Realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica per studiare macrofago Fusion

Riepilogo

Questo protocollo descrive la realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica adsorbito con composti contenenti idrocarburi a catena lunga che possono essere utilizzati per monitorare la fusione del macrofago di esemplari vivi e consente la microscopia di Super-risoluzione di campioni fissati .

Abstract

Visualizzare la formazione di cellule giganti multinucleated (MGCs) da esemplari viventi è stato impegnativo per il fatto che richiedono tecniche di imaging più diretta propagazione della luce attraverso il vetro, ma il vetro fusione del macrofago è un evento raro. Questo protocollo presenta la realizzazione di diverse superfici di vetro di qualità ottica dove adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga trasforma il vetro in una superficie di fusogena. In primo luogo, la preparazione delle superfici di vetro pulito come materiale di partenza per modifica di superficie è descritto. In secondo luogo, viene fornito un metodo per l'adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga per convertire non fusogena vetro in un substrato fusogena. In terzo luogo, questo protocollo descrive la fabbricazione di superficie microfantasie che promuovono un alto grado di controllo spatiotemporal sopra formazione MGC. Infine, fabbricando piatti di vetro inferiore è descritto. Vengono illustrati esempi di utilizzo di questo sistema di cellule in vitro come un modello per studiare la fusione del macrofago e formazione MGC.

Introduzione

La formazione di MGCs accompagna un numero di stati patologici del corpo umano caratterizzata da infiammazione cronica¹. Nonostante l'accordo che mononucleate macrofagi si fondono per formare MGCs², sorprendentemente pochi studi hanno dimostrato la fusione nel contesto con soggiorno esemplari^3,4. Questo è perché le superfici di vetro pulito che sono necessari per la maggior parte delle tecniche di imaging non promuovono la fusione del macrofago quando indotta da citochine infiammatorie⁵. Infatti, se vetro pulito è usato come substrato per la fusione dei macrofagi quindi bassa e obiettivi intermedi ingrandimento (cioè, 10-20x) e più di 15 h di continuo imaging spesso sono tenuti a osservare un evento unico di fusione.

Sulla mano, fusogena superfici plastiche (ad esempio, permanox) o plastica di qualità batteriologica promuovere fusion². Tuttavia, imaging attraverso plastica è problematica perché il substrato è spesso e disperde la luce. Questo complica di imaging poiché obiettivi di lungo lavoro distanza (LWD) sono richiesti. Tuttavia, gli obiettivi LWD hanno solitamente bassa capacità rispetto alla loro controparte vetrino coprioggetti-corretta di raccolta della luce. Inoltre, tecniche che sfruttano le modifiche nella polarità della luce che passa attraverso il campione come contrasto differenziale di interferenza sono impossibili, dato che la plastica è birifrangente. Le barriere associate all'uso di plastica sono ulteriormente sottolineate dal fatto che è impossibile prevedere dove si verificheranno formazione fusion/MGC del macrofago sulla superficie. Insieme, queste limitazioni limitano la visualizzazione di fusione dei macrofagi all'ottica di contrasto di fase, estesa totale imaging durate (> 15 ore continue) e bassa risoluzione.

Recentemente abbiamo identificato una superficie di vetro altamente fusogena durante lo svolgimento di microscopia di singola molecola super risoluzione con macrofagi fisso/MGCs⁴. Questa osservazione è stato sorprendente, perché pulire vetro superfici promuovono fusione al tasso molto basso di ~ 5% dopo 24 h in presenza di interleuchina-4 (IL-4) come determinato dalla fusione di indice⁴. Abbiamo trovato che la capacità di promuovere la fusione era dovuto contaminazione oleamide. Adsorbimento di oleamide o altri composti che similmente contenuto idrocarburi a catena lunga fatta il fusogena di vetro. La maggior parte fusogena composto (paraffina) era bioerodibili e impartito un alto grado di controllo spatiotemporal fusione del macrofago e un aumento di 2 volte del numero di eventi di fusione osservato entro la stessa quantità di tempo rispetto alla permanox. Queste superfici di qualità ottica fornito il primo assaggio nelle caratteristiche morfologiche e cinetica che presiedono alla formazione di MGCs in esemplari viventi.

In questo protocollo Descriviamo la fabbricazione di una varietà di superfici di vetro che può essere utilizzato per monitorare la formazione di MGCs da esemplari viventi. Inoltre, ci mostra che queste superfici sono favorevoli alle tecniche di Super-risoluzione campo lontano. Montaggio superficiale dipenda l'obiettivo dell'esperimento, e ogni superficie è descritta con gli esempi correlati nel testo procedere.

Protocollo

Le procedure che utilizzano gli animali sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la Mayo Clinic, Campus di ricerca Janelia e Arizona State University e cura degli animali.

1. preparazione acido-puliti vetro di copertura

Nota: vetro di copertura acquistato da molti produttori non siano pulite come previsto. Considera ordinariamente pulizia lotti di vetro di copertura prima di qualsiasi procedura cui microscopia è coinvolto.

1. Acquisto di vetro di copertura di alto rigore. Prestare particolare attenzione a scegliere lo spessore corretto (0.15 o 0,17 mm).
   Nota: La scelta di spessore di vetro di copertura dipende l'obiettivo del microscopio ed è elencata direttamente sul barilotto dell'obiettivo.
2. Incubare il vetro di copertura di 12 M di acido cloridrico in una cappa chimica ben ventilato per 1 h con sonicazione (42 kHz, 70 W). Ripetere questo passaggio per altre due volte con fresco 12 M HCl.
3. Riempire un becher separato con acqua ultrapura e aggiungere il vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura per 5-10 min in una cappa chimica ben ventilata. Ripetere questo passaggio dieci volte.
4. Incubare il vetro di copertura in acetone puro in una cappa chimica ben ventilata per 30 min con sonicazione. Ripetere questo passaggio per altre due volte.
5. Riempire un becher separato con acqua ultrapura sterile e aggiungere il vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura per 5-10 min in una cappa chimica ben ventilata. Ripetere questo passaggio dieci volte.
6. Incubare il vetro di copertura in alcool etilico al 100% in una cappa chimica per 30 min con sonicazione. Ripetere questo passaggio due volte.
   Nota: La purezza dell'alcole etilico è importante. Contaminanti in forma di solidi dissolti si secca sul vetro e possono promuovere la fusione dei macrofagi.
7. Per l'archiviazione a lungo termine, è necessario posizionare il vetro di copertura acido-puliti in un contenitore riempito con alcool etilico puro. In alternativa, asciugare il vetro di copertura con gas azoto e conservare in un essiccatore sotto vuoto.

2. preparazione delle superfici fusogena ottico-qualità

1. Sciogliere privo di DMSO sovrafusione punto paraffina in toluene ultrapura.
   Nota: Concentrazioni di Stock sono fatti a 10 mg/mL e sono diluiti 1:9 in toluene ultrapura per rendere un 1 mg/mL soluzione di lavoro.
   Attenzione: Toluene dovrebbe essere maneggiati con cura come un teratogeno. Smaltire il toluene secondo il piano di igiene chimica istituzionale.
2. Applicare la paraffina soluzione per un vetro di copertura acido-puliti a secco di lavoro ad un volume che copre in modo uniforme sulla superficie del vetro. Decantare la soluzione in eccesso e asciugare il vetro di copertura con gas azoto o aria. Per la preparazione di massa, è necessario utilizzare una vaschetta di Coplin progettato per ospitare il vetro di copertura.
3. Lucidare il vetro di copertura da 3 colpi nell'asse x e successiva da 3 colpi sull'asse y con un panno privo di lanugine (Vedi Tabella materiali).
4. Immediatamente prima che l'esperimento è condotto, lavare il vetro di copertura con acqua ultrapura sterile e successivamente sterilizzare per 15-30 min con luce ultravioletta in una cappa di sicurezza biologica. In alternativa, è possibile sterilizzare il vetro di copertura da irradiazione di etilene ossido o gamma.

3. Micropatterning idrocarburi contenenti composti di limitare la fusione a predeterminati regioni

1. Asciugare il vetro di copertura acido-puliti e immobilizzare il vetro su una superficie piana.
2. Con attenzione usando il forcipe, immergere una griglia di finder oro trasmissione microscopia elettronica in una soluzione di lavoro degli idrocarburi presenti. Scegliere un idrocarburo composto che soddisfi l'obiettivo finale dell'esperimento (Vedi tabella 1). Stoppino via soluzione in eccesso battendo delicatamente la griglia su carta da filtro e immediatamente inserire la griglia al centro del coperchio vetro. Consentire il toluene ad asciugare per 2 minuti prima di procedere al passaggio successivo.
3. Assicurarsi che la griglia è incollata al vetro capovolgendo delicatamente il vetro. Se la griglia si stacca ripetere il punto 3.2 utilizzando una nuova copertura in vetro.
   Nota: Se un plasma cleaner non è disponibile, omettere il punto 3.4.
4. Al plasma pulire il vetro di copertura dal trattamento con plasma gas vuoto.
   Nota: La griglia di finder agisce come una maschera per proteggere la superficie sottostante adsorbita con idrocarburi a catena lunga dal plasma. Le regioni che non sono protetto da griglia sono resi non-fusogena tramite l'esposizione al plasma. La quantità di tempo che il vetro di copertura è esporre al plasma dovrebbe essere determinata empiricamente.
5. Forcipe ammenda-punta, rimuovere delicatamente con la griglia dalla superficie del vetro per esporre il micropattern.

