대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작

요약

이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .

초록

Multinucleated 거 대 한 세포 (MGCs)의 형성을 시각화 하는 살아있는 표본에서 가장 라이브 이미징 기술이 필요로 유리를 통해, 빛의 전파 이지만 유리에 대 식 세포 융합 드문 이벤트는 사실 때문 도전 하고있다. 이 프로토콜 제공 여러 품질 광학 유리 표면의 제조 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착 fusogenic 표면으로 유리를 변환 합니다. 첫째, 표면 개 질에 대 한 자료를 시작으로 깨끗 한 유리 표면 준비 설명 되어 있습니다. 둘째, fusogenic 기판에 변환 비 fusogenic 유리 하 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 셋째,이 프로토콜 spatiotemporal 제어할 MGC 형성의 높은 학위를 홍보 하는 표면 micropatterns의 제작을 설명 합니다. 마지막으로, 유리 하단 요리 조작 설명 되어 있습니다. 시스템의 사용이 체 외에서 세포 대 식 세포 융합, MGC 형성 연구 모델의 예로 표시 됩니다.

서문

MGCs의 대형 다양을 한 만성 염증¹고유 인체에 병 적인 상태를 동반 한다. 계약 형태 MGCs²mononucleated 세포 융합에 불구 하 고 의외로 몇 연구 퓨전 생활 맥락에서 표본^3,4. 이 때문에 대부분의 이미징 기법에 필요한 깨끗 한 유리 표면 염증 성 cytokines⁵에 의해 유도 된 때 대 식 세포 융합을 촉진 하지 않습니다. 실제로, 깨끗 한 유리 사용 하는 경우는 기질으로 대 식 세포 융합, 다음에 대 한 중간 확대 목표 (즉, 10-20 X) 하의 연속 이상 15 h 낮은 이미징 종종 필요 단일 퓨전 이벤트를 관찰 합니다.

다른 손, fusogenic 플라스틱 표면 (예를 들어, permanox) 또는 세균 학년 플라스틱에 퓨전²홍보. 그러나, 플라스틱을 통해 영상 이므로 문제가 기판 두께 이며 빛을 없앤다. 이 긴 작업 거리 (LWD) 목표는 필요한 이후 이미징 복잡. 그러나, LWD 목표는 일반적으로 낮은 조명 coverslip 수정 그들의 대응에 비해 용량 수집 있다. 또한, 미분 간섭 명암 등 견본을 통과 하는 빛의 극성에 변화를 악용 하는 기법 없습니다 가능한 플라스틱 birefringent 이므로. 플라스틱의 사용과 관련 된 장벽은 대 식 세포 융합/MGC 형성 표면에 발생 합니다 예측할 수는 없습니다는 사실에 의해 더 강조 된다. 함께, 이러한 제한 제한 단계 대조 광학, 총 이미징 기간 연장에 대 식 세포 융합의 시각화 (> 15 연속 시간), 그리고 낮은 해상도.

우리는 최근 고정 세포/MGCs⁴단일 분자 슈퍼 해상도 현미경을 수행 하는 동안 매우 fusogenic 유리 표면을 식별. 이 관찰 했다 유리 청소 때문에 외 표면 촉진의 매우 낮은 속도로 퓨전 ~ 5% 후 인터 루 킨-4 (IL-4) 융해에 의해 결정 된 대로 존재 24 h 색인⁴. 우리는 발견 퓨전 홍보 용량 oleamide 오염 때문. Oleamide 또는 유사 하 게 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 다른 화합물의 흡착 유리 fusogenic를 했다. 대부분 fusogenic 화합물 (파라핀 왁 스) micropatterned, 고 대 식 세포 융합 및 융합 이벤트는 같은 시간 내에 permanox에 비해 관찰 수에 2-fold 증가 spatiotemporal 제어의 높은 학위를이 수 있습니다. 이러한 광학 품질 서피스 형태 기능 및 생활 표본에서 MGCs의 형성을 제어 하는 활동으로 첫 번째 엿볼 제공.

이 프로토콜에 우리 살아있는 표본에서 MGCs의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 유리 표면의 다양 한의 제작을 설명 합니다. 또한, 우리는 이러한 서피스는 의무가 멀리 필드 슈퍼 해상도 기법을 보여줍니다. 표면 제작, 실험의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 각 표면 진행 텍스트에 관련 된 예제와 함께 설명.

프로토콜

동물을 사용 하는 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 메이 요 클리닉, Janelia 연구 캠퍼스와 애리조나 주립 대학에 의해 승인 되었다.

1. 준비 산 청소 커버 유리

참고: 많은 제조 업체에서 구입 하는 커버 유리 예상 대로 깨끗 한 않을 수 있습니다. 현미경은 관여 하는 모든 프로시저 앞 커버 유리의 일괄 처리를 정기적으로 청소 하십시오.

1. 높은 엄중 커버 유리를 구입. 정확한 두께 (0.15 또는 0.17 m m)을 선택 하려면 특별 한 주의 분리 했습니다.
   참고: 커버 유리 두께의 선택은 현미경 목표에 따라 달라 집니다 그리고 객관적인 배럴에 나열 됩니다.
2. 커버 유리 쥡니다 (42 kHz, 70 W)와 1 시간에 대 한 환기가 화학 증기 두건에서 12 M 염 산에서 품 어. 신선한 12 M HCl와 함께 두 개의 추가 시간에 대 한이 단계를 반복 합니다.
3. 초순 수로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.
4. 순수한 아세톤 쥡니다와 30 분에 대 한 환기가 화학 후드에 덮개 유리를 품 어. 두 개의 추가적인 시간 동안이 단계를 반복 합니다.
5. 불 임 초순 물으로 별도 비 커를 커버 유리를 추가. 환기가 화학 후드 5-10 분에 대 한 커버 유리 sonicate 10 번이이 단계를 반복 합니다.
6. 100% 에틸 알코올 쥡니다와 30 분 동안 화학 후드에서에 덮개 유리를 품 어. 두번 추가이 단계를 반복 합니다.
   참고: 에틸 알콜의 순수성이 중요 합니다. 녹은 고체의 형태로 오염 물질 유리에 건조 것입니다 고 대 식 세포 융합을 승진 시킬 수 있다.
7. 장기 저장에 대 한 순수한 에틸 알코올로 가득 컨테이너에 산 성 청소 커버 유리를 놓습니다. 또는 커버 유리 질소 가스와 진공 desiccator에서 건조.

2. 품질-Fusogenic 광학 표면 준비

1. DMSO 무료 분해 초순 톨루엔에 포인트 파라핀 왁 스 높은 녹는.
   참고: 주식 농도가 10 mg/mL에서 있으며 희석된 1:9 1 mg/mL 작업 솔루션으로 만들기 위해 초순 톨루엔에.
   주의: 톨루엔 처리 되어야 합니다 주의 기형 발생 물질으로. 기관 화학 위생 계획에 따라 톨루엔의 처분.
2. 파라핀 솔루션 건조 산 청소 커버 유리를 균일 하 게 유리 표면을 커버 하는 볼륨에 작업을 적용 합니다. 초과 솔루션을 가만히 따르다 하 고 건조 한 질소 가스 또는 공기 커버 유리. 대량 준비, Coplin jar 커버 유리를 수용 하도록 설계 된 사용 합니다.
3. 커버 유리 폴란드어 x 축에 3 타 차로 및 다음 보풀 지우기 y 축에 3 타 차로 ( 재료의 표참조).
4. 실험을 실시 하기 전에 즉시 살 균 초순, 커버 유리를 세척 하 고 생물 안전 후드에 자외선 빛으로 15-30 분 후 소독. 또는, 에틸렌 산화물 또는 감마 방사선 조사에 의해 커버 유리를 소독.

3. Micropatterning 탄화수소 포함 된 화합물 융합 제한 미리 지역

1. 건조 한 산 청소 덮개 유리 및 유리는 평평한 표면에 고정.
2. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 골드 전송 전자 현미경 검사 법 파인더 그리드 탄화수소 compound(s)의 작업 솔루션에 젖어. 실험의 최종 목표를 충족 하는 탄화수소 화합물을 선택 하십시오 ( 표 1참조). 부드럽게 필터 종이에 그리드를 활용 하 여 멀리 초과 솔루션을 심지 하 고 즉시 덮개 유리의 센터에 눈금을 배치. 다음 단계로 진행 하기 전에 2 분 동안 건조 톨루엔을 허용 합니다.
3. 그리드는 조심 스럽게 거꾸로 유리 유리에 보 세 다는 것을 확인 하십시오. 경우에 그리드 분리 3.2 새로운 커버 유리를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
   참고: 플라즈마 클리너를 사용할 수 없는 경우 3.4 단계를 생략 합니다.
4. 플라즈마는 진공 가스 플라즈마 처리에 의해 커버 유리를 청소.
   참고: finder 그리드는 플라즈마에서 긴 사슬 탄화수소 흡착 내부 표면을 보호 하는 마스크 역할을 합니다. 그리드에 의해 보호 지역 플라즈마에 노출에 의해 비 fusogenic 렌더링 됩니다. 커버 유리는 플라즈마에 노출 시간 실험적으로 결정 되어야 합니다.
5. 조심 스럽게 파인 팁 집게를 사용 하는 micropattern를 노출 유리 표면에서 그리드를 제거.

4. 조작 유리 하단 요리

1. 35 m m 플라스틱 단계 드릴 비트를 사용 하 여 배양 접시의 바닥에 6 ~ 10 mm 원형 구멍을 드릴 합니다.
   참고: 단계 드릴 비트를 사용 하 여 부드러운 가장자리를 만들려고 하는. 가장자리 너무 거친 경우에, 커버 유리 접시의 바닥에 평평 본드 하지 것입니다. 불완전 하 게 평면 어려워질 현미경 검사 법.
2. 신중 하 게 혼합 하 고 (즉,입니다; 제조업체의 지침에 따라 실리콘 엘라 스토 머를 드 PDMS)입니다.
3. 탄성 중합체의 가장자리에 그냥 proximate의 얇은 코팅을 적용 (즉, 세포핵) 구멍.
   참고:는 탄성 연속 이라도 얇은 밴드 구멍 주변으로 나타납니다.
4. 부드럽게 적용 fusogenic 커버 유리 (섹션 2 참조), 또는 (섹션 1에서에서 설명한) 건조 산 청소 커버 유리 접시에 탄성에 의해 포위 하는 구멍을 커버 하기 위해. 커버 유리 접시의 바닥에 플러시 나타납니다 확인 하는 유리의 상당한 부분 플라스틱 접촉 구멍의 지름을 확장. 2-3 h 50 ° C에서 굽기 여는 탄성 중합체를 치료.
5. Fusogenic 유리 선호 하는 경우, UV 소독 표준 프로토콜에 따라 요리와 문화 셀. 그러나, 선호는 micropattern 이면 micropattern 준비에 대 한 3.2 단계로 진행 (micropatterning 사용 가스 플라즈마 접시 sterilizes을 강하게 PDMS 유리).

5. Thioglycollate elicited 세포 수집

1. 앞에서 설명한^3,,468 주 오래 된 C57BL/6 쥐 4% 맥주의 thioglycollate의 살 균 솔루션의 0.5 mL를 주사.
2. 72 시간 후, 승인 된 동물 보호에 따라 동물을 안락사 지침, 고 차가운 인산 염 버퍼 염 분 보충 5 m m ethylenediaminetetraacetate와 복 막 게 하 여 세포를 수집 합니다.
3. 3 분 x 300g에 대 식 세포를 원심 및 resuspend DMEM:F12 15 mM HEPES, 보충의 1 mL에 10 %FBS, 및 1% 항생제 (배양).
   참고: 셀 이후에 Neubauer hemocytometer 함께 계산 됩니다. 대 식 세포는 적절 한 농도를 희석 하 고 표면에 적용. 실험적인 질문을 위해 수 사관에 의해 주어진된 표면에 적용 하는 셀의 수를 신중 하 게 고려 되어야 한다. 기본 문학에서 알려진된 표준을 참조 하십시오.
4. 30 분 후 HBSS 보충 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 문화 매체와 대체 0.1 %BSA 표면 세척. 문화 인큐베이터 (5% CO₂ 공기 37 ° C에서)를 반환 합니다.
5. 2 시간 후, 매체를 발음 하 고 배양 10 ng/mL IL-4의 보충으로 바꿉니다. ⁴설명 되어 있는 대로 셀을 이미지.

결과

재료의 물리 화학 매개 변수 macrophage 퓨전^7,8,,910의 범위에 극적인 영향을 미칠. 또한, 표면 오염 물질 macrophage 퓨전¹¹홍보 알려져 있습니다. 그러므로, 대 식 세포 융합에 대 한 부정적인 제어로 중요 한 시작으로 깨끗 한 커버 유리 하다. 청소 프로토콜 1에에?...

토론

확인 하 고 이후에 대 식 세포 융합을 촉진 하는 품질 광학 유리 표면 개발 필요 사실 더 최근에 출판 된 연구 직접까지 생활의 맥락에서 대 식 세포 융합을 시각에서 비롯 된 표본^{3, 4}. 일반적으로 사용 되는 fusogenic 플라스틱 표면 LWD 목표 요구 되며 단계 대조 광학으로 제한는 사실 때문입니다. 이 방 벽 뿐만 아니라 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 추...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PCD-32G
Finder grid	Electron microscopy sciences	G400F1-Au	any gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)	Thor Labs	CG15CH	use only high stringency cover glass
Paraffin wax	Sigma Aldrich	17310
Petrolatum	Sigma Aldrich	16415	must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide	Sigma Aldrich	O2136	prepare fresh
Isopropanol	Sigma Aldrich	278475
Toluene	Sigma Aldrich	244511
Acetone	VWR International	BDH1101
Ethanol	Electron microscopy sciences	15050	use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid	Fischer Scientific	A144C-212	use to acid wash cover glass
Slyguard 184	VWR International	102092-312	mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish	Santa Cruz Biotech	sc-351864
Dumont no. 5 forceps	Electron microscopy sciences	72705	ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS	Atlanta Biological	S11550
DMEM:F12	Corning	10-092	contains 15 mM HEPES
Pen/Strept	Corning	30-002-Cl
HBSS	Corning	21-023
BSA solution	Sigma Aldrich	A9576	use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4	Genscript	Z02996	aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice	n/a	n/a	use for live fluorescence imaging
Kimwipe	Kimberly Clark	34155	use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces