Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Riepilogo

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Abstract

Gli erbari sono una preziosa fonte di materiale vegetale che può essere utilizzato in una varietà di studi biologici. L'uso di campioni di erbario è associato con una serie di sfide tra cui qualità di conservazione del campione, DNA degradato e campionamento distruttivo di rari esemplari. Per poter utilizzare in modo più efficace materiale di erbario in progetti di sequenziamento di grandi dimensioni, è necessario un metodo affidabile e scalabile di preparazione di isolamento e libreria di DNA. Questa carta dimostra un protocollo robusto, inizio-to-end per DNA alto-rendimento e isolamento costruzione della libreria da esemplari che non richiedono la modifica di singoli campioni. Questo protocollo è su misura per la bassa qualità secchi pianta materiale e approfitta dei metodi esistenti ottimizzando tessuto rettifica, modifica selezione dimensione biblioteca ed introducendo un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento. Reamplification di librerie di basso rendimento del DNA può salvare i campioni provenienti da campioni di erbario potenzialmente preziosi e insostituibili, negando la necessità per ulteriore campionamento distruttivo e senza introdurre bias di sequenziamento discernibile per comune applicazioni filogenetiche. Il protocollo è stato testato su centinaia di specie di erba, ma dovrebbe essere adatto per l'impiego in altri lignaggi pianta dopo la verifica. Questo protocollo può essere limitato dal DNA estremamente degradato, dove non esistono frammenti nel campo dimensione desiderata, e di metaboliti secondari presenti in alcuni materiale vegetale che inibiscono pulito isolamento del DNA. Nel complesso, questo protocollo introduce un metodo veloce e completo che permette di isolamento del DNA e preparazione della biblioteca di 24 campioni in meno di 13 ore, con solo 8 h di tempo attivo hands-on con modifiche minime.

Introduzione

Erbario collezioni sono una fonte potenzialmente importante di entrambe le specie e diversità genomica per studi compreso phylogenetics^1,2,3, genetica delle popolazioni^4,5, conservazione biologia⁶, specie invasive biologia⁷e tratto evolution⁸. La capacità di ottenere una ricca diversità di specie, popolazioni, luoghi geografici e punti di tempo mette in evidenza il "forziere"⁹ che è l'erbario. Storicamente, la natura degradata del DNA erbario-derivato ha ostacolato progetti basati su PCR, relegando spesso i ricercatori a usando solo gli indicatori trovati in alta copia, quali le regioni del genoma del cloroplasto o il distanziatore interno trascritto (ITS) della ribosomiale RNA. Qualità dei campioni e DNA variano ampiamente basata su metodi di conservazione^9,10, con rotture a doppio filamento e la frammentazione da calore utilizzato nel processo di essiccazione, essendo le forme più comuni di danno, creando il cosiddetto 90% DNA di lock-up che ha gravato studi basati su PCR¹¹. A parte la frammentazione, il problema secondo più prevalente in erbario genomica è contaminazione, come quello derivato da funghi endofiti¹³ o funghi acquisito post mortem dopo la raccolta, ma prima di montare nell'erbario¹², però Questo problema può essere risolto bioinformatically dato il database proprio fungo (Vedi sotto). Un terzo problema, meno comune, è modifica di sequenza attraverso citosina deaminazione (C/G→T/A)¹⁴, anche se si stima essere bassa (~ 0,03%) in campioni di erbario¹¹. Con l'avvento di sequenziatori di alto-rendimento (HTS), il problema di frammentazione può essere superato con brevi letture e sequenziamento profondità^12,15, permettendo l'acquisizione di dati a livello genomico dalle numerosi esemplari con bassa qualità DNA e a volte anche permettendo di sequenziamento del genoma intero¹⁵.

I campioni di erbario stanno diventando sempre più frequentemente utilizzati e una maggiore componente di filogenetica progetti¹⁶. Una sfida attuale della utilizzando campioni di erbario per HTS è costantemente ottenere sufficiente DNA a doppia elica, un prerequisito indispensabile per protocolli di sequenziamento, da numerose specie in modo tempestivo, senza la necessità di ottimizzare i metodi per individuo esemplari. In questa carta, un protocollo per l'estrazione di DNA e preparazione di libreria di campioni di erbario è dimostrato che si avvale dei metodi esistenti e li modifica per consentire risultati veloci e replicabili. Questo metodo consente completo elaborazione da esemplare a una libreria di 24 campioni in 13 h, con tempo di preparazione manuale h 8, o 16 h, con hands-on tempo h 9, quando è richiesto il passaggio opzionale reamplification. Elaborazione simultanea di più campioni è realizzabile, anche se il fattore limitante è la capacità della centrifuga e abilità tecnica. Il protocollo è progettato per richiedere solo attrezzature tipici del laboratorio (termociclatore, centrifuga e supporti magnetici) invece di attrezzature specializzate, come un nebulizzatore o un sonicatore, per la tosatura del DNA.

Qualità del DNA, la dimensione del frammento e la quantità sono fattori per l'utilizzo di campioni di erbario a esperimenti di sequenziamento ad alta velocità limitanti. Altri metodi per isolare il DNA di erbario e creazione di librerie di sequenziamento ad alte prestazioni hanno dimostrato l'utilità dell'utilizzo di appena 10 ng di DNA¹⁶; Tuttavia hanno bisogno di determinare sperimentalmente il numero ottimale di PCR cicli necessari per la preparazione di biblioteca. Questo diventa impraticabile quando trattare con estremamente piccole quantità di vitali double stranded DNA (dsDNA), come alcuni esemplari di erbario producono solo abbastanza DNA per una preparazione unica libreria. Il metodo presentato qui utilizza un singolo numero di cicli indipendentemente dalla qualità del campione, quindi nessun DNA si perde nelle fasi di ottimizzazione biblioteca. Invece, un passo di reamplification viene richiamato quando le librerie non soddisfano gli importi minimi necessari per la sequenza. Molti campioni di erbario sono rari e possiedono poco materiale che lo rende difficile da giustificare campionamento distruttivo in molti casi. Per contrastare ciò, il protocollo presentato permette di dsDNA ingresso taglie meno di 1,25 ng nel processo di preparazione di biblioteca, ampliando l'ambito dei campioni praticabili per high throughput sequenziamento e riducendo al minimo la necessità di campionamento distruttivo degli esemplari.

Il seguente protocollo è stato ottimizzato per erbe e testato su centinaia di specie diverse dai campioni di erbario, anche se ci aspettiamo che il protocollo può essere applicato a molti altri gruppi di piante. Esso comprende un passaggio di ripristino opzionale che può essere utilizzato per salvare bassa qualità e/o rari esemplari. Questo protocollo basato su oltre duecento esemplari di erbario testati, funziona sugli esemplari con tessuto basso input e qualità, consentendo la conservazione di esemplari rari tramite campionamento distruttivo minimo. Qui è indicato che questo protocollo può fornire librerie di alta qualità che possono essere ordinati in sequenza per progetti basati su phylogenomics.

Protocollo

1. prima di iniziare

1. Fare fresco cetilico trimetilammonio bromuro (CTAB) buffer¹⁷ aggiungendo 20 g di CTAB, 10 g di polivinilpirrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL di 0,5 M etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido pH 8.0, 280,0 mL 5 M di NaCl e 400,0 mL di reagente acqua insieme e portare il volume totale a 1 L con reagente-grado dell'acqua. Regolare il pH a 8.0.
   Nota: Altri reagenti possono essere aggiunto al CTAB a seconda di composti secondari in singoli taxa. Vedere Allen et al. ¹⁸ per una lista completa dei reagenti additivi.
2. Aggiungere 10 µ l di β-mercaptoetanolo ogni 5 mL di tampone CTAB.
   Nota: ciò può essere preparato in lotti da 50 mL e conservato a temperatura ambiente per 3 – 4 settimane.
   1. Riscaldare la soluzione CTAB in un bagno di acqua di 65 ° C.
3. Chill mortai e pestelli a-20 ° C per almeno 20 min.
4. Etichetta 4 set di 2 x provette 2 mL n (dove n = numero di campioni). Metti 1 set di provette in ghiaccio.
5. Isopropanolo freddo sul ghiaccio o in un congelatore a-20 ° C.
6. Rimuovere perline di immobilizzazione reversibile (SPRI) fase solida (Vedi Tabella materiali) dal frigo e consentire loro di stabilizzare a temperatura ambiente (almeno 30 min).
7. Preparare 80% di etanolo.
8. Selezionare i campioni di erbario per estrazione e recuperare ~ 1 cm², o 10 mg, di tessuto al campione, preferibilmente materiale fogliare.

2. DNA estrazione

1. Macinare ~ 1 cm² di tessuto preselezionato erbario con pestelli e mortai prechilled. Aggiungere azoto liquido e sabbia di 30 – 50 mg sterilizzato. Macinare fino a quando il tessuto si trasforma in polvere fine.
   Nota: 10 mg o più tessuto è auspicabile, ma meno ha lavorato anche in alcuni casi. Una volta che l'azoto liquido evapora, aggiungerne altri se necessario fino a quando il tessuto è completamente a terra. Un altro metodo comune per interrompere le cellule ed i tessuti è l'uso di un battitore di tallone. Tuttavia, questo metodo è stato trovato per non funzionano bene per gli esemplari utilizzati in questi esperimenti.
2. Trasferire la polvere gelata in due provette da 2 mL (aggiungere non più di metà del volume del tubo). Aggiungere 600 µ l di soluzione CTAB calda ad ogni provetta e mescolare i tubi approfonditamente da inversione e Vortex.
   Nota: Poiché la quantità e la qualità del materiale di erbario è spesso basso, esecuzione di isolamento del DNA in due ripetizioni consente di ottenere rendimenti più alti.
3. Incubare i campioni in un bagno di acqua di 65 ° C per 1 – 1,5 h, Vortex ogni 15 min.
4. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 min. trasferire il surnatante in una nuova serie di provette (~ 500 µ l). Scartare il pellet utilizzando una procedura standard smaltimento non clorurati.
5. Aggiungere 4 µ l di RNasi-A (10 mg/mL) ad ogni provetta e mescolare capovolgendo o pipettaggio. Incubare i campioni a 37 ° C in un bagno di acqua o blocco di calore per 15 min.
6. Aggiungere un volume equivalente (~ 500 µ l) di una miscela di alcol fenolo: cloroformio: isoamyl 25:24:1 una volta che i tubi hanno raggiunto la temperatura ambiente. Mescolare accuratamente pipettando su e giù e/o con inversione. Centrifugare le provette a 12.000 x g per 15 min trasferimento lo strato acquoso (strato superiore) per una nuova serie di provette (~ 400 µ l). Eliminare lo strato organico in un contenitore per rifiuti clorurato.
   Nota: Passaggio 2.6 può essere ripetuto se grandi quantità di composti secondari sono attesi in materiale vegetale.
7. Aggiungere un volume equivalente (~ 400 µ l) di una miscela di alcool di 24:1 cloroformio: isoamilico. Mescolare accuratamente pipettando su e giù e/o con inversione. Centrifugare le provette a 12.000 x g per 15 min trasferimento lo strato acquoso (strato superiore) per una nuova serie di tubi prechilled, etichettati (~ 300 µ l). Eliminare lo strato organico in un contenitore per rifiuti clorurato.
8. Aggiungere un volume equivalente (~ 300 µ l) di isopropanolo prechilled e 12 µ l di acetato di sodio 2,5 M per ogni tubo. Incubare i campioni a-20 ° C per 30 – 60 min.
   Nota: I tempi di incubazione possono essere esteso (fino a incubazione durante la notte), ma la qualità del DNA diminuirà più Incubare i campioni.
9. Prelevare i campioni fuori dal congelatore e centrifugare le provette a 12.000 x g per 15 min. rimuovere e scartare il surnatante delicatamente senza disturbare il pellet. Lavare la pallina da sospensione con etanolo al 70% (circa 300 – 500 µ l). Per ogni campione raddoppiato, consolidare le due palline individuali in uno con l'accompagnamento dell'etanolo.
   Nota: I campioni dovrebbero essere consolidati in un tubo utilizzando etanolo prima e poi procedere. Non è necessario lavare separatamente ciascun campione con etanolo.
10. Centrifugare le provette a 12.000 x g per 10 min. rimuovere e scartare il surnatante delicatamente senza disturbare il pellet. Asciugare all'aria il pellet.
    Nota: I campioni possono essere essiccati più velocemente utilizzando un blocco a calore secco (non superare i 65 ° C). Assicurarsi che i campioni non asciugano troppo, come questo può ridurre la resa finale del DNA.
11. Sospendere il DNA isolato in 50 µ l di 1 x TE. Conservare in freezer per stoccaggio a lungo termine-20 ° C o 4 ° C per uso nella settimana successiva.

3. controllo di qualità (QC)

1. Eseguire un gel di agarosio per controllo di qualità.
   1. Preparare un tampone Tris/Borato/EDTA (TBE) 1x aggiungendo 54g Tris base, 27,5 g di acido borico e 3,75 g EDTA sale disodico, portando il volume totale a 5 L, utilizzando acqua di grado reagente.
   2. Preparare un gel di agarosio 1% con l'aggiunta di agarosio 1 g per 100 mL di 1 x TBE. Forno a microonde la soluzione fino a quando non dell'agarosi sono visibile. Aggiungi 0,01% gel di acido nucleico macchia (Vedi Tabella materiali). Lasciare raffreddare il pallone fino a quando è caldo al tatto. Mescolare bene per agitazione. Versarvi un cassetto del gel dell'agarosi e lasciate riposare fino a quando non si solidifica.
   3. Mix 3 µ l di campione, 2 µ l di acqua di grado reagente e 1 µ l di 6x loading dye. Caricare i campioni nella matrice del gel, notando il loro ordine.
   4. Eseguire gli esempi per 60 – 70 min a 60 – 70 V. immagine il gel luce UV con messa a fuoco e l'esposizione corretta.
      Nota: Presenza di una banda chiara ad alto peso molecolare è un segno di alta qualità del DNA, mentre le sbavature di solito indicano degradazione del DNA. Maggior parte degli esemplari di erbario sono degradata.
2. Eseguire un'analisi di quantificazione di dsDNA (Vedi tabella materiali) per determinare la quantità di doppio DNA incagliato.
   1. Utilizzare 2 µ l di campione per l'analisi.
      Nota: Diluizioni non sono necessari per l'analisi di quantificazione del materiale di erbario come essi tendono ad essere in quantità minime. Librerie di successo sono state effettuate da appena 1.26 ng totale dsDNA da questo passaggio.

4. DNA tosatura

Nota: Questa è una versione ottimizzata di un fragmentase doppio filamento commerciale protocollo (Vedi Tabella materiali).

1. Enzima di frammentazione di dsDNA posto sul ghiaccio dopo Vortex per 3 s.
2. In un tubo di reazione a catena (PCR) polimerasi sterile 0,2 mL, mix 1 – 16 µ l DNA isolato con 2 µ l di tampone di reazione di frammentazione di accompagnamento. Portare il volume totale a 18 µ l con l'aggiunta di acqua gratuita nucleasi. Aggiungere 2 µ l di enzima di frammentazione di dsDNA e vortice la miscela per 3 s.
   Nota: La quantità di DNA necessaria varia a seconda della concentrazione di DNA (obiettivo per 200 totali ng nel tubo).
3. Incubare i campioni a 37 ° C per 8,5 min. Quindi aggiungere 5 µ l di EDTA 0.5 M per i tubi.
   Nota: Questo passaggio deve essere eseguita, non appena il periodo di incubazione è finita per terminare la reazione e impedire l'over-tosatura di campioni di DNA.

5. bead Clean-up

1. Omogeneizzare i branelli SPRI nel Vortex.
2. Portare il volume totale del DNA tranciato a 50 µ l aggiungendo 25 µ l di acqua gratuita nucleasi. Aggiungere 45 µ l di perle di temperatura SPRI (90% del volume) a 50 µ l di DNA tranciate e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   Nota: L'aggiunta di perline al 90% del volume totale del campione viene eseguita per rimuovere il più piccolo dei frammenti di DNA, spesso di sotto di 200 paia di basi.
3. Lasciare Incubare i campioni per 5 min. mettere i tubi su una piastra magnetica e lasciarli riposare per 5 min. con attenzione rimuovere e scartare il surnatante.
   Nota: Fare attenzione per non disturbare le perle, poiché contengono gli obiettivi desiderati di DNA.
4. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 80% per i tubi mentre su supporto magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e quindi attentamente rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta. Asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è lo stand magnetico con il coperchio aperto.
   Nota: Evitare sovra le perline. Questo può provocare il recupero inferiore del DNA.
5. Rimuovere i tubi dal magnete. Eluire il DNA dalle perle in 55 µ l di 0.1 x TE e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. tubi di posto sul supporto magnetico e attendere che la soluzione al girare chiaro (~ 2 min).
6. Tirare fuori 52 µ l del surnatante. Eseguire un'analisi di quantificazione del DNA sui campioni per verificare il recupero e la concentrazione iniziale che va nella preparazione di biblioteca.
   Nota: Le librerie sono state fatte con dsDNA totale stimato a meno di 1,25 ng, però in ogni caso reamplification è stato richiesto.

6. Biblioteca preparazione

Nota: Questa è una versione modificata di un kit disponibile in commercio biblioteca (Vedi Tabella materiali protocollo).

1. Fine Prep
   1. Aggiungere 3 µ l di endonucleasi e fosfato tailing enzimi e 7 µ l di tampone di reazione di accompagnamento a 50 µ l di DNA pulito, tranciato. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Girare i tubi per rimuovere le bolle.
      Nota: Il volume totale dovrebbe essere 60 µ l.
   2. Posizionare i campioni in un termociclatore con il seguente programma: 30 min a 20 ° C, 30 min a 65 ° C, quindi tenere a 4 ° C.
      Nota: Il coperchio riscaldato è stato impostato su ≥ 75 ° C
2. Adattatore legatura
   1. Diluire l'adattatore 25 – 50 volte (lavorare concentrazione adattatore di 0,6 – 0,3 µM). Aggiungere 30 µ l di mix master legatura, 1 µ l di potenziatore della legatura e 2,5 µ l di adattatore per la sequenza di lettura breve ad alta produttività per i tubi.
      Nota: Il volume totale dovrebbe essere 93,5 µ l.
   2. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Girare i tubi per rimuovere le bolle. Incubare le provette a 20 ° C per 15 min.
   3. 3 µ l di miscela commerciale di uracile DNA glicosilasi (UDG) e il VIII endonucleasi di DNA glicosilasi-liasi (Vedi Tabella materiali) ai tubi. Assicurarsi che il volume totale è di 96,5 µ l. mescolare accuratamente e incubare a 37 ° C per 15 min utilizzando un termociclatore.
      Nota: Il coperchio deve essere impostato su ≥47 ° C. La versione originale del protocollo commerciale ha dimensioni selezione dopo la fase di legatura di adattatore, seguita da una pulizia della perla come il passaggio finale. Questo protocollo, che consente di ottenere rendimenti più elevati, passa l'ordine di questi passaggi e implementa la selezione della dimensione come un passaggio finale.
3. Pulitura per rimuovere gli enzimi e piccoli frammenti
   1. Omogeneizzare biglie magnetiche nel Vortex.
   2. Aggiungere 78 µ l di biglie magnetiche SPRI (80% del volume) e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
      Nota: L'aggiunta di perline all'80% del volume totale del campione viene eseguita per rimuovere i frammenti di DNA più piccoli, che spesso sono più corte di 250 paia di basi. La rimozione più rigorosa di piccoli frammenti di DNA è (i) rimuovere eccedenze adattatori e (ii) sottolineare l'amplificazione di frammenti più grandi nei passaggi seguenti.
   3. Lasciare che incubare i campioni per 5 min, mettere i tubi su una piastra magnetica per 5 min, attentamente rimuovere e scartare il surnatante contenente il DNA esterno all'intervallo di dimensione desiderata.
      Nota: Fare attenzione a non disturbare le perline che contengono gli obiettivi desiderati di DNA.
   4. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 80% per i tubi mentre su supporto magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e quindi attentamente rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta. Asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è lo stand magnetico con il coperchio aperto.
      Nota: Evitare l'eccessivo essiccamento le perline. Questo può provocare il recupero inferiore del DNA.
   5. Rimuovere i tubi dal magnete. Eluire il DNA bersaglio dalle perle aggiungendo 17 µ l di 0.1 x TE e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   6. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. tubi di posto sul supporto magnetico e attendere che la soluzione al girare chiaro (~ 2 min).
   7. Tirare fuori 15 µ l del surnatante.
4. Amplificazione di PCR
   1. Aggiungere 25 µ l di mix master di PCR ad alta fedeltà, 5 µ l di alto-rendimento breve lettura libreria prep 5' primer di sequenziamento e 5 µ l di alto-rendimento breve lettura sequenziamento libreria preparazione 3' primer, a 15 µ l di DNA adattatore-legati pulito.
      Nota: Il volume totale dovrebbe essere 50 µ l.
   2. Mescolare bene su Vortex. Inserire i campioni in un termociclatore usando le impostazioni si trovano nella tabella 1: impostazione di amplificazione del termociclatore.
      Nota: Un gran numero di cicli è necessario a causa della bassa quantità di DNA ingresso.

Passaggio di ciclo	Temp.	Tempo	Cicli
Denaturazione iniziale	98 ° C	30 s	1
Denaturazione	98 ° C	10 s	12
Ricottura/estensione	65 ° C	75 s	12
Estensione finale	65 ° C	5 min	1
Tenere premuto	4 ° C

Tabella 1: protocollo PCR temperature e tempi di denaturazione, ricottura ed estensione. Temperatura e tempi sono state ottimizzate per i reagenti presentati in questo protocollo. Se i reagenti sono alterati, temperature e tempi dovrebbero essere ottimizzati nuovamente.

5. Selezione della dimensione per la dimensione desiderata biblioteca
   Nota: Questo passaggio perlina rimuoverà frammenti sia sopra che sotto l'intervallo di destinazione.
   1. Omogeneizzare perline SPRI nel Vortex.
   2. Aggiungere 25 µ l (50% del volume) di biglie magnetiche temperatura ambiente e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Lasciare Incubare i campioni per 5 min. mettere i tubi su una piastra magnetica e lasciarli riposare per 5 min. con attenzione rimuovere e trasferire il surnatante in un nuovo set di provette.
      Nota: Questo volume può essere regolato sulla base dimensioni libreria desiderata. Il surnatante contiene frammenti di DNA della dimensione desiderata. Nella prima incubazione del branello, le perle sono vincolanti frammenti più grandi di biblioteca. Questi sono rimossi per concentrarsi su quelle nella gamma 400-600 paia di basi. Il surnatante contiene frammenti più piccoli.
   3. Aggiungere 6 µ l di perline SPRI temperatura surnatante e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Lasciare che incubare i campioni per 5 min. mettere i tubi su una piastra magnetica e lasciarli riposare per 5 min.
      Nota: Questo volume può essere regolato sulla base biblioteca desiderata dimensioni secondo passo 6.5.2.
   4. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante.
      Nota: Fare attenzione a non disturbare le perline che contengono il DNA desiderato. Nella seconda incubazione perlina, le perle sono vincolanti per i frammenti a sinistra dopo la rimozione iniziale del DNA più grande frammenti. Questo insieme di frammenti è solitamente nella gamma dimensione desiderata.
   5. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 80% per i tubi mentre su supporto magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s, quindi rimuovere con cautela e scartare il surnatante. Ripetere l'operazione. Asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è lo stand magnetico con il coperchio aperto.
      Nota: Evitare sovra le perline. Questo può provocare il recupero inferiore del DNA.
   6. Rimuovere i tubi dal magnete. Eluire il DNA bersaglio dalle perle in 33 µ l di 0.1 x TE e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   7. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. tubi di posto sul supporto magnetico e attendere che la soluzione al girare chiaro (~ 2 min). Tirare fuori 30 µ l del surnatante e trasferimento per provette da 2 mL (Vedi Tabella materiali) per l'archiviazione.
      Nota: Le librerie possono essere tenute a-20 ˚ c per la conservazione a lungo termine.
6. Controllo di qualità
   1. Eseguire un test di controllo qualità sulle librerie di DNA. Fare riferimento ai punti 3.1 e 3.2.
      Nota: Per le librerie di DNA, eseguire il gel per ~ 45 min a 96 V.
7. Reamplification biblioteca: opzionale se libreria quantità non è sufficiente.
   Nota: I campioni con concentrazioni di libreria inferiore a 10 nM può essere riamplificati attenendosi alla seguente procedura. Reamplification delle librerie di bassa concentrazione può raggiungere risultati praticabile per la sequenza, ma reamplification possono causare uno spostamento modesto nella diversità di composizione base, anche se raccolti dati (tabella 3) suggeriscono che questo è irrilevante per determinate metriche .
   1. Diluire i primer universale reamplification 10 volte utilizzando 0.1 x TE.
   2. Aggiungere 25 µ l di mix master di PCR ad alta fedeltà, 5 µ l di primer diluito universale reamplification 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) e 5 µ l di primer diluito universale reamplification 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) a 15 µ l di librerie di bassa concentrazione. Nota: Il volume totale dovrebbe essere a 50 µ l.
   3. Mescolare bene su Vortex. Inserire i campioni in un termociclatore usando le impostazioni si trovano nella tabella 1: impostazione di amplificazione del termociclatore
      Nota: Il gran numero di cicli è necessario a causa della scarsa quantità di DNA input.
   4. Pulitura della perla
   5. Omogeneizzare perline SPRI nel Vortex. 45 µ l di perle di temperatura SPRI (90% del volume) e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   6. Lasciate che i campioni Incubare per 5 minuti, mettere i tubi su una piastra magnetica per 5 min.
   7. Rimuovere con cautela e scartare il supernatante contenente il DNA indesiderato.
      Nota: Fare attenzione a non disturbare le perline che contengono gli obiettivi desiderati di DNA.
   8. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 80% per i tubi mentre su supporto magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s e quindi con attenzione rimuovere e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.
   9. Asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è lo stand magnetico con il coperchio aperto.
      Nota: Evitare sovra le perline. Questo può provocare il recupero inferiore del DNA bersaglio.
   10. Rimuovere i tubi dal magnete. Eluire il DNA bersaglio dalle perle in 33 µ l di 0.1 x TE e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   11. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. tubi di posto sul supporto magnetico e attendere che la soluzione al girare chiaro (~ 2 min).
   12. Tirare fuori 30 µ l del surnatante. Le librerie possono essere memorizzate a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
8. Controllo di qualità
   1. Eseguire un test di controllo qualità sulle librerie di DNA. Fare riferimento ai punti 3.1 e 3.2. Per le librerie di DNA, è possibile eseguire il gel per ~ 45 min a 96 V.
      Nota: Se una doppia fascia è visto nel gel, questo è probabilmente una conseguenza dell'esaurimento di primer dal passo di reamplification. Le bande possono essere rimossi ripetendo 6.9, ma utilizzando solo un ciclo nel programma di PCR descritto in tabella 1.

Risultati

Isolamento del DNA e la resa finale biblioteca
In questo studio, l'efficacia del protocollo per l'isolamento del DNA di erbario e al recupero delle librerie di sequenziamento di alta qualità è stata dimostrata utilizzando cinquanta diversi campioni con la più antica dal 1920 e il più giovane dal 2012 (tabella 2). Per ogni campione, circa 10 mg di tessuto fogliare è stato usato per isolamento del DNA. Più verde tessuto fogliare è stato favorito s...

Discussione

Il protocollo presentato qui è un metodo completo e robusto per isolamento del DNA e sequenziamento preparazione libreria dagli esemplari di piante essiccate. La consistenza del metodo e minima necessità di modificarla basata su esemplare qualità rendono esso scalabile per progetti di grande erbario di sequenziamento. L'inclusione di un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento permette l'inclusione di bassa qualità, quantità di basso, rara o storicamente importanti campioni che altrimenti non...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4452300	96 well
Gel Imaging System	Azure Biosystems	c300
Microfuge 20 Series	Beckman Coulter	B30137
Digital Dry Bath	Benchmark Scientific	BSH1001
Electrophoresis System	EasyCast	B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)	ELGA	89204-092
DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108078	2 ml
Mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Vortex-Genie 2	Fisher Scientific	12-812
Mortar	Fisher Scientific	S02591	porcelain
Pestle	fisher Scientific	S02595	porcelain
Centrifuge tubes	fisher Scientific	21-403-161
Microwave	Kenmore	405.7309231
Qubit Assay Tubes	Invitrogen	Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR	VWR	20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Balance	Mettler Toledo	PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage	Nalgene	F9401
Magnetic-Ring Stand	ThermoFisher Scientific	AM10050	96 well
Water Bath	VWR	89032-210
Hot Plate Stirrers	VWR	97042-754
Liquid Nitrogen	Airgas	UN1977
1 X TE Buffer	Ambion	AM9849	pH 8.0
CTAB	AMRESCO	0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL	AMRESCO	0482-200ML
Ribonuclease A	AMRESCO	E866-5ML	10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63882
Sodium Chloride	bio WORLD	705744
Isopropyl Alcohol	bio WORLD	40970004-1
Nuclease Free water	bio WORLD	42300012-2
Isoamyl Alcohol	Fisher Scientific	A393-500
Sodium Acetate Trihydrate	Fisher Scientific	s608-500
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder	Gold Biotechnology	D003-500
EDTA, Disodium Salt	IBI Scientific	IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32854
TRIS	MP Biomedicals	103133	ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)	New England BioLabs	B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England BioLabs	M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina	New England BioLabs	E7600S	Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus	Omega bio-tek	M1386-02
GelRed 10000 X	Pheonix Research	41003-1
Phenol solution	SIGMA Life Science	P4557-400ml
PVP40	SIGMA-Aldrich	PVP40-50G
Chloroform	VWR	EM8.22265.2500
Ethanol	Koptec	V1016	200 Proof
Silica sand	VWR	14808-60-7
Reamplification primers	Integrated DNA Technologies	see text
Sequencher v.5.0.1	GeneCodes