اختﻻق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية لدراسة الانصهار بلعم

Summary

ويصف هذا البروتوكول تلفيق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية تمتز مع المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة التي يمكن استخدامها لرصد الانصهار بلعم من العينات الحية وتمكن مجهرية فائقة القرار العينات الثابتة .

Abstract

وقد تم تحدي تصور تشكيل الخلايا العملاقة مولتينوكليتيد (مجكس) من العينات الحية يرجع ذلك إلى حقيقة أن يعيش أكثر من تقنيات التصوير تتطلب نشر الضوء من خلال الزجاج، ولكن على الزجاج بلعم فيوجن حدث نادر. ويقدم هذا البروتوكول تلفيق العديد من الواجهات الزجاجية الجودة البصرية حيث يتحول امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة الزجاج في سطح فوسوجينيك. أولاً، يتم وصف إعداد الأسطح الزجاجية النظيفة كابتداء من المواد لتعديل السطح. ثانيا، ينص طريقة امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة لتحويل الزجاج غير فوسوجينيك إلى الركازة فوسوجينيك. وثالثاً، يصف هذا البروتوكول تلفيق ميكروباتيرنس السطحية التي تشجع على درجة عالية من الرقابة الزمانية المكانية على تشكيل MGC. وأخيراً، يرد اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج. وترد أمثلة لاستخدام هذا النظام الخلايا في المختبر كنموذج لدراسة الانصهار بلعم وتشكيل MGC.

Introduction

ويرافق تشكيل مجكس عددا من الحالات المرضية في جسم الإنسان المتميز بالتهاب مزمن¹. وقد أظهرت الدراسات القليلة من المستغرب على الرغم من الاتفاق الذي مونونوكليتيد الضامة الصمامات على شكل مجكس²، الانصهار في سياق مع المعيشة العينات^3،4. هذا سبب الأسطح الزجاجية النظيفة المطلوبة لمعظم تقنيات التصوير لا تعزز الانصهار بلعم عندما فعل السيتوكينات الالتهابية⁵. في الواقع، إذا كان الزجاج نظيفة كركيزة للانصهار بلعم، ثم منخفضة للأهداف المتوسطة التكبير (أي، 10-20 X) وأكثر من 15 ح المستمر غالباً ما مطلوبة تصوير الاحتفال بحدث واحد انصهار.

في اليد، والأسطح البلاستيكية فوسوجينيك (مثلاً، بيرمان) أو البلاستيك الصف البكتريولوجية الأخرى تعزيز الانصهار². بيد أن التصوير من خلال البلاستيك يثير إشكالية لأن الركيزة سميكة وينثر الضوء. وهذا يزيد من تعقيد التصوير منذ فترة طويلة عامل المسافة (LWD) أهداف مطلوبة. ومع ذلك، عادة ما يكون أهداف LWD الإضاءة الخافتة جمع القدرات مقارنة بنظيرتها ساترة لتصحيح. علاوة على ذلك، تقنيات استغلال التغييرات في القطبية للضوء الذي يمر من خلال العينة مثل التدخل التفاضلية على النقيض من المستحيل نظراً للبلاستيك بيريفرينجينت. العوائق المرتبطة باستخدام البلاستيك هي أكدت حقيقة أن من المستحيل التنبؤ بحيث يحدث تشكيل الانصهار/MGC بلعم على السطح. معا، هذه القيود تحد من تصور الانصهار بلعم إلى مرحلة التباين البصريات، تمديد المدد التصوير الكلي (> 15 ساعة متواصلة)، ودقة منخفضة.

وقد حددنا مؤخرا سطح زجاج فوسوجينيك العالية أثناء إجراء الفحص المجهري جزيء واحد سوبر القرار مع الضامة الثابتة/مجكس⁴. هذه الملاحظة كان مفاجئاً نظراً لتنظيف زجاج الأسطح تعزيز الانصهار بمعدل منخفض جداً ~ 5% بعد 24 ساعة حضور انترلوكين-4 (إيل-4) كما تحددها الانصهار مؤشر⁴. لقد وجدنا أن القدرة على تعزيز الانصهار كان بسبب التلوث أوليميدي. أدلى الامتزاز أوليميدي أو مركبات أخرى وبالمثل الوارد الهيدروكربونات سلسلة طويلة فوسوجينيك الزجاج. فوسوجينيك معظم مجمع (شمع البارافين) ميكروباتيرنيد، وهو إضفاء درجة عالية من السيطرة الزمانية المكانية على الانصهار بلعم وإلى زيادة إضعاف في عدد الأحداث الانصهار لاحظ داخل نفس المقدار من الوقت مقارنة مع بيرمان. وقدمت هذه السطوح البصرية الجودة أول لمحة في الخصائص المورفولوجية والحركية التي تحكم تشكيل مجكس في العينات الحية.

في هذا البروتوكول وصف نحن تصنيع مجموعة متنوعة من الواجهات الزجاجية التي يمكن استخدامها لرصد تشكيل مجكس من العينات الحية. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن هذه الأسطح قابلة لتقنيات حل فائقة بعيدة الميدانية. تلفيق السطحية يعتمد على هدف التجربة، وهو وصف كل سطح مع الأمثلة ذات الصلة في نص الدعوى.

Protocol

وافق الإجراءات التي تستخدم الحيوانات بالعناية بالحيوان واستخدام اللجان في عيادة مايو كلينيك ومجمع البحوث جانيليا، وجامعة ولاية أريزونا.

1. إعداد تغطية حمض تنظيف الزجاج

ملاحظة: قد لا تكون تغطية الزجاج التي تم شراؤها من العديد من الشركات المصنعة نظيفة كما هو متوقع. النظر بشكل روتيني التنظيف دفعات زجاج غطاء قبل أي إجراء وتشارك فيها الفحص المجهري.

1. شراء الزجاج غطاء صرامة عالية. عناية خاصة لاختيار سمك الصحيح (0.15 أو 0.17 ملم).
   ملاحظة: اختيار سمك الغطاء الزجاج اعتماداً على الهدف المجهر ويتم سرد مباشرة على برميل موضوعية.
2. احتضان الزجاج غطاء في حمض الهيدروكلوريك 12 مترا في غطاء الأبخرة كيميائية جيدة التهوية ح 1 مع سونيكاتيون (42 كيلو هرتز، 70 ث). كرر هذه الخطوة لمرتين إضافية مع طازجة 12 M HCl.
3. ملء كوب منفصلة مع الماء عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
4. احتضان الزجاج غطاء في الأسيتون النقي في غطاء كيميائية جيدة التهوية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة لأوقات إضافية اثنين.
5. ملء كوب منفصلة مع الماء المعقم عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
6. احتضان الزجاج غطاء في الكحول الاثيلي 100% في غطاء كيميائية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة مرتين إضافية.
   ملاحظة: من المهم نقاء الكحول الاثيلي. الملوثات في شكل المواد الصلبة الذائبة سوف يجف على الزجاج، ويمكن تعزيز الانصهار بلعم.
7. للتخزين على المدى الطويل، مكان الزجاج غطاء تنظيف حمض في حاوية مليئة بالكحول الاثيلي النقي. وبدلاً من ذلك، جاف الزجاج غطاء مع غاز النيتروجين ومخزن في مجفف فراغ.

2-إعداد السطوح البصرية فوسوجينيك الجودة

1. حل خالية من [دمس] شمع البارافين نقطة انصهار عالية في التولوين عالي النقاوة.
   ملاحظة: تركيزات الأسهم مصنوعة في 10 ملغ/مل، والمخفف 1:9 في التولوين عالي النقاوة جعل 1 ملغ/مل حل عملي.
   تنبيه: تولوين ينبغي التعامل معها بعناية تناسليا. التخلص من التولوين وفقا لخطة النظافة الكيميائية المؤسسية.
2. تطبيق البرافين يعمل حل لجفاف تنظيف حمض تغطية زجاج في وحدة تخزين التي تغطي بشكل متساو على سطح الزجاج. صب حل الزائدة والزجاج غطاء مع غاز النيتروجين أو الهواء الجاف. لإعداد الجزء الأكبر، استخدام جرة كوبلين مصممة لاستيعاب زجاج الغطاء.
3. تلميع الزجاج غطاء 3 جلدات في المحور س، وبعد 3 جلدات في المحور y مع مسح خالية من الوبر (انظر الجدول للمواد).
4. فورا قبل إجراء التجربة، يغسل زجاج الغطاء بالماء عالي النقاوة العقيمة، ولاحقا تعقيم لمدة 15-30 دقيقة مع الأشعة فوق البنفسجية في غطاء سلامة بيولوجية. وبدلاً من ذلك، تعقيم الزجاج غطاء تشعيع جاما أو أكسيد الإثيلين.

3-ميكروباتيرنينج الهيدروكربونية المحتوية على مركبات قصر الانصهار لمناطق محددة سلفا

1. الجاف لتنظيف حمض تغطية الزجاج وشل الزجاج على سطح مستو.
2. استخدام الملقط، تزج بعناية شبكة نقل الذهب مكتشف مجهر الإلكتروني في إيجاد حل عملي ل compound(s) الهيدروكربونية. اختر مركب هيدروكربون يفي بالهدف النهائي لهذه التجربة (انظر الجدول 1). فتيلة الحل الزائدة بعيداً بلطف التنصت على الشبكة على ورق الترشيح، وفورا بوضع الشبكة في مركز الزجاج غطاء. تسمح التولوين لتجف لمدة 2 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
3. تأكد من الشبكة هو الرهينة للزجاج بعكس الزجاج بلطف. إذا كانت الشبكة يفصل كرر الخطوة 3.2 استخدام زجاج غطاء جديد.
   ملاحظة: إذا لم يتوفر بلازما أنظف، حذف الخطوة 3.4.
4. بلازما تنظيف زجاج الغطاء بالعلاج بالبلازما الغاز فراغ.
   ملاحظة: الشبكة الباحث يعمل كقناع لحماية السطح الأساسي تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة من البلازما. يتم تقديمها في المناطق التي لا تحميها الشبكة غير فوسوجينيك بالتعرض للبلازما. وينبغي تحديد مقدار الوقت الزجاج غطاء فضح للبلازما تجريبيا.
5. استخدام الملقط نصيحة الجميلة، بعناية إزالة الشبكة من سطح الزجاج لفضح ميكروباتيرن.

4-اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج

1. حفر حفرة دائرية 6-10 مم في الجزء السفلي من البلاستيك 35 ملم طبق بيتري استخدام مثقاب خطوة.
   ملاحظة: من الضروري استخدام مثقاب خطوة لإنشاء حواف ناعمة. إذا كانت حواف خشنة للغاية، وسوف لا السندات الزجاج غطاء شقة إلى الجزء السفلي من الطبق. الأسطح المسطحة ناقص من صعوبة الفحص المجهري.
2. المزيج بعناية وديغا سيليكون الاستومر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (أي، بولي دايمثيل سيلوكسان؛ PDMS).
3. تطبيق طلاء رقيقة من الاستومر فقط قريب من الحافة (أي، وقصر) الحفرة.
   ملاحظة: يجب أن تظهر الاستومر فرقة مستمرة رغم رقيقة المحيطة بالحفرة.
4. بلطف تطبيق الزجاج غطاء فوسوجينيك (كما هو موضح في القسم 2)، أو الزجاج الجافة غطاء تنظيف حمض (كما هو موضح في القسم 1) على الطبق من أجل تغطية الحفرة محاطة الاستومر. ضمان أن الزجاج غطاء يظهر تدفق مع الجزء السفلي من الطبق ويمتد خارج قطر الحفرة حيث يكون جزء كبير من الزجاج على اتصال بالبلاستيك. علاج الاستومر واسطة الخبز عند 50 درجة مئوية ح 2-3.
5. إذا كان الزجاج فوسوجينيك المفضل، الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الخلايا طبق والثقافة وفقا للبروتوكولات القياسية. ومع ذلك، إذا كان ميكروباتيرن المفضل، انتقل إلى الخطوة 3.2 لإعداد ميكروباتيرن (البلازما الغاز المستخدمة أثناء ميكروباتيرنينج يعقم الطبق والأزواج PDMS بشدة للزجاج).

5-جمع الضامة أثارت ثيوجليكولاتي

1. حقن الفئران C57BL/6 8 عاماً في الأسبوع مع 0.5 مل محلول معقم من ثيوجليكولاتي 4% بروير كما هو موضح سابقا^3،،من⁴⁶.
2. الاثنتين والسبعين ساعة في وقت لاحق، euthanize الحيوان طبقاً للرعاية الحيوانية المعتمدة واستخدام المبادئ التوجيهية، وجمع الضامة البريتوني الغسل مع المالحة المثلج مخزنة الفوسفات وتستكمل مع اتهيلينيديامينيتيتراسيتاتي 5 مم.
3. الطرد المركزي الضامة في 300 غرام x لمدة 3 دقائق وريسوسبيند في 1 مل DMEM:F12 وتستكمل مع 15 ملم حبيس، 10% FBS، و 1% المضادات الحيوية (مستنبت).
   ملاحظة: يتم عد الخلايا لاحقاً مع هيموسيتوميتير نويباور. الضامة المخفف بتركيز مناسب وتطبيقها على السطوح. عدد الخلايا لتطبيقه على سطح معين ينبغي ستنظر بعناية المحقق غرض مسألة تجريبية. التشاور مع المعايير المعروفة في الأدب الأساسي.
4. بعد 30 دقيقة تغسل السطوح بحبس وتستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1% إزالة الخلايا غير ملتصقة، واستبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة. العودة الثقافات للحاضنة (5% CO₂ في الهواء عند 37 درجة مئوية).
5. نضح المتوسطة 2 ح في وقت لاحق، واستبدل بالثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10 نانوغرام/مل إيل-4. صورة الخلايا كما هو موضح في مكان آخر من⁴.

النتائج

البارامترات الفيزيائية للمواد آثاراً مأساوية على مدى بلعم فيوجن^7،،من^89،10. وعلاوة على ذلك، من المعروف الملوثات السطحية لتعزيز الانصهار بلعم¹¹. ولذلك، من المهم نظيفة للبدء بتغطية الزجاج كع?...

Discussion

الحاجة إلى تحديد ووضع بعد ذلك الأسطح الزجاجية الجودة البصرية التي تعزز الانصهار بلعم تنبع من حقيقة أن تصور بلعم الانصهار في الإطار العيش حتى لا نشرت مؤخرا دراسة مباشرة العينات^{3، 4}. وهذا يرجع إلى أن فوسوجينيك الأسطح البلاستيكية التي تستخدم عادة تتطلب أهداف L...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PCD-32G
Finder grid	Electron microscopy sciences	G400F1-Au	any gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)	Thor Labs	CG15CH	use only high stringency cover glass
Paraffin wax	Sigma Aldrich	17310
Petrolatum	Sigma Aldrich	16415	must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide	Sigma Aldrich	O2136	prepare fresh
Isopropanol	Sigma Aldrich	278475
Toluene	Sigma Aldrich	244511
Acetone	VWR International	BDH1101
Ethanol	Electron microscopy sciences	15050	use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid	Fischer Scientific	A144C-212	use to acid wash cover glass
Slyguard 184	VWR International	102092-312	mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish	Santa Cruz Biotech	sc-351864
Dumont no. 5 forceps	Electron microscopy sciences	72705	ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS	Atlanta Biological	S11550
DMEM:F12	Corning	10-092	contains 15 mM HEPES
Pen/Strept	Corning	30-002-Cl
HBSS	Corning	21-023
BSA solution	Sigma Aldrich	A9576	use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4	Genscript	Z02996	aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice	n/a	n/a	use for live fluorescence imaging
Kimwipe	Kimberly Clark	34155	use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces