JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает изготовление оптического качества стеклянных поверхностей, адсорбированного с соединениями, содержащими длинноцепочечных углеводородов, которые могут использоваться для мониторинга макрофагов слияние живых образцов и позволяет суперразрешением микроскопии фиксированной образцов .

Аннотация

Визуализация формирования многоядерные гигантские клетки (MGC) от живых образцов была сложной тем, что наиболее живой тепловизионные методы требуют распространения света через стекло, но на стекле макрофагов fusion-это редкое событие. Этот протокол представляет изготовление нескольких поверхностей оптическое качество стекла, где адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов превращает стекла в fusogenic поверхность. Во-первых описана подготовка поверхностей чистого стекла как исходный материал для модификации поверхности. Во-вторых метод предоставляется для адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов для преобразования не fusogenic стекло в подложке fusogenic. В-третьих этот протокол описывает изготовление поверхности micropatterns, которые способствуют высокой степенью пространственно-временных контроля над MGC формирования. Наконец изготовлении стекла дно блюда описан. Приведены примеры использования этой системы в vitro клетки в качестве модели для изучения фьюжн макрофагов и MGC формирования.

Введение

Формирование MGC сопровождает ряд патологических состояний в организме человека отличаются хроническим воспалением1. Несмотря на соглашение, что макрофаги mononucleated предохранитель в форме MGC2, удивительно мало исследования показали фьюжн в контексте с живых образцов3,4. Это потому, что чистый стеклянных поверхностей, которые требуются для большинства методы визуализации не способствуют макрофагов фьюжн когда индуцированных воспалительных цитокинов5. Действительно если чистое стекло используется как субстрат для fusion макрофагов, затем низкого до среднего масштаба цели (т.е., X 10-20) и более чем 15 h непрерывного изображений часто требуется соблюдение одного сплавливание событие.

С другой стороны, fusogenic пластиковых поверхностей (например, permanox) или бактериологического пластика содействовать сплавливание2. Однако изображений через пластиковые проблематично, потому что подложки толщиной и рассеивает свет. Это осложняет, воображения, поскольку давно рабочих расстояние (LWD) целей требуются. Однако LWD целей обычно имеют низкой освещенности сбора потенциал, по сравнению с их coverslip исправлены коллегой. Кроме того методы, которые используют изменения полярности света, проходящего через образец как дифференциальной помехи контраст невозможно, поскольку пластик двулучепреломление. Барьеры, связанные с использованием пластиковых далее подчеркнули тот факт, что невозможно предсказать, где будет происходить макрофагов фьюжн/MGC формирование на поверхности. Вместе, эти ограничения ограничивают визуализации макрофагов сплавливание к фазе контраст Оптика, расширенный общей длительности визуализации (> 15 часов непрерывной) и низкого разрешения.

Недавно мы определили сильно fusogenic поверхности стекла во время проведения одной молекулы супер резолюции микроскопии с фиксированными макрофагов/MGC4. Это наблюдение было удивительно, потому что чистое стекло поверхности содействовать Фьюжн по очень низкой ставке ~ 5% после 24 часов в присутствии интерлейкина-4 (Ил-4) определяется сплавливание индекса4. Мы обнаружили, что способность содействовать сплавливание было обусловлено Олеамид загрязнения. Адсорбция Олеамид или других соединений, которые аналогичным образом содержатся углеводороды длинноцепочечных сделал fusogenic стекла. Большинство fusogenic соединения (парафин) был micropatterned, и он передал высокую степень пространственно-временных контроля над fusion макрофагов и 2 раза увеличение числа событий фьюжн, наблюдаемыми в такое же количество времени, по сравнению с permanox. Эти оптические качества поверхности представила первый проблеск в морфологические особенности и кинетики, которые регулируют формирования MGC в живых образцов.

В этом протоколе мы описываем изготовление различных стеклянных поверхностей, которые могут использоваться для мониторинга образования MGC из живых образцов. Кроме того мы показываем, что эти поверхности поддаются дальнего поля суперразрешением методов. Поверхности изготовление зависит от цели эксперимента, и каждая поверхность описан с соответствующих примеров в тексте разбирательства.

протокол

Процедуры, которые используют животных были утверждены животное уход и использование комитетами в клинике Майо, Janelia исследований университета и университета штата Аризона.

1. Подготовка кислоты чистить Стекло покровное

Примечание: крышка стекла, приобретенные у многих производителей может быть не так чист, как ожидалось. Рассмотрим, регулярно очистки пакеты стекла перед любой процедурой, когда речь идет о микроскопии.

  1. Приобрести Стекло покровное высокой жесткости. Особая осторожность для выбора правильной толщины (0,15 или 0,17 мм).
    Примечание: Выбор толщины покрытия стекла зависит от цели микроскоп и перечислены непосредственно на объективного стволом.
  2. Инкубируйте покровным стеклом в 12 М соляной кислоты в хорошо проветриваемом химических Зонта на 1 час с sonication (42 кГц, 70 Вт). Повторите этот шаг для еще два раза с свежим 12 М HCl.
  3. Заполнить отдельный стакан с ультрачистая вода и добавьте покровным стеклом. Sonicate Стекло покровное 5-10 мин в хорошо проветриваемом химические вытяжки. Повторите этот шаг десять раз.
  4. Инкубируйте покровным стеклом в чистом ацетоне в хорошо проветриваемом химические вытяжки для 30 минут с sonication. Повторите этот шаг для еще два раза.
  5. Заполнить отдельный стакан с стерильных ультрачистая вода и добавьте покровным стеклом. Sonicate Стекло покровное 5-10 мин в хорошо проветриваемом химические вытяжки. Повторите этот шаг десять раз.
  6. Инкубируйте покровным стеклом в 100% этилового спирта в химические вытяжки для 30 минут с sonication. Повторите этот шаг еще два раза.
    Примечание: Чистота этилового спирта имеет важное значение. Загрязнители в виде растворенных твердых веществ будет сухой на стекле и может способствовать макрофагов фьюжн.
  7. Для длительного хранения место Стекло покровное кислоты уборка в контейнер с чистого этилового спирта. Кроме того сухое Стекло покровное с газ азот и хранить в вакуумный сушильный шкаф.

2. Подготовка поверхностей оптических Fusogenic качества

  1. Распустить ДМСО бесплатно высокоплавкие точки парафина в сверхчистого толуола.
    Примечание: Фондовая концентрации производятся на 10 мг/мл и разбавленных 1:9 в сверхчистого толуол сделать рабочий раствор 1 мг/мл.
    Предупреждение: Толуол должны быть обработаны с осторожностью как систему или тератогеном. Распоряжаться толуола согласно плану институциональных химических гигиены.
  2. Применение парафина рабочего раствора для сухой очистки кислоты покровным стеклом на том равномерно покрывает поверхность стекла. Декант излишки раствора и сухое Стекло покровное с газ азот или воздух. Для приготовления сыпучих используйте опарник Coplin предназначены для размещения покровным стеклом.
  3. Польский Стекло покровное 3 ударов в оси x и далее 3 штрихов оси y с ворса протрите (см. Таблицу материалы).
  4. Непосредственно перед проводится эксперимент, вымойте крышку стекла с стерильных ультрачистая вода и впоследствии стерилизовать на 15-30 мин с ультрафиолетового света в капюшоне биологической безопасности. Кроме того стерилизация Стекло покровное этилена оксид или гамма-облучения.

3. Micropatterning углеводородов-содержащих соединений ограничиться Fusion чтобы предопределили регионов

  1. Сухой очистки кислоты покровным стеклом и иммобилизации стекла на плоской поверхности.
  2. С помощью щипцов, тщательно погружайте электронной микроскопии искатель золота электропередач в рабочем растворе compound(s) углеводородов. Выберите соединения углеводородов, которая отвечает конечной целью эксперимента (см. таблицу 1). Фитиль от избыточного решения, осторожно нажав сетки на фильтровальной бумаге и сразу же установите решетку в центре крышки стекла. Разрешить толуол сохнуть в течение 2 мин перед переходом к следующему шагу.
  3. Убедитесь, что сетка тычковой к стеклу, нежно переворачивать стекло. Если сетка отсоединяет повторите шаг 3.2 с помощью новое покрытие стекла.
    Примечание: Если не доступен плазмы чище, пропустите шаг 3.4.
  4. Плазмы чистой крышка стекла, лечение с помощью вакуумного газойля плазмы.
    Примечание: Finder сетка действует как маску для защиты подстилающей поверхности, адсорбированного с длинной цепью углеводородов из плазмы. Регионы, которые не защищены в сетке отображаются не fusogenic под воздействием плазмы. Количество времени, Стекло покровное подвергать плазмы должно определяться эмпирически.
  5. С помощью штраф наконечник щипцы, осторожно удалите сетку от поверхности стекла подвергать микроузор.

4. Изготовление стекла дно блюда

  1. Дрель круглое отверстие в нижней части 35-мм пластиковая Петри, используя сверло шаг 6-10 мм.
    Примечание: Очень важно использовать шаг сверла для создания гладких краев. Если края слишком грубо, Стекло покровное не склеивает плашмя к нижней части блюдо. Несовершенно плоских поверхностей затрудняют микроскопии.
  2. Тщательно перемешать и Дега силиконового эластомера согласно инструкциям производителя (то есть, полидиметилсилоксана; PDMS).
  3. Применить тонким слоем эластомер просто приуроченный к краю (т.е., неидентичных) отверстие.
    Примечание: Эластомер должен появиться как непрерывный, хотя и тонкие полосы вокруг отверстия.
  4. Осторожно применять fusogenic Стекло покровное (описано в разделе 2), либо сухой очистки кислоты Стекло покровное (описано в разделе 1) на блюдо покрыть отверстие, окруженный эластомера. Убедитесь, что крышка стекла появляется заподлицо с нижней части блюдо и выходит за рамки диаметр отверстия так, чтобы значительная часть стекла соприкасается с пластик. Вылечить эластомер, выпечки при 50 ° C для 2-3 ч.
  5. Если fusogenic стекло является предпочтительным, УФ стерилизации блюдо и культуры клеток по стандартным протоколам. Однако, если предпочтителен микроузор, переходите к шагу 3.2 микроузор подготовки (газовой плазмы, используемый во время micropatterning стерилизует блюдо и сильно пары PDMS стекло).

5. сбор Thioglycollate вызвал макрофаги

  1. Придать 8-week-old мышей C57BL/6 с 0,5 мл стерильного раствора 4% пивовар thioglycollate как описано в3,4,6.
  2. Семьдесят два часа позже, усыпить животных согласно утвержденным ухода за животными и использовать руководящие принципы и собирать макрофагов, перитонеальный лаваж с ледяной фосфат амортизированное saline дополнена тетранатрия 5 мм.
  3. Центрифуга макрофаги в 300 g x 3 мин и Ресуспензируйте в 1 мл DMEM:F12, с 15 мм HEPES, 10% FBS и 1% антибиотиков (культурной среде).
    Примечание: Впоследствии ячейки отсчитываются с Нойбауэр Горяева. Макрофаги являются разбавляют до соответствующей концентрации и применяется к поверхности. Количество ячеек для применения к данной поверхности должен быть тщательно рассмотрен следователя для целей экспериментальной вопрос. Проконсультироваться известных стандартов в основной литературе.
  4. После 30 мин мыть поверхности с HBSS дополнена 0,1% BSA чтобы удалить не сторонник клетки и заменить свежей питательной среды. Возвращение культур в инкубатор (5% CO2 в воздухе при 37 ° C).
  5. 2 h позже, аспирационная среднего и замените питательной среды с 10 нг/мл Ил-4. Изображение клетки как описано4.

Результаты

Физико-химических параметров материалов иметь драматический влияние на степень макрофагов фьюжн7,8,9,10. Кроме того поверхностные загрязнители известны содействовать макрофагов фьюжн11....

Обсуждение

Необходимость выявления и впоследствии разработать оптическое качество стеклянных поверхностей, которые способствуют макрофагов фьюжн вытекает из того факта, что пока не недавно опубликованное исследование, непосредственно визуализировать фьюжн макрофагов в контексте жизни образ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов Ugarova лаборатории и следователей в центре метаболических и сосудистая биология за полезные обсуждения этой работы. Джеймс Фауст хочет выразить свою благодарность инструкторы на курс Европейской лаборатории молекулярной биологии супер резолюции микроскопии в 2015 году. Мы хотели бы поблагодарить Сатья Khuon Janelia за помощь с Пробоподготовка для LLSM. В ходе обзора и съемок части этой работы Джеймс Фауст был поддержан T32 стипендий (5T32DK007569-28). Решетка свет лист компонент этой работы была поддержана HHMI и Гордон Мур фонд и Бетти. Т.ю. финансируется NIH Грант HL63199.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasma cleanerHarrick PlasmaPCD-32G
Finder gridElectron microscopy sciencesG400F1-Auany gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)Thor LabsCG15CHuse only high stringency cover glass
Paraffin waxSigma Aldrich17310
PetrolatumSigma Aldrich16415must be α-tocopherol-free if substituted
OleamideSigma AldrichO2136prepare fresh
IsopropanolSigma Aldrich278475
TolueneSigma Aldrich244511
AcetoneVWR InternationalBDH1101
EthanolElectron microscopy sciences15050use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acidFischer ScientificA144C-212use to acid wash cover glass
Slyguard 184VWR International102092-312mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dishSanta Cruz Biotechsc-351864
Dumont no. 5 forcepsElectron microscopy sciences72705ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBSAtlanta BiologicalS11550
DMEM:F12Corning10-092contains 15 mM HEPES
Pen/StreptCorning30-002-Cl
HBSSCorning21-023
BSA solutionSigma AldrichA9576use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4GenscriptZ02996aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6JJackson Laboratory000664use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct micen/an/ause for live fluorescence imaging
KimwipeKimberly Clark 34155use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces

Ссылки

  1. McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
  2. Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
  3. Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
  4. Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
  5. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
  6. Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
  7. Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
  8. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  9. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
  10. DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
  11. Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
  12. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  13. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  14. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  15. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  16. Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
  17. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  18. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
  19. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
  20. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
  21. Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены