Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı, makrofaj füzyon yaşam örneklerin izlemek için kullanılan ve süper çözünürlük mikroskobu sabit örneklerin sağlayan uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler ile adsorbe kaliteli optik cam yüzeyler imalatı açıklar .

Özet

Multinucleated dev hücreler (MGCs) oluşumunu yaşam örnekler görüntülenmesi en canlı görüntüleme teknikleri cam aracılığıyla ışık yayılmasını gerektirir, ancak camına makrofaj füzyon nadir bir olaydır nedeniyle aslında bu zor oldu. Bu iletişim kuralı birkaç kaliteli optik cam yüzeyler imalatı nerede adsorpsiyon uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşiklerin fusogenic yüzey içine cam dönüşümleri sunar. İlk olarak, hazırlık temiz cam yüzeylerin yüzey modifikasyonu için malzeme başlangıç olarak tanımlanır. İkincisi, bir yöntem adsorpsiyon sigara fusogenic cam fusogenic substrat dönüştürmek için uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler için sağlanmıştır. Üçüncü olarak, bu iletişim kuralını MGC oluşumu üzerinde kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek derecede teşvik yüzey micropatterns imalatı açıklar. Son olarak, cam alt yemekleri imalatı açıklanmıştır. Makrofaj füzyon ve MGC oluşumu için bir model olarak bu vitro hücre sisteminin kullanım örnekleri gösterilir.

Giriş

MGCs oluşumu kronik inflamasyon1tarafından seçkin insan vücudunda patolojik devletlerin bir dizi eşlik eder. İltihap makrofajlar forma MGCs2sigorta sözleşmesi rağmen şaşırtıcı birkaç çalışmalar yaşam ile bağlamda füzyon göstermiştir örnekler3,4. Bunun nedeni çoğu görüntüleme teknikleri için gerekli olan temiz cam yüzeyler inflamatuar sitokinlerin5tarafından indüklenen zaman makrofaj füzyon teşvik yok. Gerçekten de, temiz cam bir substrat makrofaj füzyon için sonra düşük orta büyütme hedefleri (Yani, 10-20 X) ve daha 15 h sürekli kullanılırsa görüntüleme kez bir tek füzyon olayı gözlemlemek için gereklidir.

Diğer el, fusogenic plastik yüzey (örneğin, permanox) veya bakteriyolojik sınıf plastik fusion2teşvik. Ancak, çünkü belgili tanımlık substrate kalın ve ışık scatters görüntüleme plastik aracılığıyla problemlidir. Bu kadar çalışma mesafesi (LWD) hedefleri gerekli olduğundan Imaging karıştırıyor. Ancak, LWD hedefler genellikle düşük ışık coverslip-düzeltilmiş karşılık gelen göre kapasite toplama var. Ayrıca, plastik birefringent bu yana değişiklikleri fark girişim kontrast gibi numune geçen ışık polarizasyonu yararlanma teknikleri imkansız. Engelleri plastik kullanımı ile ilgili daha fazla makrofaj füzyon/MGC formasyonu yüzeyde gerçekleşeceği tahmin etmek mümkün değildir aslında tarafından vurguladı. Birlikte, bu sınırlamalar faz kontrast optik, toplam görüntüleme süreleri genişletilmiş makrofaj fusion görselleştirme kısıtlamak (> 15 sürekli saat) ve düşük çözünürlüklü.

Son zamanlarda bir çok fusogenic cam yüzey tek molekül süper çözünürlük mikroskobu ile sabit makrofajlar/MGCs4yürütürken tespit. Bu gözlem yapıldı çünkü şaşırtıcı temiz cam yüzeyler füzyon de çok düşük oranda teşvik ~ %5 İnterlökin-4 (Il-4) füzyon tarafından belirlenen huzurunda 24 saat sonra dizin4. Füzyon tanıtmak için kapasite oleamide kirlilik nedeniyle olduğunu ortaya koymuştur. Adsorpsiyon oleamide veya benzer şekilde uzun zincirli hidrokarbon bulunan diğer bileşikler cam fusogenic yaptı. Çoğu fusogenic bileşik (parafin balmumu) micropatterned yapıldı ve makrofaj fusion ve permanox için karşılaştırıldığında zaman aynı miktarda içinde gözlenen füzyon olayların sayısını logosuna 2 kat artış kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek düzeyde öğretilir. Bu optik kalitesi yüzeyler ilk bakışta Morfolojik özellikleri ve yaşam numuneler MGCs oluşumunda yöneten Kinetik tarafından sağlanan.

Bu protokol için MGCs oluşumu yaşam örnekler üzerinden izlemek için kullanılan cam yüzeyler çeşitli imalatı açıklar. Buna ek olarak, biz bu yüzeyler uzakta-tarla süper çözümleme teknikleri için mükellef olduğunu göstermektedir. Yüzey imalat denemenin amacı bağlıdır ve her yüzeyi ile ilgili örnekler devam etmeden metinde anlatılan.

Protokol

Hayvanlar kullanmak yordamları hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Mayo Clinic, Janelia araştırma kampüs ve Arizona State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. asit temizledim cam hazırlanması

Not: birçok üretici satın cam beklendiği gibi temiz olmayabilir. Rutin temizlik cam mikroskobu nerede dahil herhangi bir yordamı önce toplu halde göz önünde bulundurun.

  1. Yüksek sıkılık cam satın. Doğru kalınlığı (mm) 0,15 veya 0,17 seçmek için özel dikkat.
    Not: Seçtiğiniz kapak cam kalınlığı bir mikroskop amaçta bağlıdır ve doğrudan objektif varil üzerinde listelenir.
  2. Kapak cam 12 M hidroklorik asit iyi havalandırılmış kimyasal duman başlıklı sonication (42 kHz, 70 W) ile 1 h için kuluçkaya. Taze 12 M HCl ile iki ek kez için bu adımı yineleyin.
  3. Ayrı bir ölçek ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.
  4. 30 dk ile sonication için iyi havalandırılan bir kimyasal başlıklı saf aseton kapak cam kuluçkaya. Bu adım için iki ek kere tekrar edin.
  5. Ayrı bir ölçek steril ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.
  6. % 100 etil alkol 30 dk ile sonication için kimyasal başlıklı kapak cam kuluçkaya. Bu iki ek kez tekrarlayın.
    Not: Etil alkol saflığı önemlidir. Kirletici maddeleri çözünmüş katı şeklinde cama kuruyacak ve makrofaj füzyon yükseltebilirsiniz.
  7. Uzun süreli depolama için saf etil alkol ile dolu bir kap içinde asit temizledim cam yerleştirin. Alternatif olarak, azot gazı ve bir vakum desiccator mağaza ile kapak cam kuru.

2. Fusogenic optik kaliteli yüzeylerin hazırlanması

  1. DMSO ücretsiz dağıtılması yüksek erime noktası parafin balmumu ultrasaf toluen içinde.
    Not: Stok konsantrasyonları 10 mg/mL yapılır ve sulandırılmış 1:9 ultrasaf toluen çalışma çözüm 1 mg/mL yapmak vardır.
    Dikkat: Toluen dikkatli bir teratogen ele alınmalıdır. Toluen kurumsal kimyasal hijyen plana uygun bir biçimde atın.
  2. Çözüm bir kuru asit temizledim cam için cam yüzeyine eşit olarak kapsayan bir ses seviyesinde çalışıyor parafin uygulanır. Aşırı çözüm dikkatle boşaltmak ve cam ile azot gaz ya da hava kuru. Toplu hazırlık için kapak cam karşılamak için tasarlanmış bir Coplin kavanoz kullanın.
  3. X ekseninde 3 vuruş ve sonraki 3 vuruş y eksenindeki hav bırakmayan bir bezle Kapak cam Lehçe ( Tablo malzemelerigörmek).
  4. Hemen deney önce steril ultrasaf su ile kapak Cam Yıkama ve daha sonra için 15-30 dakika bir biyolojik Emanet başlıklı ultraviyole ışık ile sterilize. Alternatif olarak, kapak cam etilen oksit veya gama ışınlama tarafından sterilize.

3. Micropatterning hidrokarbon içeren bileşikler Fusion sınırlamak için önceden belirlenmiş bölgeleri

  1. Kuru asit temizledim cam ve cam düz bir yüzey üzerine immobilize.
  2. Forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde hidrokarbon compound(s) çalışan bir çözüm bir altın transmisyon elektron mikroskobu Bulucu kılavuzda bırakın. Denemenin sonu hedefi karşılayan bir hidrokarbon bileşik seçin (bkz. Tablo 1). Izgara filtre kağıdı üzerine hafifçe dokunarak uzak aşırı çözüm fitil ve hemen ızgara kapağı cam ortasına yerleştirin. Sonraki adıma geçmeden önce 2 dk kurumaya toluen izin.
  3. Kılavuz için cam hafifçe cam ters çevirme tarafından bağlanmış emin olun. Eğer kılavuz yeni bir cam kullanarak 3.2 adımı yineleyin ayırır.
    Not: bir plazma temizleyici kullanılabilir değilse, adım 3.4 atlayın.
  4. Plazma tarafından tedavi vakum gaz plazma ile kapak cam temiz.
    Bilginize: Bulucu kılavuz ile uzun zincirli hidrokarbon plazma üzerinden adsorbe temel yüzey korumak için bir maske olarak işlem görür. Tabloya göre korumasız bölgeleri sigara fusogenic plazma maruz tarafından işlenir. Plazma için maruz kapak camdır süreyi ampirik olarak tespit edilmelidir.
  5. İnce uçlu forseps kullanarak, micropattern ortaya çıkarmak için cam yüzeyden kılavuz dikkatli bir şekilde çıkarın.

4. cam alt yemekleri imalatı

  1. 35-mm plastik Petri kabına bir adım matkap kullanarak alt 6-10 mm dairesel delik matkap.
    Not: Pürüzsüz kenarlar oluşturmak için adım matkap kullanmak önemlidir. Kenarları çok sert ise, cam yemek altına düz bağ değil. Imperfectly düz yüzeyler mikroskobu zorlaştırabilir.
  2. Dikkatle karışımı ve degas silikon elastomer göre üretici yönergelerine (Yani, polydimethylsiloxane; PDMS).
  3. Elastomer sadece kenarına yakın ince bir kaplama uygulamak (Yani, kısıtlamaya) delik.
    Not: Elastomer delik çevreleyen sürekli ince de olsa bir grup olarak görünmesi gerekir.
  4. Yavaşça (2 bölümünde açıklanan) fusogenic cam veya kuru asit temiz kapak (1 bölümünde açıklanan) cam yemek için elastomer tarafından çevrili deliği için geçerlidir. Cam çanak alt ile aynı hizada görüntülenir ve cam önemli bir kısmını temas plastiktir delik çapi genişletir emin olun. Elastomer 50 ° c 2-3 h için pişirme tarafından tedavi.
  5. Fusogenic cam tercih edilirse, UV standart protokolleri göre yemek ve kültür hücreleri sterilize et. Bir micropattern tercih edilir, ancak, micropattern hazırlık için adım 3.2 devam edin (micropatterning sırasında kullanılan gaz plazma çanak sterilizes ve şiddetle PDMS loşluğa çiftler).

5. Thioglycollate elde edildi makrofajlar toplama

  1. 8-hafta-yaşlı C57BL/6 fare ile 0.5 mL % 4 Brewer'ın thioglycollate steril bir çözüm olarak yukarıda açıklanan3,4,6enjekte et.
  2. Yetmiş iki saat sonra hayvan göre onaylanmış hayvan bakımı ötenazi ve yönergeleri kullanın ve makrofajlar tarafından peritoneal lavaj buz gibi fosfat tamponlu tuz 5 mM ethylenediaminetetraacetate ile takviye ile toplamak.
  3. Makrofajlar vasıl 300 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve 15 mM, HEPES, takıma DMEM:F12 1 ml resuspend %10 FBS ve % 1 antibiyotik (kültür orta).
    Not: Hücreleri daha sonra Neubauer hemasitometre ile dikkate alınır. Makrofajlar için uygun toplama seyreltilmiş ve yüzeylere uygulanır. Hücreleri belirli bir yüzeye uygulamak için dikkatle deneysel soru amacıyla araştırmacı tarafından kabul edilmelidir. Birincil edebiyatında bilinen standartlarına başvurun.
  4. 30 dakika sonra yüzeyler yapışık olmayan hücre kaldırma ve taze kültür orta yerine % 0,1 BSA ile takıma HBSS yıkayın. Kültürler İnkübatör (%5 CO2 37 ° C'de havada) dönün.
  5. 2 h sonra orta Aspire edin ve kültür 10 ng/mL ile Il-4 takıma orta yerine. Hücreleri başka bir yerde4açıklandığı gibi görüntü.

Sonuçlar

Malzemelerin fizikokimyasal parametreler makrofaj fusion7,8,9,10ölçüde üzerinde dramatik etkileri var. Ayrıca, yüzey kirletici makrofaj füzyon11teşvik bilinmektedir. Bu nedenle, bir negatif kontrol makrofaj fusion için önemli ile başlamak temiz cam gibi. Adsorpsiyon yüzey parlatma tarafından takip uzun zincirli hidrokarbonlar...

Tartışmalar

Belirlemek ve daha sonra makrofaj füzyon teşvik kaliteli optik cam yüzeyler geliştirmek gerek kaynaklandığını son Hayır yayınlanan çalışma doğrudan kadar yaşam içinde belgili tanımlık bağlam makrofaj füzyon görselleştirildiği aslında örnekler3, 4. Yaygın olarak kullanılan fusogenic plastik yüzeyler LWD hedefleri gerektirir ve faz kontrast optik için büyük ölçüde sınırlı nedeniyle gerçeğini bu. Bu engellerin sadece makrofaj ...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Ugarova laboratuvar ve Müfettişler Merkezi üyeleri metabolik ve vasküler Biyoloji için bu eser ilgili yararlı bilgiler için teşekkür etmek istiyorum. James Faust 2015 yılında Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı süper çözünürlük mikroskobu sahasında eğitmenler için minnettarlığını ifade istiyor. Satya Khuon LLSM için numune hazırlama konusunda yardım için Janelia teşekkür etmek istiyorum. Bir daha gözden geçirme ve bu eserin filme bölümleri sırasında James Faust T32 Bursu (5T32DK007569-28) tarafından desteklenmiştir. Bu eser kafes ışık sayfası bileşeni HHMI ve Betty ve Gordon Moore Vakfı tarafından desteklenmiştir. T.U. NIH tarafından finanse edilen HL63199 verin.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasma cleanerHarrick PlasmaPCD-32G
Finder gridElectron microscopy sciencesG400F1-Auany gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)Thor LabsCG15CHuse only high stringency cover glass
Paraffin waxSigma Aldrich17310
PetrolatumSigma Aldrich16415must be α-tocopherol-free if substituted
OleamideSigma AldrichO2136prepare fresh
IsopropanolSigma Aldrich278475
TolueneSigma Aldrich244511
AcetoneVWR InternationalBDH1101
EthanolElectron microscopy sciences15050use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acidFischer ScientificA144C-212use to acid wash cover glass
Slyguard 184VWR International102092-312mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dishSanta Cruz Biotechsc-351864
Dumont no. 5 forcepsElectron microscopy sciences72705ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBSAtlanta BiologicalS11550
DMEM:F12Corning10-092contains 15 mM HEPES
Pen/StreptCorning30-002-Cl
HBSSCorning21-023
BSA solutionSigma AldrichA9576use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4GenscriptZ02996aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6JJackson Laboratory000664use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct micen/an/ause for live fluorescence imaging
KimwipeKimberly Clark 34155use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces

Referanslar

  1. McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
  2. Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
  3. Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
  4. Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
  5. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
  6. Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
  7. Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
  8. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  9. Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
  10. DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
  11. Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
  12. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  13. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  14. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  15. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  16. Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
  17. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  18. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
  19. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
  20. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
  21. Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekilmesisay 133makrofaj f zyonmultinucleated dev h creli olu umucanl g r nt lemeyabanc cisim reaksiyonuyabanc cisim dev h creliiltihapileti im kural

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır