Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Résumé

Cet article illustre un protocole détaillé pour l’isolement de l’ADN et construction de bibliothèque de séquençage haut-débit de matériel d’herbier dont le sauvetage de l’ADN de très mauvaise qualité.

Résumé

Les herbiers sont une source inestimable de matériel végétal qui peut être utilisé dans une variété d’études biologiques. L’utilisation de spécimens d’herbier est associé liée un certain nombre de défis, y compris la qualité de conservation des échantillons ADN dégradé et échantillonnage destructif des spécimens rares. Afin d’utiliser plus efficacement le matériel d’herbier dans les projets de séquençage de grand, il faut une méthode fiable et évolutive de préparation d’ADN d’isolement et de la bibliothèque. Cet article démontre un protocole robuste, début à la fin pour ADN isolement et haut débit bibliothèque construction de spécimens d’herbier qui ne nécessite pas de modification pour des échantillons individuels. Ce protocole est adapté pour la plante basse qualité séchée matériel et prend l’avantage des méthodes existantes en optimisant les tissus meulage, modification de sélection de la taille de bibliothèque et en introduisant une étape facultative de reamplification pour les bibliothèques de faible rendement. Reamplification de bibliothèques d’ADN avec un faible rendement peut sauver des échantillons provenant de spécimens d’herbier potentiellement précieux et irremplaçable, niant la nécessité pour un échantillonnage destructeur additionnel et sans introduire un biais de séquençage discernable pour common applications de la phylogénétiques. Le protocole a été testé sur des centaines d’espèces de graminées, mais devrait être adaptable pour utilisation dans les autres lignées de plantes après vérification. Ce protocole peut être limité par l’ADN extrêmement dégradé, où des fragments n’existent pas dans la gamme de taille désirée, et de métabolites secondaires présents dans une substance végétale qui inhibent l’isolement d’ADN propre. Dans l’ensemble, ce protocole présente une méthode complète et rapide qui permet l’isolement d’ADN et préparation de la bibliothèque des 24 échantillons en moins de 13 h, avec seulement 8 h de la période de pratique active avec des modifications minimes.

Introduction

Collections de l’herbier sont une source potentiellement utile des deux espèces et la diversité génomique d’études y compris phylogénétique^1,2,3, génétique des populations,^4,5, conservation biologie⁶espèces envahissantes biologie⁷et trait evolution⁸. La possibilité d’obtenir une riche diversité d’espèces, populations, lieux géographiques et points dans le temps met en lumière le « treasure chest »⁹ qui est de l’herbier. Historiquement, la nature dégradée de l’ADN dérivé herbier a entravé les projets axés sur la PCR, reléguant souvent les chercheurs à utiliser uniquement les marqueurs trouvés à élevé de copies, comme les régions du génome chloroplastique ou l’espaceur interne transcrit (ITS) de le ribosomique ARN. Qualité des spécimens et ADN varient largement basé sur les méthodes de préservation^9,10, avec des cassures double-brin et la fragmentation de la chaleur utilisée dans le processus de séchage étant les formes les plus courantes des dommages, la création du ce que l'on appelle 90 % ADN de lock-up qui a grevé les études basées sur la PCR¹¹. En dehors de la fragmentation, deuxième plus répandu en génomique de l’herbier s’agit de contamination, telles que cette dérivée de champignons endophytes¹³ ou champignons acquis post mortem après la collecte mais avant de monter dans l’herbier¹², bien que ce problème peut être résolu bioinformatically compte tenu de la base de données droit fongique (voir ci-dessous). Un troisième problème, moins fréquents, est la modification de séquence par le biais de cytosine désamination (C/G→T/A)¹⁴, bien qu’on estime être faible (~ 0,03 %) à l’herbier spécimens¹¹. Avec l’avènement de séquençage haut débit (HTS), la question de la fragmentation peut être surmontée avec quelques lectures et séquençage profondeur^12,15, permettant l’acquisition des données génomiques des nombreux spécimens de faible qualité L’ADN et parfois même permettre de séquençage du génome entier¹⁵.

Des échantillons d’herbier sont devenant plus fréquemment utilisés et sont une plus grande partie des projets phylogénétique¹⁶. Un défi actuel de l’utilisation de spécimens d’herbier pour HTS est systématiquement obtenir suffisamment ADN bicaténaire, indispensable pour les protocoles de séquençage, de nombreuses espèces dans un délai raisonnable, sans avoir besoin d’optimiser des méthodes pour l’individu spécimens. Dans cet article, un protocole d’extraction d’ADN et préparation de la bibliothèque de spécimens d’herbier démontre qui tire profit des méthodes existantes et modifie leur permettant des résultats rapides et reproductibles. Cette méthode permet complète transformation du spécimen dans une bibliothèque de 24 échantillons à 13 h, avec temps de pratique 8 h, ou 16 h, avec le temps de pratique 9 h, quand l’étape facultative reamplification est nécessaire. Traitement simultané de plusieurs échantillons est réalisable, même si le facteur limitant est la capacité de centrifugeuse et de compétences techniques. Le protocole vise à exiger uniquement matériel de laboratoire typique (thermocycleur, centrifugeuse et supports magnétiques) au lieu de l’équipement spécialisé, comme un nébuliseur ou un sonicateur, pour la tonte de l’ADN.

Qualité de l’ADN, taille du fragment et la quantité sont des facteurs d’utilisation des spécimens d’herbier dans les expériences de séquençage haut débit limitant. Autres méthodes pour isoler l’ADN de l’herbier et création de bibliothèques de séquençage haut débit ont démontré l’utilité d’utiliser aussi peu que 10 ng d’ADN¹⁶; Cependant ils ont besoin de déterminer expérimentalement le nombre optimal de PCR cycles requis pour la préparation de la bibliothèque. Cela devient impraticable lorsque traitant de très petites quantités de double viable stranded DNA (ADN double brin), car certains spécimens d’herbier produisent seulement assez ADN pour une préparation de bibliothèque unique. La méthode présentée ici utilise un numéro unique de cycles indépendamment de la qualité de l’échantillon, donc aucun ADN ne se perd dans les étapes d’optimisation de bibliothèque. Au lieu de cela, une étape de reamplification est appelée lorsque les bibliothèques ne respectent pas les montants minimums nécessaires pour l’ordonnancement. De nombreux échantillons d’herbier sont rares et possèdent peu de matériel rendant difficile de justifier l’échantillonnage destructeur dans de nombreux cas. Pour contrer cela, le protocole présenté permet de dsDNA entrée tailles moins de 1,25 ng dans le processus de préparation de bibliothèque, élargit la portée des échantillons viables pour haut débit séquençage et réduisant au minimum la nécessité d’échantillonnage destructeur des spécimens.

Le protocole suivant a été optimisé pour les graminées et testé sur des centaines d’espèces différentes des échantillons d’herbier, même si nous attendons que le protocole peut être appliqué à beaucoup d’autres groupes de plantes. Il comprend une étape de récupération en option qui peut être utilisée pour enregistrer la basse qualité et/ou des spécimens rares. Après plus de deux cents spécimens d’herbier testés, ce protocole fonctionne sur des spécimens avec faible tissu d’entrée et de qualité, permettant la préservation des spécimens rares par échantillonnage destructeur minime. Ici, il est démontré que ce protocole peut fournir des bibliothèques de haute qualité qui peuvent être séquencés pour projets axés sur la phylogénomique.

Protocole

1. avant de démarrer

1. Faire frais cétyl triméthylammonium bromure (CTAB) tampon¹⁷ en ajoutant 20 g de CTAB, 10 g de polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8,0, 40 mL de 0,5 M tétraacétique (EDTA) l’acide pH 8,0, 280,0 mL de 5 M de NaCl et 400,0 mL d’eau à réactif ensemble et porter le volume total de 1 L en utilisant le réactif de qualité de l’eau. Ajuster le pH à 8.0.
   NOTE : Réactifs supplémentaires peuvent être ajoutés à la CTAB selon des composés secondaires chez les taxons individuels. Voir Allen et al. ¹⁸ pour obtenir la liste complète des réactifs additives.
2. Ajouter 10 µL de β-mercaptoéthanol par 5 mL de tampon CTAB.
   Remarque : Ceci peut être préparé par lots de 50 mL et stocké à température ambiante pendant 3 à 4 semaines.
   1. Chauffer la solution CTAB dans un bain d’eau de 65 ° C.
3. Faites refroidir les mortiers et pilons à-20 ° C pendant au moins 20 min.
4. Étiqueter les 4 sets de 2 tubes de 2 mL n (où n = le nombre d’échantillons). Mettre 1 ensemble des tubes marqués sur la glace.
5. Isopropanol froid sur la glace ou dans un congélateur à-20 ° C.
6. Enlever les cordons d’immobilisation réversible (SPRI) en phase solide (voir Table des matières) dans le frigo et leur permettre de s’équilibrer à température ambiante (au moins 30 min).
7. Préparer l’éthanol à 80 %.
8. Sélectionner des spécimens d’herbier pour l’extraction et récupérer ~ 1 cm², ou 10 mg, des tissus par spécimen, de préférence le matériel foliaire.

2. Extraction d’ADN

1. Meulez ~ 1 cm² de tissu herbier présélectionnés à l’aide de pilons et mortiers prérefroidies. Ajouter de l’azote liquide et sable de 30 – 50 mg stérilisé. Broyer jusqu'à ce que le tissu se transforme en poudre fine.
   Remarque : 10 mg ou plus de tissu est souhaitable, mais moins a également travaillé dans certains cas. Une fois que l’azote liquide s’évapore, en rajouter au besoin jusqu'à ce que le tissu est complètement broyé. Une autre méthode commune pour perturber les cellules et les tissus est l’utilisation d’un batteur de perle. Toutefois, cette méthode s’est avérée ne fonctionne pas bien pour les spécimens utilisés dans ces expériences.
2. Transférer la poudre congelée dans deux tubes de 2 mL (ajouter non plus de la moitié du volume du tube). Ajouter 600 µL de solution chaude de CTAB dans chaque tube et mélanger les tubes soigneusement par inversion et mélangé au vortex.
   Remarque : Étant donné que la quantité et la qualité du matériel d’herbier est souvent faible, effectuent l’isolement de l’ADN en deux répétitions permet d’obtenir des rendements plus élevés.
3. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 65 ° C pendant 1 – 1,5 h, Vortex toutes les 15 min.
4. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 5 min. transférer le liquide surnageant à une nouvelle série de tubes étiquetés (~ 500 µL). Jeter la pastille à l’aide d’une procédure standard élimination non chlorés.
5. Ajouter 4 µL de RNase-A (10 mg/mL) dans chaque tube et mélanger par inversion ou de pipetage. Incuber les échantillons à 37 ° C dans un bain de chaleur bloc ou de l’eau pendant 15 minutes.
6. Ajouter un volume égal (~ 500 µL) d’un mélange d’alcool de phénol : chloroforme : isoamyle 25:24:1 une fois que les tubes ont atteint la température ambiante. Bien mélanger en pipettant également en haut et en bas et/ou avec inversion. Centrifuger de que les tubes à 12 000 g pendant 15 min. transférer la phase aqueuse (couche supérieure) sur une nouvelle série étiqueté tubes (~ 400 µL). Jeter la couche organique dans un conteneur de déchets chloré.
   NOTE : Étape 2.6 peut être répété si des grandes quantités de composés secondaires sont prévues en matériel végétal.
7. Ajouter un volume égal (~ 400 µL) d’un mélange d’alcool 24:1 chloroforme : isoamylique. Bien mélanger en pipettant également en haut et en bas et/ou avec inversion. Centrifuger les tubes à 12 000 g pendant 15 min. transfert de la phase aqueuse (couche supérieure) pour une nouvelle série de tubes prérefroidies, étiquetés (~ 300 µL). Jeter la couche organique dans un conteneur de déchets chloré.
8. Ajouter un volume égal (~ 300 µL) d’isopropanol prérefroidie et 12 µL d’acétate de sodium 2,5 M dans chaque tube. Incuber les échantillons à-20 ° C pendant 30 à 60 min.
   NOTE : Les temps d’incubation peuvent être prolongées (jusqu'à une nuit d’incubation), mais la qualité d’ADN diminuera plus Incuber les échantillons.
9. Effectue les prélèvements hors du congélateur et centrifuger les tubes à 12 000 g pendant 15 min. Retirer et jeter le surnageant doucement sans déranger le culot. Laver le culot en suspension avec frais 70 % éthanol (environ 300 – 500 µL). Pour chaque échantillon doublé, consolider les deux boulettes individuels en un seul, accompagné de l’éthanol.
   Remarque : Les échantillons devraient être regroupées dans un tube à l’aide d’éthanol tout d’abord et continuez. Il n’est pas nécessaire de laver chaque échantillon avec de l’éthanol séparément.
10. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 10 min. enlever et jeter le surnageant doucement sans déranger le culot. Sécher à l’air des granulés.
    Remarque : Les échantillons peuvent être séchés au plus vite en utilisant un bloc de chaleur sèche (ne pas dépasser 65 ° C). S’assurer que les échantillons ne séchez pas trop, car cela peut diminuer le rendement final de l’ADN.
11. Suspendre l’ADN isolé dans 50 µL de TE 1 x. Conserver dans le congélateur-20 ° C pour un stockage prolongé ou 4 ° C, pour la semaine suivante.

3. contrôle de la qualité (CQ)

1. Exécuter un gel d’agarose pour le contrôle de la qualité.
   1. Préparer, tampon 1 x Tris/Borate/EDTA (TBE) en ajoutant la base Tris 54 g, 27,5 g d’acide borique et 3,75 g EDTA sel disodique, ce qui porte le total à 5 L à l’aide de l’eau de qualité réactif.
   2. Préparer un gel d’agarose à 1 % en ajoutant 1 g d’agarose dans 100 mL de 1 x TBE. La solution au micro-ondes jusqu'à ce qu’aucun gel d’agarose n’est visible. Ajouter 0,01 % acide nucléique gel détachant (voir Table des matières). Laissez refroidir le flacon jusqu'à ce qu’il est chaud au toucher. Bien mélanger en remuant. Verser un plateau de gel d’agarose et laisser reposer jusqu'à ce qu’elle se solidifie.
   3. Mix 3 µL de l’échantillon, 2 µL d’eau de qualité réactif et 1 µL de 6 x chargement colorant. Charger les échantillons dans la matrice du gel, en notant leur ordre.
   4. Exécuter les exemples de 60 – 70 min à 60 – 70 V. Image le gel sous UV avec mise au point et l’exposition correcte.
      Remarque : Présence d’une bande claire de haut poids moléculaire est un signe de l’ADN de haute qualité, tandis que les frottis indiquent généralement la dégradation de l’ADN. La plupart des herbiers sont dégradés.
2. Exécuter une analyse de quantification d’ADN double brin (voir Table des matières) pour déterminer la quantité de double brin d’ADN.
   1. Utiliser 2 µL de l’échantillon pour analyse.
      Remarque : Les Dilutions ne sont pas nécessaires pour l’analyse de la quantification de matériel d’herbier car ils ont tendance à être en quantités minimes. Bibliothèques de succès ont été faites d’aussi peu que 1,26 ng dsDNA total de cette opération.

4. l’ADN de cisaillement

Remarque : Il s’agit d’une version optimisée d’un fragmentase double-brin commercial du protocole (voir Table des matières).

1. Place dsDNA fragmentation enzymatique sur la glace après agitation pendant 3 s.
2. Dans un tube stérile 0,2 mL de réaction en chaîne (PCR) polymérase, mix 1-16 µL isolé ADN avec 2 µL de tampon de réaction de fragmentation d’accompagnement. Porter le volume total à 18 µL par adjonction d’eau libre nucléase. Ajouter 2 µL d’enzyme fragmentation ADN double brin et vortex le mélange pendant 3 s.
   Remarque : La quantité d’ADN nécessaire varie selon la concentration d’ADN (objectif pour 200 total ng dans le tube).
3. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 8,5 min. Puis ajouter 5 µL de EDTA 0,5 M pour les tubes.
   Remarque : Cette étape doit être effectuée dès que la période d’incubation est plus pour mettre fin à la réaction et prévenir des échantillons d’ADN de tonte trop.

5. perle Clean-up

1. Homogénéiser les perles SPRI au vortex.
2. Porter le volume total de l’ADN cisaillé à 50 µL en ajoutant 25 µL d’eau libre nucléase. Ajouter 45 µL de perles de température ambiante SPRI (90 % du volume) à 50 µL de coulissage ADN et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas.
   NOTE : Ajouter des perles à 90 % du volume total de l’échantillon est fait pour enlever le plus petit des fragments d’ADN, souvent en dessous de 200 paires de bases.
3. Laissez les échantillons incuber pendant 5 min. mettre les tubes sur une plaque magnétique et laissez-les reposer pendant 5 min. soigneusement retirer et jeter le surnageant.
   Remarque : Veillez à ne pas déranger les perles, car ils contiennent les cibles d’ADN désirées.
4. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % frais aux tubes tandis que sur le support magnétique. Incuber à température ambiante pendant 30 s puis soigneusement retirer et jeter le surnageant. Répétez cette opération une fois. Sécher à l’air les perles pendant 5 min alors que le tube est à la barre magnétique avec son couvercle ouvert.
   Remarque : Éviter de trop sécher les perles. Cela peut entraîner plus faible récupération de l’ADN.
5. Retirer les tubes de l’aimant. Éluer l’ADN provenant des perles dans 55 µL de 0,1 x TE et homogénéiser par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 5 min. tubes de Place sur le support magnétique et attendez que la solution mettre claire (environ 2 min).
6. Retirer 52 µL du liquide surnageant. Exécuter une analyse de quantification de l’ADN sur les échantillons pour vérifier la récupération et la concentration initiale qui entre dans la préparation de la bibliothèque.
   NOTE : Les bibliothèques ont été faites avec dsDNA totale estimée à moins de 1,25 ng, bien que dans chaque cas reamplification soit nécessaire.

6. Bibliothèque préparation

Remarque : Il s’agit d’une version modifiée d’un kit de bibliothèque disponibles dans le commerce (voir protocole de Table des matières ).

1. Préparation de la fin
   1. Ajouter 3 µL d’endonucléase et phosphate de décantation des enzymes et 7 µL de tampon de réaction d’accompagnement à 50 µL d’ADN purifié, cisaillé. Bien mélanger en pipettant également de haut en bas. Faites tourner les tubes pour enlever les bulles.
      Remarque : Le volume total doit être 60 µL.
   2. Placer les échantillons dans un thermocycleur avec le programme suivant : 30 min à 20 ° C, 30 min à 65 ° C, puis maintenez à 4 ° C.
      NOTE : Couvercle chauffant a été fixé à ≥ 75 ° C
2. Ligature de l’adaptateur
   1. Diluer l’adaptateur 25 – 50 pli (travail de concentration adaptateur de 0,6 à 0,3 µM). Ajouter 30 µL du mélange maître ligature, 1 µL de renforceur de ligature et 2,5 µL de l’adaptateur pour l’ordonnancement de lecture courte haut débit dans les tubes.
      Remarque : Le volume total doit être 93,5 µL.
   2. Bien mélanger en pipettant également de haut en bas. Faites tourner les tubes pour enlever les bulles. Incuber les tubes à 20 ° C pendant 15 min.
   3. Ajouter 3 µL du mélange commercial d’uracile DNA glycosylase (UDG) et le DNA glycosylase-lyase endonucléase VIII (voir Table des matières) pour les tubes. Assurez-vous que le volume total est 96,5 µL. bien mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 15 min à l’aide d’un thermocycleur.
      Remarque : Le couvercle doit être réglé à ≥47 ° C. La version originale du protocole commercial a la sélection de la taille après l’étape de ligature adaptateur, suivie d’un nettoyage de perles comme la dernière étape. Ce protocole, qui permet d’obtenir des rendements plus élevés, intervertit l’ordre de ces étapes et implémente la sélection de la taille comme une étape finale.
3. Nettoyage pour enlever les Enzymes et les petits Fragments
   1. Homogénéiser les billes magnétiques au vortex.
   2. Ajouter 78 µL de billes magnétiques SPRI (80 % du volume) et bien mélanger en pipettant également de haut en bas.
      NOTE : Ajouter des perles à 80 % du volume total de l’échantillon est fait pour enlever les plus petits fragments d’ADN, qui sont souvent moins de 250 paires de bases. Le retrait plus strict de petits fragments d’ADN consiste à (i) supprimer les adaptateurs excédentaires et (ii) mettre l’accent sur l’amplification des fragments plus grands dans les étapes suivantes.
   3. Laisser qu'incuber les échantillons pendant 5 min. Placer les tubes sur une plaque magnétique pendant 5 min. Retirer soigneusement et jeter le surnageant qui contient de l’ADN à l’extérieur de la gamme de taille souhaitée.
      Remarque : Veillez à ne pas déranger les billes qui contiennent les cibles d’ADN désirées.
   4. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % frais aux tubes tandis que sur le support magnétique. Incuber à température ambiante pendant 30 s puis soigneusement retirer et jeter le surnageant. Répétez cette opération une fois. Sécher à l’air les perles pendant 5 min alors que le tube est à la barre magnétique avec le couvercle ouvert.
      Remarque : Éviter les perles de séchage. Cela peut entraîner plus faible récupération de l’ADN.
   5. Retirer les tubes de l’aimant. Éluer la cible de l’ADN de la Perle en ajoutant 17 µL de 0,1 x TE et homogénéiser par pipetage de haut en bas.
   6. Incuber à température ambiante pendant 5 min. tubes de Place sur le support magnétique et attendez que la solution mettre claire (environ 2 min).
   7. Retirer 15 µL du liquide surnageant.
4. Amplification par PCR
   1. Ajouter 25 µL du mélange maître de la haute fidélité PCR, 5 µL de haut débit lecture courte séquençage bibliothèque prép 5' apprêt et 5 µL de séquençage lecture courte haut débit bibliothèque prép 3' primer, à 15 µL de l’ADN purifié adaptateur-ligaturé.
      Remarque : Le volume Total doit être 50 µL.
   2. Mélangez bien au vortex. Placer les échantillons dans un thermocycleur en utilisant les paramètres trouvés dans le tableau 1: réglage d’amplification thermocycleur.
      Remarque : Un grand nombre de cycles est nécessaire en raison de la faible quantité d’ADN d’entrée.

Étape du cycle	Temp.	Temps	Cycles
Dénaturation initiale	98 ° C	30 s	1
Dénaturation	98 ° C	10 s	12
Recuit/Extension	65 ° C	75 s	12
Extension finale	65 ° C	5 min	1
Maintenez	4 ° C

Tableau 1 : Protocole de PCR températures et durées de dénaturation, recuit et extension. Température et temps ont été optimisés pour les réactifs présentés dans le présent protocole. Si les réactifs sont altérées, températures et durées doivent être optimisées encore une fois.

5. Sélection de la taille pour la taille de la bibliothèque souhaitée
   Remarque : Cette étape perle supprimera les fragments au-dessus et en dessous de la fourchette cible.
   1. Homogénéiser les perles SPRI au vortex.
   2. Ajouter 25 µL (50 % du volume) de billes magnétiques température ambiante et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas. Laissez les échantillons incuber pendant 5 min. mettre les tubes sur une plaque magnétique et laissez-les reposer pendant 5 min. soigneusement retirer et de transférer le surnageant dans un nouvel ensemble de tubes étiquetés.
      Remarque : Ce volume peut être réglé selon la taille désirée bibliothèque. Le surnageant contient des fragments d’ADN de la taille désirée. Dans la première incubation de perle, les perles sont contraignantes plus grands fragments de bibliothèque. Ceux-ci sont retirés pour se concentrer sur ceux de la gamme de paires de bases 400 – 600. Le surnageant contient des fragments plus petits.
   3. Ajouter 6 µL de perles SPRI température ambiante au surnageant et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas. Laissez que les échantillons incuber pendant 5 min. mettre les tubes sur une plaque magnétique et laissez-les reposer pendant 5 min.
      Remarque : Ce volume peut être réglé selon la taille désirée bibliothèque conformément à l’étape 6.5.2.
   4. Soigneusement, enlever et jeter le surnageant.
      Remarque : Veillez à ne pas déranger les billes qui contiennent l’ADN désirée. Dans la seconde incubation de perle, les perles sont contraignantes aux fragments subsistant après que la suppression initiale de l’ADN de plus grand fragments. Cet ensemble de fragments est habituellement dans la gamme de taille souhaitée.
   5. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % frais aux tubes tandis que sur le support magnétique. Incuber à température ambiante pendant 30 s, puis soigneusement retirer et jeter le surnageant. Répéter les étapes. Sécher à l’air les perles pendant 5 min alors que le tube est à la barre magnétique avec le couvercle ouvert.
      Remarque : Éviter de trop sécher les perles. Cela peut entraîner plus faible récupération de l’ADN.
   6. Retirer les tubes de l’aimant. Éluer la cible de l’ADN de la Perle en 33 µL de 0,1 x TE et homogénéiser par pipetage de haut en bas.
   7. Incuber à température ambiante pendant 5 min. tubes de Place sur le support magnétique et attendez que la solution mettre claire (environ 2 min). Retirer 30 µL du liquide surnageant et transfert à tubes de 2 mL (voir Table des matières) pour le stockage.
      Remarque : Les bibliothèques peuvent être conservés à-20 ° c pour le stockage à long terme.
6. Contrôle de la qualité
   1. Exécutez un test de contrôle de la qualité sur les bibliothèques d’ADN. Se référer aux étapes 3.1 et 3.2.
      Remarque : Pour les bibliothèques de l’ADN, couler le gel pour ~ 45 min à 96 V.
7. Reamplification de la bibliothèque : facultatif si quantité de bibliothèque n’est pas suffisante.
   Remarque : Les échantillons avec des concentrations de bibliothèque inférieure à 10 nM peut être réamplifié en procédant comme suit. Reamplification des bibliothèques de faible concentration peut obtenir des résultats exploitables pour le séquençage, mais reamplification peut provoquer un léger changement dans la diversité de la composition en bases, bien que se sont réunis les résultats (tableau 3) suggèrent que c’est négligeable pour certains paramètres .
   1. Diluer les amorces universelles reamplification 10 fois à l’aide de 0,1 x TE.
   2. Ajouter 25 µL du mélange maître de la haute fidélité PCR, 5 µL d’apprêt reamplification universelle diluée 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) et 5 µL d’apprêt 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) de la reamplification universelle diluée à 15 µL de bibliothèques de faible concentration. Remarque : Le volume Total doit être à 50 µL.
   3. Mélangez bien au vortex. Placer les échantillons dans un thermocycleur en utilisant les paramètres trouvés dans le tableau 1: réglage d’amplification thermocycleur
      Remarque : Le grand nombre de cycles est nécessaire en raison de la faible quantité d’ADN d’entrée.
   4. Nettoyage perle
   5. Homogénéiser les perles SPRI au vortex. Ajouter 45 µL de perles de température ambiante SPRI (90 % du volume) et bien mélanger en pipettant également de haut en bas.
   6. Laisser les échantillons à incuber pendant 5 min. mettre les tubes sur une plaque magnétique pendant 5 min.
   7. Soigneusement, enlever et jeter le surnageant qui contient l’ADN non désiré.
      Remarque : Veillez à ne pas déranger les billes qui contiennent les cibles d’ADN désirées.
   8. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % frais aux tubes tandis que sur le support magnétique. Incuber à température ambiante pendant 30 s, puis soigneusement retirer et jeter le surnageant. Répétez cette opération une fois.
   9. Sécher à l’air les perles pendant 5 min alors que le tube est à la barre magnétique avec son couvercle ouvert.
      Remarque : Éviter de trop sécher les perles. Cela peut entraîner plus faible recouvrement de la cible de l’ADN.
   10. Retirer les tubes de l’aimant. Éluer la cible de l’ADN de la Perle en 33 µL de 0,1 x TE et homogénéiser par pipetage de haut en bas.
   11. Incuber à température ambiante pendant 5 min. tubes de Place sur le support magnétique et attendez que la solution mettre claire (environ 2 min).
   12. Retirer 30 µL du liquide surnageant. Les bibliothèques peuvent être conservés à-20 ° C pour le stockage à long terme.
8. Contrôle de la qualité
   1. Exécutez un test de contrôle de la qualité sur les bibliothèques d’ADN. Se référer aux étapes 3.1 et 3.2. Pour les bibliothèques de l’ADN, exécutez le gel pour ~ 45 min à 96 V.
      Remarque : Si une double bande est visibles dans le gel, c’est probablement une conséquence de l’épuisement des amorces de l’étape de reamplification. Les bandes peuvent être enlevées en répétant 6,9, mais en utilisant seulement un cycle dans le programme PCR représenté dans le tableau 1.

Résultats

Isolement d’ADN et le rendement Final de bibliothèque
Dans cette étude, l’efficacité du protocole pour l’isolement de l’ADN de l’herbier et la récupération des bibliothèques de séquençage de haute qualité a été démontrée à l’aide de cinquante différents échantillons avec la plus ancienne de 1920 et le plus jeune de 2012 (tableau 2). Pour chaque échantillon, environ 10 mg de tissus foliaires a été utilisé pour l’isoleme...

Discussion

Le protocole présenté ici est une méthode complète et robuste pour l’isolement de l’ADN et le séquençage de préparation de la bibliothèque de spécimens de plantes séchées. La cohérence de la méthode et de la nécessité minimale de l’altérer basé sur spécimen qualité fais il évolutive pour les projets de grand séquençage axée sur l’herbier. L’inclusion d’une étape de reamplification en option pour les bibliothèques de faible rendement permet l’inclusion de basse qualité, faible quant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4452300	96 well
Gel Imaging System	Azure Biosystems	c300
Microfuge 20 Series	Beckman Coulter	B30137
Digital Dry Bath	Benchmark Scientific	BSH1001
Electrophoresis System	EasyCast	B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)	ELGA	89204-092
DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108078	2 ml
Mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Vortex-Genie 2	Fisher Scientific	12-812
Mortar	Fisher Scientific	S02591	porcelain
Pestle	fisher Scientific	S02595	porcelain
Centrifuge tubes	fisher Scientific	21-403-161
Microwave	Kenmore	405.7309231
Qubit Assay Tubes	Invitrogen	Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR	VWR	20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Balance	Mettler Toledo	PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage	Nalgene	F9401
Magnetic-Ring Stand	ThermoFisher Scientific	AM10050	96 well
Water Bath	VWR	89032-210
Hot Plate Stirrers	VWR	97042-754
Liquid Nitrogen	Airgas	UN1977
1 X TE Buffer	Ambion	AM9849	pH 8.0
CTAB	AMRESCO	0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL	AMRESCO	0482-200ML
Ribonuclease A	AMRESCO	E866-5ML	10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63882
Sodium Chloride	bio WORLD	705744
Isopropyl Alcohol	bio WORLD	40970004-1
Nuclease Free water	bio WORLD	42300012-2
Isoamyl Alcohol	Fisher Scientific	A393-500
Sodium Acetate Trihydrate	Fisher Scientific	s608-500
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder	Gold Biotechnology	D003-500
EDTA, Disodium Salt	IBI Scientific	IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32854
TRIS	MP Biomedicals	103133	ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)	New England BioLabs	B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England BioLabs	M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina	New England BioLabs	E7600S	Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus	Omega bio-tek	M1386-02
GelRed 10000 X	Pheonix Research	41003-1
Phenol solution	SIGMA Life Science	P4557-400ml
PVP40	SIGMA-Aldrich	PVP40-50G
Chloroform	VWR	EM8.22265.2500
Ethanol	Koptec	V1016	200 Proof
Silica sand	VWR	14808-60-7
Reamplification primers	Integrated DNA Technologies	see text
Sequencher v.5.0.1	GeneCodes