4. realizzazione di piatti di vetro inferiore

1. Praticare un foro circolare di 6-10 mm nella parte inferiore di un 35 mm plastica utilizzando una punta di trivello di passaggio di Petri.
   Nota: È fondamentale utilizzare un trapano passo per creare bordi lisci. Se i bordi sono troppo agitati, il vetro di copertura non legherà piatta verso il basso del piatto. Superfici non perfettamente piane rendono difficile la microscopia.
2. Con attenzione mescolare e degassare elastomero di silicone secondo le istruzioni del produttore (cioè, polidimetilsilossano; PDMS).
3. Applicare un sottile strato di elastomero solo prossima al bordo della (vale a dire, che circoscrive) il foro.
   Nota: L'elastomero dovrebbe apparire come una banda continua seppur sottile che circonda il buco.
4. Applicare delicatamente il vetro di copertura fusogena (descritto nella sezione 2) oppure il secco vetro di copertura acido-puliti (descritto nella sezione 1) al piatto al fine di coprire il foro circondato da elastomero. Assicurarsi che il vetro di copertura appare allineato al margine inferiore del piatto e si estende oltre il diametro del foro in modo che una parte notevole del vetro è a contatto con la plastica. Curare l'elastomero da forno a 50 ° C per 2-3 h.
5. Se il vetro fusogena è comodo, UV sterilizzare le celle piatto e cultura secondo protocolli standard. Tuttavia, se un micropattern è preferito, procedere al passaggio 3.2 per la preparazione di micropattern (il plasma di gas usato durante micropatterning sterilizza il piatto e fortemente coppie PDMS al vetro).

5. raccolta tioglicolato-suscitata macrofagi

1. Iniettare topi C57BL/6 8-week-old con 0,5 mL di soluzione sterile di tioglicolato di 4% Brewer come precedentemente descritto^3,4,6.
2. Settantadue ore dopo, eutanasia animale secondo la cura degli animali approvato e utilizzare indicazioni e raccogliere macrofagi di lavaggio peritoneale con soluzione salina tampone fosfato ghiacciata completato con acido etilendiamminotetraacetico 5 mM.
3. Centrifugare i macrofagi a 300 x g per 3 min e risospendere in 1 mL di DMEM:F12 completati con 15 mM HEPES, 10% FBS e 1% antibiotici (terreno di coltura).
   Nota: Le cellule sono contati successivamente con un emocitometro Neubauer. I macrofagi sono diluiti alla concentrazione appropriata e applicati alle superfici. Il numero di celle da applicare ad una determinata superficie dovrebbe essere attentamente considerato dallo sperimentatore allo scopo la questione sperimentale. Consultare standard noti nella letteratura primaria.
4. Dopo 30 min lavare le superfici con HBSS completati con 0.1% BSA per rimuovere cellule non aderenti e sostituire con terreno di coltura fresco. Riporre le culture nell'incubatore (5% CO₂ nell'aria a 37 ° C).
5. 2 ore più tardi, aspirare il mezzo e sostituire con cultura supplementato con 10 ng/mL di IL-4. Immagine le celle come descritto altrove⁴.

Risultati

Parametri fisico-chimici dei materiali hanno effetti drammatici sulla portata del macrofago fusion^7,8,9,10. Inoltre, i contaminanti di superficie sono conosciuti per promuovere macrofago fusione¹¹. Pertanto, è importante iniziare con pulito vetro di copertura come controllo negativo per la fusione del macrofago. Quando pulite come descri...

Discussione

La necessità di identificare e successivamente sviluppare superfici di vetro di qualità ottica che promuovono la fusione del macrofago derivava dal fatto che fino a Studio non pubblicato di recente direttamente visualizzate fusione del macrofago nel contesto di vita esemplari^{3, 4}. Questo è dovuto al fatto che fusogena superfici di plastica che sono comunemente usate richiedono obiettivi LWD e sono in gran parte limitate a ottica di contrasto di fase. Questi o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PCD-32G
Finder grid	Electron microscopy sciences	G400F1-Au	any gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)	Thor Labs	CG15CH	use only high stringency cover glass
Paraffin wax	Sigma Aldrich	17310
Petrolatum	Sigma Aldrich	16415	must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide	Sigma Aldrich	O2136	prepare fresh
Isopropanol	Sigma Aldrich	278475
Toluene	Sigma Aldrich	244511
Acetone	VWR International	BDH1101
Ethanol	Electron microscopy sciences	15050	use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid	Fischer Scientific	A144C-212	use to acid wash cover glass
Slyguard 184	VWR International	102092-312	mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish	Santa Cruz Biotech	sc-351864
Dumont no. 5 forceps	Electron microscopy sciences	72705	ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS	Atlanta Biological	S11550
DMEM:F12	Corning	10-092	contains 15 mM HEPES
Pen/Strept	Corning	30-002-Cl
HBSS	Corning	21-023
BSA solution	Sigma Aldrich	A9576	use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4	Genscript	Z02996	aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice	n/a	n/a	use for live fluorescence imaging
Kimwipe	Kimberly Clark	34155	use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces