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Resumen

Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.

Resumen

Herbarios son una fuente valiosa de material vegetal que se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos. El uso de especímenes de herbario está asociado con un número de desafíos, incluyendo calidad de preservación de la muestra ADN degradado y muestreo destructivo de especímenes raros. Para utilizar más eficazmente material de herbario en proyectos grandes de la secuencia, es necesario un método confiable y escalable de ADN aislamiento y biblioteca de preparación. Este documento muestra un protocolo robusto, de principio a fin para ADN aislamiento y alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario que requieren modificación para muestras individuales. Este protocolo se adapta para baja calidad secado planta material y toma ventaja de los métodos existentes mediante la optimización de tejido pulido, modificar la selección de tamaño de la biblioteca y presentando un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento. Reamplificación de bibliotecas de ADN de bajo rendimiento puede rescatar muestras derivadas de especímenes de herbario insustituible y potencialmente valiosa, negando la necesidad de muestreo destructivo adicional y sin introducir sesgo de secuencia perceptible común aplicaciones filogenéticas. El protocolo ha sido probado en cientos de especies de gramíneas, pero se espera que sea adaptable para el uso en otros linajes de la planta después de la verificación. Este protocolo puede ser limitada por ADN muy degradado, donde fragmentos no existen en la gama del tamaño deseado, y por metabolitos secundarios presentes en un material de planta que inhiben el aislamiento de ADN limpio. En general, este protocolo presenta un método rápido y completo que permite la extracción de ADN y preparación de la biblioteca de 24 muestras en menos de 13 horas, con solo 8 h de tiempo práctica activa con modificaciones mínimas.

Introducción

Colecciones de herbario son una fuente potencialmente valiosa de especies y diversidad genómica de estudios incluyendo phylogenetics1,2,3, genética de poblaciones4,5, conservación Biología6, de la biología de las especies invasoras7y rasgo evolución8. La capacidad para obtener una rica diversidad de especies, poblaciones, regiones geográficas y momentos destaca el "tesoro"9 que es el herbario. Históricamente, la naturaleza degradada del ADN derivado de herbario ha obstaculizado los proyectos basados en PCR, a menudo relegando los investigadores a usar sólo los marcadores encontrados en copia alta, como las regiones del genoma de cloroplasto o el espaciador transcrito interno (ITS) de la ribosomal ARN. Calidad de las muestras y ADN varían ampliamente en base a métodos de conservación9,10, con las roturas de doble hebra y fragmentación de calor utilizado en el proceso de secado siendo las formas más comunes de daños, la creación de la supuesto 90% ADN calabozo que ha gravado estudios basados en PCR11. Aparte de fragmentación, lo segundo más frecuente en la genómica de herbario es contaminación, tales como que derivado de los hongos endófitos13 u hongos adquirieron post mortem después de la recolección, pero antes de montar en el herbario12, aunque este problema puede ser solucionado bioinformatically dado la derecha fungicida base de datos (véase abajo). Un problema terceros y menos común, es modificación de la secuencia a través de citosina desaminación (G→T/C/A)14, aunque se estima que bajo (~ 0,03%) en ejemplares de herbario11. Con el advenimiento de secuenciación de alto rendimiento (HTS), la cuestión de la fragmentación puede superarse con lecturas cortas y secuenciación profundidad12,15, permitiendo la adquisición de datos de nivel genómico de numerosas muestras con baja calidad ADN e incluso a veces permitiendo que todo el genoma secuencia15.

Muestras de herbario son cada vez más frecuente y son un componente más grande de proyectos filogenética16. Un reto actual de la utilización de especímenes de herbario para HTS constantemente es obtener suficiente ADN de trenzado doble, un requisito previo necesario para los protocolos de la secuencia, de numerosas especies de manera oportuna, sin necesidad de optimizar los métodos para el individuo muestras. En este documento, un protocolo para la extracción de ADN y biblioteca preparación de especímenes de herbario se demuestra que se aprovecha de los métodos existentes y modifica para permitir resultados rápidos y reproducibles. Este método permite el completo procesamiento del espécimen a una biblioteca de 24 muestras 13 h, con el tiempo práctico 8 h o 16 h, con tiempo práctica 9 h, cuando se requiere el paso de Reamplificación opcional. Proceso simultáneo de muestras más es factible, aunque el factor limitante es la centrifugadora de la capacidad y habilidad técnica. El protocolo está diseñado para requerir sólo típico equipo de laboratorio (termociclador, centrífuga y soportes magnéticos) en lugar de equipo especializado, como un nebulizador o un sonicador, para el corte de ADN.

Calidad de ADN, el tamaño de fragmento y cantidad son limitantes para el uso de ejemplares de herbario en experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Otros métodos para aislar ADN de herbario y crear bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento han demostrado la utilidad de utilizar tan poco como 10 ng de ADN16; sin embargo necesitan determinar experimentalmente el número óptimo de PCR ciclos necesarios para la preparación de la biblioteca. Esto se hace impracticable cuando tratar con muy pequeñas cantidades de viable doble trenzado DNA (dsDNA), como algunos ejemplares de herbario producen sólo suficiente ADN para la preparación de una sola biblioteca. El método presentado aquí utiliza un número de ciclos independientemente de la calidad de la muestra, por lo que no hay ADN se pierde en los pasos de optimización biblioteca. En cambio, un paso de Reamplificación se invoca cuando las bibliotecas no cumplen con los montos mínimos necesarios para la secuencia. Muchas muestras de herbario son raras y poseen poco material, lo que hace difícil justificar muestreo destructivo en muchos casos. Para contrarrestar esto, el protocolo presentado permite dsDNA entrada tamaños menos de 1.25 ng en el proceso de preparación de la biblioteca, ampliando el alcance de las muestras viables de alto rendimiento de secuenciación y minimizando la necesidad de muestreo destructivo de muestras.

El siguiente protocolo ha sido optimizado para las hierbas y probado en cientos de diferentes especies de muestras de herbario, aunque esperamos que el protocolo se puede aplicar a muchos otros grupos de plantas. Incluye un paso de recuperación opcional que puede utilizarse para salvar a baja calidad o especímenes raros. Basado en más de 200 especímenes de herbario probados, este protocolo trabaja en especímenes con entrada baja de tejido y calidad, lo que permite la preservación de especímenes raros a través de un mínimo muestreo destructivo. Aquí se demuestra que este protocolo puede proporcionar bibliotecas de alta calidad que pueden ser secuenciadas para proyectos basados en la filogenómica.

Protocolo

1. antes de que arranque

  1. Hacer fresco cetil trimetilamonio bromuro (CTAB) buffer17 añadiendo 20 g de CTAB, 10 g de polivinilpirrolidona (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL de 0,5 M etilendiaminotetracético pH ácido (EDTA) 8.0, 280,0 mL de 5 M de NaCl y 400,0 mL agua de reactivo juntos y llevar el volumen a 1 L con grado de reactivo agua. Ajustar el pH a 8.0.
    Nota: Reactivos adicionales pueden agregarse a CTAB dependiendo de compuestos secundarios de taxa individuales. Ver Allen et al. 18 para una lista completa de aditivos reactivos.
  2. Añadir 10 μl de β-mercaptoetanol por 5 mL de buffer CTAB.
    Nota: esto puede ser preparado en lotes de 50 mL y almacenado a temperatura ambiente durante 3-4 semanas.
    1. La solución CTAB en un baño de agua de 65 ° C de calor.
  3. Chill morteros y morteros en-20 ° C durante al menos 20 minutos.
  4. Etiqueta 4 sets de 2 x tubos con 2 mL de n (donde n = el número de muestras). Puesto 1 juego de tubos etiquetados en el hielo.
  5. Isopropanol frío en hielo o en un congelador de-20 ° C.
  6. Quitar granos de inmovilización reversible (SPRI) de fase sólida (véase Tabla de materiales) de la nevera y permitirles que alcancen la temperatura ambiente (por lo menos 30 min).
  7. Preparación de etanol al 80%.
  8. Seleccionar a especímenes de herbario para la extracción y recuperar ~ 1 cm2, o 10 mg, de los tejidos por muestra, preferentemente material de la hoja.

2. extracción de ADN

  1. Muela de ~ 1 cm2 de tejido herbario preseleccionadas utilizando morteros y morteros prechilled. Añadir nitrógeno líquido y arena esterilizada de 30 – 50 mg. Moler hasta que el tejido se convierte en polvo fino.
    Nota: 10 mg o más tejido es deseable, pero también menos ha trabajado en algunos casos. Una vez que el nitrógeno líquido se evapore, agregar más según sea necesario hasta que el tejido es totalmente de tierra. Otro método común para alterar las células y tejidos es el uso de una batidora de grano. Sin embargo, este método se encontró que no funciona bien para los especímenes utilizados en estos experimentos.
  2. Transferir el polvo helado en dos tubos de 2 mL (agregar no más de la mitad del volumen del tubo). Añadir 600 μl de solución CTAB tibia a cada tubo y mezclar los tubos completamente por Vortex e inversión.
    Nota: Puesto que la cantidad y calidad del material de herbario suele ser baja, realizando extracción de ADN en dos repeticiones ayuda a obtener mayores rendimientos.
  3. Incubar las muestras en un baño de agua de 65 ° C por 1 a 1,5 h, Vortex cada 15 minutos.
  4. Muestras de centrifugar a 10.000 x g por 5 min transferir el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos etiquetados (~ 500 μl). Deseche los pellets usando un procedimiento estándar de eliminación no clorados.
  5. Añada 4 μL de Rnasa A (10 mg/mL) a cada tubo y mezcle por inversión o por pipeteo. Incubar las muestras a 37 ° C en un baño de bloque o de calor durante 15 minutos.
  6. Añadir un volumen igual (~ 500 μl) de una mezcla de alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico 25:24:1 una vez que los tubos han llegado a temperatura ambiente. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo o con la inversión. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 min. traslado la capa acuosa (capa superior) a una nueva serie de tubos etiquetados (~ 400 μL). Deseche la capa orgánica en un contenedor de residuos clorado.
    Nota: Paso 2.6 puede repetirse si se esperan grandes cantidades de compuestos secundarios en material vegetal.
  7. Añadir un volumen igual (~ 400 μL) de una mezcla de alcohol cloroformo: isoamílico 24:1. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo o con la inversión. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 min. traslado la capa acuosa (capa superior) a una nueva serie de tubos etiquetados prechilled (~ 300 μL). Deseche la capa orgánica en un contenedor de residuos clorado.
  8. Añadir un volumen igual (~ 300 μL) de isopropanol prechilled y 12 μl de acetato de sodio de 2,5 M a cada tubo. Incubar las muestras a-20 ° C durante 30 – 60 min.
    Nota: Los tiempos de incubación pueden ser extendidos (hasta la incubación durante la noche), pero la calidad de DNA disminuye cuanto más tiempo se incuban las muestras.
  9. Tomar las muestras fuera del congelador y centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 minutos retiren y descarte el sobrenadante con cuidado sin perturbar el pellet. Lavar el precipitado por suspensión con etanol al 70% fresco (aproximadamente 300 – 500 μl). Para cada muestra se duplicó, consolidar las pelotillas individuales dos en uno con el acompañamiento de etanol.
    Nota: Las muestras deben consolidarse en un tubo usando etanol primero y luego proceden. No es necesario lavar por separado cada muestra con etanol.
  10. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 10 minutos, retire y descarte el sobrenadante con cuidado sin perturbar el pellet. Secar el pellet.
    Nota: Las muestras pueden secarse más rápido usando un bloque de calor seco (no exceder 65 ° C). Asegúrese de que las muestras no demasiado seca, ya que esto puede disminuir el rendimiento final del ADN.
  11. Suspender el ADN aislado en 50 μl de TE 1 x. Almacenar en el congelador de-20 ° C para almacenamiento a largo plazo o 4 ° C para su uso en la semana siguiente.

3. Control de calidad (QC)

  1. Correr un gel de agarosa para control de calidad.
    1. Preparar un buffer de borato/Tris/EDTA (TBE) de 1 x agregando 54 g Tris base, el ácido bórico 27,5 g y 3.75 g EDTA sal disódica, que el volumen total de 5 L con agua de grado reactivo.
    2. Preparar un gel de agarosa al 1% mediante la adición de 1 g agarosa a 100 mL de 1 x TBE. La solución en el microondas hasta que la agarosa no es visible. Añadir a 0.01% gel de ácido nucleico de la mancha (véase Tabla de materiales). Deje que el matraz se enfríe hasta que esté caliente al tacto. Mezclar bien por agitación. Verter la agarosa en una bandeja de gel y lo deje reposar hasta que se solidifica.
    3. Mezclar 1 μl de 6 x carga colorante, 3 μl de muestra y 2 μl de agua de grado reactivo. Cargar las muestras en el gel de la matriz, tomando nota de su pedido.
    4. Ejecutar los ejemplos de 60 a 70 min en 60 – 70 V. imagen el gel bajo luz UV con el enfoque y la exposición correcta.
      Nota: Presencia de una banda clara de alto peso molecular es una muestra de ADN de alta calidad, mientras que los borrones de transferencia generalmente indican degradación del ADN. La mayoría de especímenes de herbario son degradados.
  2. Realizar un análisis de cuantificación de dsDNA (véase tabla de materiales) para determinar la cantidad de doble trenzado DNA.
    1. Utilice 2 μl de muestra para análisis.
      Nota: Las diluciones no son necesarios para el análisis de cuantificación de material de herbario como suelen ser en cantidades mínimas. Bibliotecas exitosas se han hecho de tan sólo 1,26 ng dsDNA total de este paso.

4. DNA de corte

Nota: Esta es una versión optimizada de un comercial fragmentase bicatenario protocolo (véase Tabla de materiales).

  1. Enzima de fragmentación de dsDNA de lugar en el hielo después de Vortex 3 s.
  2. En un tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa 0,2 mL estéril, mezcla 1 – 16 μl había aislado ADN con 2 μl de tampón de reacción fragmentación de acompañamiento. Llevar el volumen total a 18 μL agua libre de nucleasa. Añadir 2 μl de enzima de fragmentación de dsDNA y agitar la mezcla de 3 s.
    Nota: La cantidad de ADN necesitada varía dependiendo de la concentración de ADN (aim 200 total de ng en el tubo).
  3. Incubar las muestras a 37 ° C 8,5 minutos. Luego añadir 5 μl de EDTA de 0,5 M en los tubos.
    Nota: Este paso debe realizarse tan pronto como el período de incubación es en terminar la reacción e impedir el exceso de corte de muestras de ADN.

5. grano de limpiar

  1. Homogeneizar las cuentas SPRI con un vórtex.
  2. Llevar el volumen total de la DNA esquilado a 50 μl añadiendo 25 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 45 μl de granos de SPRI la temperatura ambiente (90% del volumen) a 50 μl de esquilado ADN y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.
    Nota: Agregar cuentas al 90% del volumen total de la muestra se realiza para quitar el más pequeño de los fragmentos de DNA, a menudo por debajo de 200 pares de bases.
  3. Dejar las muestras incuban 5 minutos poner los tubos en una placa magnética y dejarlos reposar 5 min cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
    Nota: Tenga cuidado de no perturbar los granos, ya que contienen los blancos de DNA deseados.
  4. Añadir 200 μL de etanol al 80% fresco en los tubos en el soporte magnético. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante. Repita este paso una vez. Secar los granos para 5 min mientras que el tubo está en el soporte magnético con su tapa abierta.
    Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos. Esto puede resultar en la baja recuperación de ADN.
  5. Retirar los tubos del imán. Eluir el ADN de los granos en 55 μl de 0,1 x TE y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos tubos de lugar sobre el soporte magnético y esperar a que la solución activar claro (~ 2 minutos).
  6. Tire 52 μl del sobrenadante. Realizar un análisis de cuantificación de ADN en las muestras para comprobar la recuperación y la concentración inicial que entra en la preparación de la biblioteca.
    Nota: Las bibliotecas se han hecho con total dsDNA estima que menos de 1.25 ng, aunque en cada caso Reamplificación fue requerida.

6. Biblioteca preparación

Nota: Esta es una versión modificada de un kit de biblioteca disponibles en el mercado (ver protocolo de Tabla de materiales ).

  1. Preparación para el final
    1. Agregar 3 μl de endonucleasa y fosfato enzimas de jales y 7 μl de acompañamiento tampón de reacción de 50 μl de ADN limpio, esquilado. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo. Girar los tubos para eliminar las burbujas.
      Nota: El volumen total debe ser 60 μL.
    2. Coloque las muestras en un termociclador con el siguiente programa: 30 minutos a 20 ° C, 30 min a 65 ° C, después llevar a cabo a 4 ° C.
      Nota: Tapa calentada se estableció en ≥75 ° C
  2. Ligadura de adaptador
    1. Diluir el adaptador de 25 a 50 veces (trabajo concentración adaptador de 0.6-0.3 μm). Añadir 30 μl de la mezcla principal de ligadura, 1 μl de potenciador de ligadura y 2,5 μl de adaptador para la secuencia de lectura corta de alto rendimiento en los tubos.
      Nota: El volumen total debe ser μl 93.5.
    2. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo. Girar los tubos para eliminar las burbujas. Incubar los tubos a 20 ° C durante 15 minutos.
    3. Agregar 3 μl de la mezcla comercial de uracil ADN glicosilasa (UDG) y la DNA glicosilasa-liasa Endonuclease VIII (véase Tabla de materiales) a los tubos. Asegúrese de que el volumen total es de 96.5 μl. mezclar bien e incubar a 37 ° C durante 15 minutos utilizando un termociclador.
      Nota: La tapa debe ajustarse a ≥47 ° C. La versión original del Protocolo comercial cuenta con selección de tamaño después del paso de la ligadura de adaptador, seguido de una limpieza de grano como el paso final. Este protocolo, que logra un mayor rendimiento, cambia el orden de estos pasos e implementa la selección del tamaño como paso final.
  3. Limpieza para eliminar enzimas y pequeños fragmentos
    1. Homogeneizar los granos magnéticos con un vórtex.
    2. Añadir 78 μl de granos magnéticos de SPRI (80% del volumen) y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo.
      Nota: Agregar cuentas al 80% del volumen total de la muestra se realiza para eliminar los fragmentos de ADN más pequeños, que son a menudo menos de 250 pares de bases. El retiro más estricto de pequeños fragmentos de ADN es (i) quitar adaptadores sobrantes y (ii) enfatizar la amplificación de fragmentos más grandes en los siguientes pasos.
    3. Dejar que incuban las muestras durante 5 minutos poner los tubos en un plato magnético para 5 minutos Retire con cuidado y deseche el sobrenadante que contiene el ADN fuera del rango del tamaño deseado.
      Nota: Tenga cuidado de no molestar a los granos que contienen los blancos de DNA deseados.
    4. Añadir 200 μL de etanol al 80% fresco en los tubos en el soporte magnético. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante. Repita este paso una vez. Secar los granos para 5 min mientras que el tubo está en el soporte magnético con tapa abierta.
      Nota: Evitar el sobre secado de los granos. Esto puede resultar en la baja recuperación de ADN.
    5. Retirar los tubos del imán. Eluir el destino del ADN de los granos mediante la adición de 17 μl de TE x 0,1 y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo.
    6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos tubos de lugar sobre el soporte magnético y esperar a que la solución activar claro (~ 2 minutos).
    7. Sacar 15 μl del sobrenadante.
  4. Amplificación por PCR
    1. Añadir 25 μl de la mezcla principal de PCR de alta fidelidad, 5 μl de alto rendimiento corta lectura biblioteca prep 5' cartilla de secuenciación y 5 μl de alto rendimiento corta secuencia lectura biblioteca prep 3' cartilla, a 15 μl del ADN ligada adaptador limpieza.
      Nota: El volumen Total debe ser 50 μl.
    2. Mezclar bien todo con un vórtex. Coloque las muestras en un termociclador con la configuración que se encuentra en la tabla 1: ajuste de amplificación de termociclador.
      Nota: Un gran número de ciclos es necesaria debido a la baja cantidad de ADN de entrada.
Paso de cicloA la temperatura.TiempoCiclos de
Desnaturalización inicial98 ° C30 s1
Desnaturalización98 ° C10 s12
Recocido/extensión65 ° C75 s12
Extensión final65 ° C5 min1
Mantenga4 ° C

Tabla 1: Protocolo de PCR desnaturalización, recocido y extensión de tiempos y temperaturas. Temperatura y los tiempos fueron optimizados para los reactivos presentados en el presente Protocolo. Si los reactivos son alterados, temperaturas y tiempos deben optimizarse otra vez.

  1. Selección de tamaño para el tamaño deseado de la biblioteca
    Nota: Este paso de grano eliminará fragmentos tanto por encima como por debajo del rango de destino.
    1. Homogeneizar los granos SPRI con un vórtex.
    2. Añada 25 μl (50% del volumen) de granos magnéticos de la temperatura ambiente y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo. Dejar las muestras incuban 5 minutos poner los tubos en una placa magnética y dejarlos reposar 5 min cuidadosamente retirar y transferir el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos etiquetados.
      Nota: Este volumen puede ajustarse en base a tamaño de la biblioteca deseada. El sobrenadante contiene fragmentos de ADN del tamaño deseado. En la primera incubación de grano, los granos son vinculantes fragmentos más grandes de la biblioteca. Estos son removidos para centrarse en las de la gama de pares de 400 – 600. El sobrenadante contiene fragmentos más pequeños.
    3. Añadir 6 μl de granos de SPRI la temperatura al sobrenadante y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo arriba y abajo. Deje que las muestras incuban 5 minutos poner los tubos en una placa magnética y dejarlos reposar 5 minutos.
      Nota: Este volumen puede ajustarse en base a tamaño de la biblioteca deseada según paso 6.5.2.
    4. Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
      Nota: Tenga cuidado de no molestar a los granos que contienen el ADN deseado. En la segunda incubación de grano, los granos son vinculantes a los fragmentos a la izquierda después de la eliminación inicial de ADN más grande fragmentos. Este conjunto de fragmentos está generalmente en la gama del tamaño deseado.
    5. Añadir 200 μL de etanol al 80% fresco en los tubos en el soporte magnético. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s, luego con cuidado Remueva y descarte el sobrenadante. Repetir. Secar los granos para 5 min mientras que el tubo está en el soporte magnético con tapa abierta.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos. Esto puede resultar en la baja recuperación de ADN.
    6. Retirar los tubos del imán. Eluir el destino del ADN de los granos en 33 μl de 0,1 x TE y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo.
    7. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos tubos de lugar sobre el soporte magnético y esperar a que la solución activar claro (~ 2 minutos). Sacar 30 μL del sobrenadante y transferencia a tubos con 2 mL (véase Tabla de materiales) para el almacenamiento.
      Nota: Las bibliotecas pueden conservarse a-20 ° c para almacenamiento a largo plazo.
  2. Control de calidad
    1. Ejecutar una prueba de control de calidad en las bibliotecas de ADN. Consulte los pasos 3.1 y 3.2.
      Nota: Para las bibliotecas de ADN, correr el gel ~ 45 min a 96 V.
  3. Reamplificación de biblioteca: opcional si la cantidad de la biblioteca no es suficiente.
    Nota: Las muestras con concentraciones de biblioteca debajo de 10 nM se puede reamplificada siguiendo estos pasos. Reamplificación de bibliotecas de baja concentración puede alcanzar resultados viables para secuenciación y Reamplificación puede causar un cambio modesto en la diversidad de composición de base, aunque se reunieron datos (tabla 3) indican que esto es insignificante para ciertas métricas .
    1. Diluir los cebadores universal Reamplificación usando 10 veces 0,1 x TE.
    2. Añadir 25 μl de la mezcla principal de PCR de alta fidelidad, 5 μl de cebador de Reamplificación universal diluido 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) y 5 μl de cebador de Reamplificación universal diluido 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) a 15 μl de bibliotecas de baja concentración. Nota: Volumen Total debe estar a 50 μl.
    3. Mezclar bien todo con un vórtex. Coloque las muestras en un termociclador con la configuración que se encuentra en la tabla 1: ajuste de amplificación de Termociclador
      Nota: El gran número de ciclos es necesaria debido a la baja cantidad de ADN de entrada.
    4. Limpiar el grano
    5. Homogeneizar los granos SPRI con un vórtex. Añada 45 μl de granos de SPRI la temperatura ambiente (90% del volumen) y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo.
    6. Deje que las muestras incube durante 5 minutos, poner los tubos en una placa magnética durante 5 minutos.
    7. Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante que contiene el ADN no deseado.
      Nota: Tenga cuidado de no molestar a los granos que contienen los blancos de DNA deseados.
    8. Añadir 200 μL de etanol al 80% fresco en los tubos en el soporte magnético. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s, cuidadosamente Quite y descarte el sobrenadante. Repita este paso una vez.
    9. Secar los granos para 5 min mientras que el tubo está en el soporte magnético con su tapa abierta.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos. Esto puede resultar en menor recuperación de la blanco de la DNA.
    10. Retirar los tubos del imán. Eluir el destino del ADN de los granos en 33 μl de 0,1 x TE y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo.
    11. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos tubos de lugar sobre el soporte magnético y esperar a que la solución activar claro (~ 2 minutos).
    12. Sacar 30 μL del sobrenadante. Las bibliotecas pueden almacenarse a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  4. Control de calidad
    1. Ejecutar una prueba de control de calidad en las bibliotecas de ADN. Consulte los pasos 3.1 y 3.2. Para las bibliotecas de ADN, corren el gel ~ 45 min 96 V.
      Nota: Si se observa una doble banda en el gel, esta es probablemente una consecuencia del agotamiento de la cartilla del paso de Reamplificación. Las bandas pueden eliminarse repitiendo 6.9, pero usando sólo un ciclo en el programa PCR representado en la tabla 1.

Resultados

Aislamiento de ADN y rendimiento Final de la biblioteca
En este estudio, se demostró la eficacia del protocolo para el aislamiento de la DNA del herbario y la recuperación de las bibliotecas de la secuencia de alta calidad con cincuenta muestras diferentes la más antigua de 1920 y el más joven de 2012 (tabla 2). Para cada muestra, se utilizó aproximadamente 10 mg de tejido foliar para el aislamiento de ADN. Tejido foliar más verde se vio favoreci...

Discusión

El protocolo presentado aquí es un método integral y robusto para aislamiento de DNA y la secuencia de preparación de biblioteca de muestras de la planta seca. La consistencia del método y mínima necesidad de alterarlo según el ejemplar calidad hacen que escalable para proyectos grandes secuenciación basada en herbario. La inclusión de un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento permite la inclusión de baja calidad, baja cantidad, rara o históricamente importantes muestras qu...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Agradecimientos

Agradecemos a Taylor AuBuchon-anciano, Jordania Teisher y Kristina Zudock asistencia en ejemplares de herbario de muestreo y el jardín botánico de Missouri para el acceso a los especímenes de herbario para muestreo destructivo. Este trabajo fue el apoyo de una beca de la National Science Foundation (DEB-1457748).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porcelain
Pestlefisher ScientificS02595porcelain
Centrifuge tubesfisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologiessee text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

Referencias

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