically şu mantar veritabanı (aşağıya bakın) verilen olabilir. Üçüncü ve daha az yaygın bir sorun ile sitozin Deaminasyon (C/G→T/A)14, sıra değişiklik olsa da sulak numuneler11' (~ %0,03) düşük olduğu tahmin edilmektedir. Yüksek işlem hacmi sıralama (HTS) gelişiyle, parçalanma sayısında kısa okuma ve düşük kalitesi ile çok sayıda numune üzerinden genomik düzeyinde veri toplama izin sıralama derinliği12,15, üstesinden gelebilir DNA ve hatta bazen tüm genom sıralama15erişimine izin verme.

Sulak örnekleri daha sık kullanılan olma ve filogenetik projeleri16büyük bir bileşenidir. HTS için sulak örnekler kullanarak geçerli bir meydan okuma tutarlı bir şekilde yeterli çift telli DNA, sıralama iletişim kuralları için gerekli bir ön koşul zamanında, çok sayıda tür yöntemleri birey için optimize etmek gerek kalmadan almaktır numuneler. Bu yazıda, bu mevcut yöntemlerden yararlanır ve onlara hızlı ve yinelenebilir sonuçları için izin vermek için değiştirir DNA ekstraksiyon ve Kütüphane sulak numunelerin hazırlanması için bir iletişim kuralı gösterilmiştir. Bu yöntem için tam 13 h, 8 h uygulamalı zamanla veya isteğe bağlı reamplification adım gerekli olduğunda 9 h uygulamalı zamanla 16 h 24 örnekleri kitaplığına örnek işleme sağlar. Daha fazla örnek aynı anda işleme ulaşılabilir, olsa da santrifüj kapasitesi ve teknik beceri sınırlayıcı faktördür. Protokol yalnızca tipik labaratuar donanımları (thermocycler, santrifüj ve manyetik duruyor) Nebulizatör veya sonicator, gibi özel ekipman yerine DNA kesme için gerektirecek şekilde tasarlanmıştır.

DNA kalite, parça boyutu ve miktar faktörler sulak örneklerin yüksek üretilen iş sıralama deneylerde kullanmak için sınırlı hale gelir. Sulak DNA izole ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplıkları oluşturmak için diğer yöntemleri 10 kadar az kullanma belgili tanımlık yarar göstermiştir ng DNA16; Ancak onlar deneysel olarak PCR optimum sayısını belirleme gerektiren bir kütüphane hazırlık için gerekli geçer. Son derece küçük miktarlarda uygun çift ile ilgili DNA (dsDNA), telli birkaç sulak numune yalnızca bir tek kitaplık hazırlık için yeterli DNA üretmek gibi bu pratik olur. DNA yok Kütüphane optimizasyonu adımda kayıp burada sunulan yöntem döngüleri örnek kalite, ne olursa olsun tek bir sayı kullanır. Bunun yerine, kitaplıkları sıralama için gerekli minimum tutarları uygun olmayan bir reamplification adım çağrılır. Birçok sulak örnekleri nadirdir ve sahip küçük malzeme birçok durumda yıkıcı örnekleme haklı zorlaştırır. Bu karşı sunulan Protokolü sağlar dsDNA giriş boyutları daha az 1,25 ng Kütüphane hazırlık sürecine yüksek üretilen iş sıralama ve örneklerin yıkıcı örnekleme gereksinimini en aza indirilmesi için uygun örnekleri kapsamını genişletiyor.

Aşağıdaki iletişim kuralı otlar için en iyi duruma getirilmiş ve protokol başka birçok bitki gruplarına uygulanabilir beklemek rağmen sulak örnekleri, farklı türlerin yüzlerce test. Düşük kaliteli ve/veya nadir örnekleri kaydetmek için kullanılan bir isteğe bağlı kurtarma adım içerir. Test iki yüz sulak numuneler üzerinde bağlı olarak, bu protokol bırakmak nadir örnekleri minimal yıkıcı örnekleme yoluyla korunması için numuneler ile düşük doku girdi ve kalite, çalışır. Burada bu protokolü phylogenomics tabanlı projeler için sıralı kaliteli kitaplıkları sağlayabilir gösterilir.

Protokol

1. başlangıç önce

  1. CTAB, polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 40 mL 5 10 g 20 g ekleyerek taze setil trimethylammonium bromür (CTAB) arabellek17 olun M NaCl ve 400.0 mL reaktif su birlikte, Toplam hacim 1 L reaktif sınıf kullanarak su getir. 8,0 pH ayarlayın.
    Not: Ek reaktifler CTAB için bireysel takson olarak ikincil bileşikler bağlı olarak ilave edilebilir. Allen ve ark. görmek 18 katkı Kimyasalları kapsamlı bir listesi için.
  2. β-mercaptoethanol 5 mL CTAB arabellek de başına 10 µL ekleyin.
    Not: Bu 50 mL toplu olarak hazırlanan ve 3-4 hafta için oda sıcaklığında saklanan.
    1. Isı 65 ° C su banyosu CTAB çözümde.
  3. Harçlar ve en az 20 dakika-20 ° C'de dibekler chill.
  4. 2 n 2 mL tüpler x 4 set etiket (burada n = örnekleri sayısı). 1 etiketli tüpler kümesi buza koy.
  5. İsopropanol buz üzerinde veya -20 ° C-dondurucu soğuk.
  6. Katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk ( Tablo malzemelerigörmek) buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında (en az 30 dk) equilibrate etmelerine izin.
  7. % 80 etanol hazırlayın.
  8. Sulak numuneler çıkarılması için seçmek ve ~ 1 cm2veya 10 mg, numune, tercihen yaprak malzeme başına doku almak.

2. DNA ekstraksiyon

  1. ~ 1 cm2 prechilled havan ve dibekler kullanarak önceden seçilmiş sulak doku eziyet. Sıvı azot ve 30-50 mg steril kum ekleyin. Doku ince toz haline döner kadar eziyet.
    Not: 10 mg veya daha fazla doku tercih edilir, ancak daha az Ayrıca bazı durumlarda çalıştı. Bir kere sıvı azot buharlaşır, daha fazla doku tamamen yere kadar gerektiği gibi ekleyin. Hücre ve doku için başka bir ortak yöntem boncuk çırpıcı kullanmaktır. Ancak, bu yöntem de bu deneylerde kullanılan numuneler için çalışmıyor bulundu.
  2. Donmuş toz (tüp 's birim fazla yarısını ekleyin) iki 2 mL tüpler içine aktarın. Sıcak CTAB çözüm 600 µL her boru ve tüpler inversiyon ve vortexing tarafından iyice karıştırın.
    Not: miktar ve sulak malzeme kalitesi ve sık sık düşük DNA izolasyon içinde iki tekrar performans daha yüksek verim elde etmek için yardımcı olur.
  3. 1 – 1,5 h, vortexing her 15 dakikada bir 65 ° C su banyosunda örnekleri kuluçkaya.
  4. Santrifüj örnekleri 10.000 x g 5 dakika süreyle de süpernatant etiketli tüpler (~ 500 µL) taze bir dizi Transfer. Standart olmayan klorlu elden çıkarma yordamı kullanarak Pelet atmak.
  5. 4 µL RNase-A (10 mg/ml) her tüp ve ters çevirme veya pipetting karıştırın. Bir ısı blok veya su banyoda 15dk için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
  6. Tüpler oda sıcaklığında alabilirseniz eşit bir birim (~ 500 µL) 25:24:1 fenol: kloroform: izoamil alkol karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ve/veya inversiyon ile iyice karıştırın. Borular 12,000 x g 15 dakika süreyle de sulu katman (üst katman) için yeni bir set Transfer santrifüj tüpleri (~ 400 µL) etiketli. Organik katman klorlu atık konteyner içine atın.
    Not: Adım 2.6 tekrar ikincil bileşiklerin büyük miktarlarda bekleniyor Eğer bitki malzeme.
  7. Eşit bir birim (~ 400 µL) 24:1 kloroform: izoamil alkol karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ve/veya inversiyon ile iyice karıştırın. Borular 12,000 x g 15 dk. Transfer için de prechilled, etiketli tüpler (~ 300 µL) yeni bir set için sulu katman (üst katman) santrifüj kapasitesi. Organik katman klorlu atık konteyner içine atın.
  8. Eşit bir birim (~ 300 µL) 12 µL 2.5 M sodyum asetat ve prechilled isopropanol her tüp için ekleyin. Örnekleri-20 ° c 30-60 dk için kuluçkaya.
    Not: Kuluçka kez (kadar gece kuluçka) uzatılabilir ama DNA kalite artık örnekleri kuluçkaya azalacak.
  9. Dondurucu ve borular 12,000 x g 15 dakika süreyle de kaldırmak ve süpernatant yavaşça atmak Pelet bozmadan santrifüj numune al. Pelet tarafından süspansiyon taze % 70 etanol (yaklaşık 300-500 µL) ile yıkayın. Her iki katına örnek için iki bireysel granül etanol eşlik eden biriyle birleştirir.
    Not: Örnekleri etanol ilk kullanarak bir tüpe konsolide edilecek ve daha sonra devam edin. Her örnek etanol ile ayrı ayrı yıkamak gerekli değildir.
  10. 12.000 x g 10 dk. Kaldır, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant yavaşça Pelet bozmadan atın. Hava Kuru granül.
    Not: Örnekleri daha hızlı bir kuru sıcak blok kullanarak kurutulmuş (65 ° C fazla olamaz). Örnekleri değil aşırı kuru olduğundan emin olun, bu DNA son verimini düşürebilir.
  11. İzole DNA 1 x TE 50 µL içinde askıya alma. Uzun süreli depolama için-20 ° C-derin dondurucu veya kullanılmak üzere aşağıdaki hafta 4 ° C'de depolayın.

3. kalite kontrol (QC)

  1. Kalite kontrol için bir özel jel çalıştırın.
    1. 1 x Tris/Bor/EDTA (TBE) arabellek 54 g Tris Bankası, 27,5 g Borik asit ve 3.75 g EDTA ekleyerek disodyum tuzu, Toplam hacim 5 L reaktif sınıf su kullanarak getirerek hazırlayın.
    2. % 1'özel jel hazırlamak için 100 mL 1 1 g özel ekleyerek x TBE. Hiçbir özel görünene kadar çözüm mikrodalga. % 0,01 nükleik asit jel ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) leke. Dokunmak sıcak kadar şişesi soğumaya bırakın. Tarafından iyi karıştırma karıştırın. Özel bir jel tepsiye dökün ve bunun katılaşır kadar oturmak izin.
    3. Örnek 3 µL, reaktif sınıf su 2 µL ve boya yükleme x 6 1 µL karıştırın. Onların düzen belirterek örnekleri jel matris yükleyin.
    4. Örnekleri için 60-70 dk 60 – 70 V. Image'da UV ışık altında jel doğru pozlama ve odak ile çalıştırın.
      Not: smear genellikle DNA Bozulması gösterir iken açık yüksek molekül ağırlıklı bant varlığı yüksek kalitede DNA, bir ibret vardır. En sulak numuneler bozulmuş.
  2. DsDNA miktar analizler (çift miktarını belirlemek için malzemeler tablo bkz:) telli DNA.
    1. Örnek 2 µL çözümleme için kullanın.
      Not: en az miktarlarda olmak eğilimi olarak Dilutions sulak malzeme miktar analiz için gerekli değildir. Başarılı kitaplıkları kadar az 1.26 ng toplam dsDNA bu adım üzerinden yapıldı.

4. DNA kesme

Not: Bu ticari bir çift iplikçikli fragmentase en iyi duruma getirilmiş bir sürümüdür ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.

  1. Yer dsDNA parçalanma enzim buzda vortexing için 3 sonra s.
  2. Bir steril 0.2 mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp, mix 1 – 16 µL parçalanma tepki arabellek eşlik 2 µL DNA izole. Toplam hacim için 18 µL nükleaz boş su ekleyerek getir. 2 µL dsDNA parçalanma enzim ve girdap karışımı için 3 eklemek s.
    Not: Gerekli DNA'ın DNA toplama (AIM tüp 200 ng toplamda için) bağlı olarak değişebilir.
  3. 8,5 min için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya. Sonra 0,5 M EDTA 5 µL tüpler için ekleyin.
    Not: Bu adımı tepki sonlandırmak ve DNA örnekleri aşırı kesme önlemek için kuluçka dönemi bitti en kısa zamanda yapılması gerekiyor.

5. boncuk temizlik

  1. SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı.
  2. Yamultulmuş DNA hacmi 25 µL nükleaz boş su ekleyerek için 50 µL getir. Oda sıcaklığında SPRI boncuk (% 90 cilt) 45 µL yamultulmuş DNA ve mix 50 µL iyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından ekleyin.
    Not: Toplam numune hacmi yüzde 90'ını boncuk ekleme kez 200 baz çifti aşağıda DNA parçalarının en küçüğü kaldırmak için yapılır.
  3. Örnekleri kuluçkaya 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve onlara 5 dk. için dikkatli bir şekilde oturmak için izin kaldırmak ve süpernatant atın.
    Not: onlar istenen DNA hedefleri içeren boncuklar, rahatsız değil dikkatli olun.
  4. Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin. Hava tüpü kapağı açık manyetik ayaklıklı açıkken Boncuk 5 min için kuru.
    Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.
  5. Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA'dan 0.1 x TE 55 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. 5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.
  6. 52 µL süpernatant ile çekin. Bir DNA miktar analiz örnekleri kurtarma ve Kütüphane hazırlık gider ilk toplama kontrol için çalıştırın.
    Not: Kütüphaneler daha az 1,25 olarak tahmin toplam dsDNA ile yapılmış olan ng, yine de her durumda reamplification gerekli.

6. Kütüphane hazırlık

Not: Bu bir ticari olarak mevcut Kütüphane seti değiştirilmiş bir versiyonu olduğunu (bakınız Tablo reçetesi Protokolü).

  1. Son hazırlık
    1. 3 µL endonükleaz ve enzimler takip fosfat ve reaksiyon arabellek temizlenmiş, yamultulmuş DNA'ın 50 µL eşlik 7 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Kabarcıklar kaldırmak tüplere spin.
      Not: Toplam hacmi 60 µL olmalıdır.
    2. Aşağıdaki programı ile bir thermocycler örnekleri yer: 20 ° C, 65 ° C'de 30 dk, 30 dk sonra 4 ° C'de tutun
      Not: Isıtmalı kapak ≥75 ° C kuruldu
  2. Adaptör ligasyonu
    1. 25-50 kat adaptör seyreltik (0,6 – 0.3 konsantrasyon adaptör çalışma µM). Tüp ligasyonu ana karışımı 30 µL, 1 µL ligasyonu artırıcı ve yüksek-den geçerek kısa okuma sıralama için adaptör 2.5 µL tüpler için ekleyin.
      Not: Toplam hacim 93,5 µL olmalıdır.
    2. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Kabarcıklar kaldırmak tüplere spin. 15 dakika 20 ° C'de tüpler kuluçkaya.
    3. 3 µL urasil DNA glycosylase (UDG) ve DNA glycosylase-liyaz endonükleaz VIII ticari karışımı ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) tüpler için. Toplam hacim 96,5 olduğundan emin µL. iyice karıştırın ve bir thermocycler kullanarak 15dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Kapağı olmalıdır küme ≥47 ° C. Ticari iletişim kuralı özgün sürümü boyutu seçimi son adımı olarak bir boncuk temizlik ardından adaptör ligasyonu adım sonra sahiptir. Daha yüksek verim elde, bu iletişim kuralı aşağıdaki adımları sırasını geçirir ve Boyut seçimi son bir adım olarak uygular.
  3. Enzimler ve küçük parçalarını kaldırmak için Temizleme
    1. Manyetik boncuklar tarafından vortexing homojenize.
    2. SPRI manyetik boncuklar (% 80 cilt) 78 µL ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
      Not: çoğu kez 250 baz çifti kısa en küçük DNA parçalarının kaldırmak için toplam numune hacmi % 80'i boncuk ekleme yapılır. Küçük DNA parçalarının daha sıkı (i) ihtiyaç fazlası adaptörleri kaldırmak ve (ii) daha büyük parçaları aşağıdaki adımlarda amplifikasyon vurgulamak için çıkartılmasıdır.
    3. 5 dk. tüpler 5 dakika süreyle manyetik bir plaka üzerinde dikkatle kaldırmak ve istediğiniz boyuta aralığın dışındaki DNA içeren süpernatant yerine örnekleri kuluçkaya izin.
      Not: istediğiniz DNA hedefinde boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun.
    4. Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin. Hava Kuru Boncuk 5 min için tüp manyetik stand ile kapak açık iken.
      Not: boncuk kurutma üzerinde kaçının. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.
    5. Tüpler mıknatıs kaldırın. 0.1 x TE 17 µL ekleyerek boncuk DNA hedef elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
    6. 5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.
    7. 15 µL süpernatant ile çekin.
  4. PCR güçlendirme
    1. Yüksek sadakat PCR ana Mix 25 µL, 5 µL Kütüphane hazırlık 5' astar sıralama yüksek üretilen iş kısa okuma ve yüksek-den geçerek kısa okuma sıralama kitaplığı hazırlık 3' astar, 5 µL temizlenmiş adaptör bakmaksızın DNA'ın 15 µL ekleyin.
      Not: Toplam hacmi 50 µL olmalıdır.
    2. De vortexing tarafından karıştırın. Tablo 1' de bulunan ayarları kullanarak bir thermocycler örnekleri yerleştirin: Thermocycler amplifikasyon ayarı.
      Not: Devir çok sayıda giriş DNA düşük miktar nedeniyle gereklidir.
Döngüsü adımTemp.ZamanDöngüleri
İlk denatürasyon98 ° C30 s1
Denatürasyon98 ° C10 s12
Tavlama/uzantısı65 ° C75 s12
Son uzantısı65 ° C5 dk1
Basılı tutun4 ° C

Tablo 1: PCR protokol denatürasyon, tavlama ve uzantısı kez ve sıcaklıklar. Sıcaklık ve kez bu protokol için sunulan reaktifler için optimize. Reaktifler değişmiş, sıcaklık ve kez tekrar optimize edilmelidir.

  1. İstenen Kütüphane boyutu için Boyut seçimi
    Not: Bu boncuk adım parçaları hedef aralığı altında ve üstünde kaldırır.
    1. SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı.
    2. 25 µL (% 50 cilt) oda sıcaklığında manyetik boncuklar ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Örnekleri kuluçkaya 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve onlara 5 dk. için dikkatli bir şekilde oturmak için izin ve süpernatant etiketli tüpler yeni bir dizi transfer çıkarın.
      Not: Bu ses seviyesi istenen Kütüphane boyutu temelinde ayarlanabilir. Süpernatant istediğiniz boyuta DNA parçaları içerir. İlk boncuk kuluçka içinde boncuklar daha büyük kütüphane parçaları bağlayıcıdır. Bunlar o 400-600 baz çifti aralıktaki odaklanmak için kaldırılır. Süpernatant daha küçük parçaları içerir.
    3. Oda sıcaklığında SPRI boncuk 6 µL süpernatant için iyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından ekleyip karıştırın. İzin için 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve 5 min için oturmak izin örnekleri kuluçkaya.
      Not: Bu ses seviyesi adım 6.5.2 uygun olarak istenilen Kütüphane boyutu temelinde ayarlanabilir.
    4. Dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
      Not: istediğiniz DNA içeren boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun. İkinci boncuk kuluçka içinde boncuklar ilk kaldırma en büyük DNA parçaları sonra kalan parçaları için bağlayıcıdır. Bu parçaları genellikle istenen boyut aralığında kümesidir.
    5. Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Tekrar ediyorum. Hava Kuru Boncuk 5 min için tüp manyetik stand ile kapak açık iken.
      Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.
    6. Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA hedeften 0.1 x TE 33 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
    7. 5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin. (Bkz. Tablo reçetesi) 2 mL tüpler için depolama için 30 µL süpernatant ve transfer çekin.
      Not: Kütüphaneler, uzun süreli depolama için-20 ˚C tutulabilir.
  2. Kalite kontrol
    1. DNA arşivini kalite kontrol testi. 3.1 ve 3.2 adımlarına bakın.
      Not: DNA kitaplıkları için 96 V ~ 45 dk için jel çalıştırın.
  3. Kütüphane reamplification: isteğe bağlı kitaplık miktar yeterli değil.
    Not: Örnekleri kitaplığına konsantrasyonları altında 10 ile nM reamplified aşağıdaki adımları kullanarak. Reamplification düşük konsantrasyon kütüphanelerin sıralama için uygulanabilir sonuçlar elde edebilirsiniz, ancak reamplification toplanan veri (Tablo 3) bu belirli ölçümleri için önemsiz olduğunu göstermektedir rağmen temel kompozisyon çeşitlilik, mütevazı bir kayma neden olabilir .
    1. 10 kat 0.1 x TE kullanarak evrensel reamplification astar sulandırmak.
    2. Yüksek sadakat PCR ana Mix 25 µL, 5 µL seyreltilmiş evrensel reamplification astar 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) ve 5 µL seyreltilmiş evrensel reamplification astar 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) düşük konsantrasyon kütüphanelerin 15 µL ekleyin. Not: Toplam hacim 50 µL olmalıdır.
    3. De vortexing tarafından karıştırın. Tablo 1' de bulunan ayarları kullanarak bir thermocycler örnekleri yerleştirin: Thermocycler amplifikasyon ayarı
      Not: Devir çok sayıda giriş DNA düşük miktar nedeniyle gereklidir.
    4. Boncuk temizlik
    5. SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı. Oda sıcaklığında SPRI boncuk (% 90 cilt) 45 µL ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
    6. 5 dk. 5 min için manyetik bir tabakta tüpler koymak için kuluçkaya örnekleri ver.
    7. Dikkatle kaldırın ve istenmeyen DNA içeren süpernatant.
      Not: istediğiniz DNA hedefinde boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun.
    8. Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin.
    9. Hava tüpü kapağı açık manyetik ayaklıklı açıkken Boncuk 5 min için kuru.
      Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA hedef alt kurtarılması neden olabilir.
    10. Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA hedeften 0.1 x TE 33 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.
    11. 5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.
    12. 30 µL süpernatant ile çekin. Uzun süreli depolama için-20 ° C'de kitaplık depolanabilir.
  4. Kalite kontrol
    1. DNA arşivini kalite kontrol testi. 3.1 ve 3.2 adımlarına bakın. DNA kitaplıkları için 96 V ~ 45 dk için jel çalıştırın.
      Not: Çift Kişilik bir grup içinde jel görüldüğünde, bu büyük olasılıkla bir reamplification adım yorgunluktan astar sonucudur. Bantları 6,9 yinelenen, ancak Tablo 1' de tasvir PCR programda yalnızca bir döngüsü kullanılarak kaldırılabilir.

Sonuçlar

DNA izolasyonu ve son Kütüphane verim
Bu çalışmada, sulak DNA izolasyonu ve yüksek kaliteli sıralama kitaplıkları kurtarılması için iletişim kuralı etkinliğinin 1920 en eski ve en küçük 2012 (Tablo 2) ile 50 farklı örnekleri kullanarak gösterilmiştir. Her örnek için yaklaşık 10 mg yaprak doku DNA izolasyon için kullanıldı. Yeşil yaprak dokusu varsa tercih ve hiçbir doku bariz mantar kirlenme ile seçilmiştir. Verim düş...

Tartışmalar

Burada sunulan Protokolü DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlık kurutulmuş bitki örnekleri üzerinden sıralama için kapsamlı ve sağlam bir yöntemdir. Yöntemi ve bunu değiştirmek için çok az ihtiyaç örnek kalite make büyük sulak alan sıralama projeler için ölçeklenebilir temel. Düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım dahil düşük kaliteli, düşük miktar, nadir, ya da başka türlü sıralama için uygun olmaz tarihsel açıdan önemli örnekleri dahil sağlar...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Teşekkürler

Taylor AuBuchon-yaşlı, Jordan Teisher ve Kristina Zudock için örnekleme sulak numuneler yardım ve Missouri Botanical Garden erişim sulak numuneler için yıkıcı örnekleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (DEB-1457748) bir hibe destek oldu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porcelain
Pestlefisher ScientificS02595porcelain
Centrifuge tubesfisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologiessee text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

Referanslar

  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  25. . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
  30. . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 133sulakDNA izolasyons ralamamuseomicsphylogenomicsotlar y ksek retilen i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır