Herstellung optischer Qualität Glasflächen, Makrophagen Fusion zu studieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von hochwertigem optischen Glasoberflächen adsorbiert mit Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe, die können verwendet werden, um Makrophagen Verschmelzung von lebenden Exemplaren zu überwachen und ermöglicht Super-Resolution-Mikroskopie von festen Proben .

Zusammenfassung

Die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen (MGCs) von lebenden Exemplaren zu visualisieren ist eine Herausforderung gewesen, die meisten live bildgebende Verfahren Ausbreitung von Licht durch das Glas erfordern, aber auf Glas Makrophagen Fusion ein seltenes Ereignis ist. Dieses Protokoll stellt die Herstellung von mehreren optischen Qualität Glasflächen wo Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe Glas verwandelt sich in eine Fusogenic Oberfläche. Vorbereitung der saubere Glasflächen als Ausgangsmaterial für Oberflächenmodifizierung ist erstbeschrieben. Zweitens ist eine Methode für die Adsorption von Verbindungen, die langkettigen Kohlenwasserstoffe zur Umwandlung von nicht-Fusogenic Glas in ein Fusogenic Substrat zur Verfügung gestellt. Drittens beschreibt dieses Protokoll Herstellung der Oberfläche Micropatterns, die ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über MGC Bildung zu fördern. Schließlich wird die Herstellung Glasschalen unten beschrieben. Beispiele für die Verwendung dieses Systems in-vitro- Zelle als ein Modell zur Fusion von Makrophagen und MGC Bildung werden angezeigt.

Einleitung

Die Bildung von MGCs begleitet eine Reihe von pathologischen Zuständen in den menschlichen Körper durch die chronische Entzündung¹. Trotz Einigung, die Mononucleated Makrophagen zu bilden MGCs²vereinen, erstaunlich wenige Studien Fusion in Zusammenhang mit lebenden Exemplaren^3,4. Und zwar deshalb, weil saubere Glasflächen, die für die meisten bildgebenden Verfahren nicht Makrophagen Fusion, wenn durch inflammatorische Zytokine⁵fördern. In der Tat, wenn sauberes Glas als Trägermaterial für Makrophagen Fusion, dann niedrige mittlere Vergrößerung Ziele (z.B. 10-20 X) und mehr als 15 h Dauerbetrieb verwendet wird Bildgebung müssen häufig eine einzelne Fusion Ereignis beobachten.

Auf der anderen Hand, Fusogenic Kunststoff-Oberflächen (z.B. Permanox) oder bakteriologische Qualität Kunststoff fördern Sie Fusion². Bildgebung durch Kunststoff ist jedoch problematisch, da das Substrat dick ist und streut das Licht. Dies erschwert, imaging, da lange arbeiten Abstand (LWD) Ziele erforderlich sind. LWD-Ziele haben jedoch in der Regel geringe Lichtstärke Kapazität im Vergleich zu ihrem Pendant Deckglas korrigiert. Darüber hinaus sind Techniken, die ausgenutzt werden Änderungen in der Polarität von Licht durch die Probe z. B. differential Interferenz Kontrast unmöglich, da Kunststoff doppelbrechenden ist. Die Barrieren, die verbunden sind mit der Verwendung von Kunststoff sind weiter durch die Tatsache unterstrichen, die es ist unmöglich vorherzusagen, wo die Makrophagen Fusion/MGC Bildung auf der Oberfläche entstehen wird. Zusammen, diese Einschränkungen schränken die Visualisierung von Makrophagen Fusion zur Phase Kontrast Optik, total imaging Dauer verlängert (> 15 Stunden ununterbrochen), und niedriger Auflösung.

Wir identifizierten vor kurzem eine höchst Fusogenic Glasoberfläche während der Durchführung Einzelmolekül-Superresolution Mikroskopie mit Fixed Makrophagen/MGCs⁴. Diese Beobachtung war überraschend, weil sauberes Glas Oberflächen fördern Fusion mit einer sehr niedrigen Rate von ~ 5 % nach 24 h in Anwesenheit von Interleukin-4 (IL-4) durch die Fusion index⁴. Wir fanden, dass die Fähigkeit zur Verschmelzung zu fördern durch Oleamide Verschmutzung. Adsorption von Oleamide oder anderen Verbindungen, die ähnlich wie langkettige Kohlenwasserstoffe enthalten gemacht das Glas Fusogenic. Die meisten Fusogenic zusammengesetzten (Paraffinwachs) war Micropatterned, und es vermittelt ein hohes Maß an räumlich-zeitliche Kontrolle über Makrophagen Fusion und eine 2-fache Erhöhung der Zahl der Fusion-Ereignisse, die innerhalb der gleichen Zeitspanne im Vergleich zu Permanox beobachtet. Diese optische Qualität Flächen versehen den ersten Blick in die morphologischen Merkmale und Kinetik, die die Bildung von MGCs in lebende Exemplare zu Regeln.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Vielzahl von Glasflächen, die verwendet werden können, um die Bildung von MGCs von lebenden Exemplaren zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Flächen Fernfeld Höchstauflösung Techniken zugänglich sind. Oberfläche Fertigung ist das Ziel des Experiments abhängig, und jede Fläche wird mit entsprechenden Beispielen im Text Verfahren beschrieben.

Protokoll

Verfahren, die Tiere nutzen stimmten die Animal Care und Nutzung Gremien auf Mayo Clinic, Janelia Research Campus und Arizona State University.

1. Vorbereitung Deckglas Säure gereinigt

Hinweis: Deckglas gekauft von vielen Herstellern so sauber wie erwartet möglicherweise nicht. Betrachten Sie routinemäßig Reinigung Chargen von Deckglas vor jedem Eingriff wo Mikroskopie beteiligt ist.

1. Kaufen Sie hohe Stringenz Deckglas. Achten Sie besonders auf die richtige Dicke (0,15 oder 0,17 mm) wählen.
   Hinweis: Die Wahl der Abdeckung Glasstärke richtet sich nach dem Mikroskopobjektiv und direkt auf den objektiven Lauf aufgeführt ist.
2. Das Deckglas in 12 M Salzsäure in einem gut belüfteten chemische Abzug für 1 h mit Beschallung (42 kHz, 70 W) inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Male mit frisch 12 M HCl.
3. Füllen Sie einen separaten Becher mit Reinstwasser und fügen Sie das Deckglas. Beschallen Sie das Deckglas für 5-10 min in einem gut belüfteten chemische Haube. Wiederholen Sie diesen Schritt zehnmal.
4. Inkubieren Sie das Deckglas in Aceton in einer gut belüfteten chemische Haube für 30 min mit Beschallung. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Male.
5. Füllen Sie einen separaten Becher mit sterilen Reinstwasser und fügen Sie das Deckglas. Beschallen Sie das Deckglas für 5-10 min in einem gut belüfteten chemische Haube. Wiederholen Sie diesen Schritt zehnmal.
6. Inkubieren Sie das Deckglas in 100 % Ethylalkohol in eine chemische Haube für 30 min mit Beschallung. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
   Hinweis: Die Reinheit der Ethylalkohol ist wichtig. Verunreinigungen in Form von gelösten Stoffen werden auf dem Glas trocken und Makrophagen Fusion fördern können.
7. Legen Sie für die langfristige Lagerung das Deckglas Säure gereinigt in einen Behälter gefüllt mit reinen Äthylalkohol. Alternativ, trocknen Sie das Deckglas mit Stickstoffgas und Shop in einem Vakuum Exsikkator.

2. Vorbereitung des Fusogenic optisch hochwertige Oberflächen

1. Auflösen, DMSO-freie hochschmelzenden Punkt Paraffinwachs in hochreinen Toluol.
   Hinweis: Lager Konzentrationen bestehen bei 10 mg/mL, und verdünnt 1:9 in hochreinen Toluol zu 1 mg/mL Lösung sind.
   Achtung: Toluol sollte als Teratogen pfleglich behandelt werden. Toluol nach institutionellen chemische Hygieneplan entsorgen.
2. Wenden Sie das Paraffin arbeiten Lösung für eine trockene Säure gereinigt Deckglas auf ein Volume, das die Glasoberfläche gleichmäßig deckt. Dekantieren Sie überschüssige Lösung und trocknen Sie das Deckglas mit Stickstoffgas oder Luft zu. Vorbereitung der Masse verwenden Sie Kanope Coplin entworfen, um das Deckglas unterzubringen.
3. Das Deckglas mit 3 Schlägen in der x-Achse und anschließend mit 3 Schlägen in der y-Achse mit einem fusselfreien Tuch zu polieren (siehe Tabelle der Materialien).
4. Unmittelbar vor das Experiment durchgeführt, das Deckglas mit sterilen Reinstwasser waschen und anschließend sterilisieren für 15-30 min mit UV-Licht in eine biologische Schutzhaube. Sterilisieren Sie alternativ Glasabdeckung durch Ethylen Oxid oder Gamma-Bestrahlung.

3. Micropatterning Kohlenwasserstoff-Verbindungen beschränken, Fusion, vorgegebenen Regionen

1. Trocknen Sie das Deckglas Säure gereinigt und immobilisieren Sie das Glas auf eine Ebene Fläche zu.
2. Tauchen Sie mit Pinzette, sorgfältig ein gold Elektronenmikroskopie Finder Übertragungsnetz in eine funktionierende Lösung von Kohlenwasserstoff-widerrufen. Wählen Sie einen Kohlenwasserstoff-Verbindung, die das eigentliche Ziel des Experiments entspricht (siehe Tabelle 1). Docht entfernt überschüssige Lösung durch leichtes Klopfen das Raster auf Filterpapier, und sofort das Gitter in der Mitte der Glasabdeckung. Können Sie Toluol zum Trocknen für 2 min bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. Stellen Sie sicher, dass das Gitter auf dem Glas verklebt ist, durch das Glas vorsichtig umdrehen. Wenn das Raster wiederholen Sie Schritt 3.2 mit einem neuen Deckglas löst.
   Hinweis: Wenn ein Plasma Reiniger nicht verfügbar ist, überspringen Sie Schritt 3.4.
4. Plasma reinigen das Deckglas durch Behandlung mit Vakuum Gasplasma.
   Hinweis: Der Finder-Raster dient als Maske, die zugrunde liegende Oberfläche adsorbiert mit langkettigen Kohlenwasserstoffen aus dem Plasma zu schützen. Die Regionen, die durch das Gitter geschützt sind werden nicht Fusogenic durch die Einwirkung von Plasma gerendert. Die Höhe der Zeit ist das Deckglas Expose Plasma sollte empirisch bestimmt werden.
5. Entfernen Sie mit feinen Spitze Pinzette, vorsichtig das Gitter von der Glasoberfläche, die Micropattern verfügbar zu machen.

4. Herstellung von unten Glasschalen

1. Bohren Sie ein 6-10 mm kreisrundes Loch in den Boden von einem 35-mm-Kunststoff Petrischale mit einem Schritt-Bohrer.
   Hinweis: Es ist wichtig, einen Schritt Bohrer mit glatte Kanten erstellt. Wenn Kanten zu rau sind, wird das Deckglas nicht flach auf den Boden der Schale kleben. Unvollkommen Planflächen erschweren die Mikroskopie.
2. Vorsichtig mischen Sie und entgasen Sie Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers (z.B. Polydimethylsiloxan; PDMS).
3. Wenden Sie eine dünne Schicht des Elastomer nur unmittelbar an den Rand des (d. h.Indefinitpronomen) das Loch.
   Hinweis: Das Elastomer sollte als eine ständige, wenn auch dünne Band rund um das Loch angezeigt werden.
4. Sanft Auftragen der Fusogenic Deckglas (beschrieben in Abschnitt 2) oder die trockene Säure gereinigt Deckglas (beschrieben in Abschnitt 1) in die Schale um das Loch, umgeben von Elastomer zu decken. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas bündig mit dem Boden der Schale wird und der Durchmesser des Lochs hinausgeht, so dass ein wesentlicher Teil des Glases in Kontakt mit dem Kunststoff. Das Elastomer durch Backen bei 50 ° C für ca. 2-3 Stunden zu heilen.
5. Wenn Fusogenic Glas bevorzugt wird, UV sterilisieren die Schüssel und Kultur Zellen nach standard-Protokolle. Jedoch, wenn ein Micropattern bevorzugt wird, fahren Sie mit Schritt 3.2 Vorbereitung Micropattern (das Gasplasma verwendet, während Micropatterning das Gericht sterilisiert und stark Paare PDMS auf Glas).

5. sammeln Thioglykollat entlockte Makrophagen

1. Injizieren Sie 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen mit 0,5 mL einer sterilen Lösung von 4 % Brewer Thioglykollat wie zuvor beschrieben^3,4,6.
2. Einschläfern Sie zweiundsiebzig Stunden später des Tieres entsprechend zugelassenen Tierpflege und Richtlinien Sie, und sammeln Sie Makrophagen durch peritoneal Lavage mit eiskalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 mM Ethylenediaminetetraacetate ergänzt.
3. Die Makrophagen bei 300 X g für 3 min Zentrifugieren und in 1 mL DMEM:F12 mit 15 mM HEPES, ergänzt Aufschwemmen 10 % FBS und 1 % Antibiotika (Kulturmedium).
   Hinweis: Die Zellen werden anschließend mit einem Neubauer Hemocytometer gezählt. Makrophagen sind auf die entsprechende Konzentration verdünnt und auf die Oberflächen angewendet. Die Anzahl der Zellen auf einer vorgegebenen Fläche anwenden sollte durch den Prüfarzt für die Zwecke der experimentellen Frage sorgfältig abgewogen werden. Wenden Sie sich an bekannten Standards in der Primärliteratur.
4. Waschen Sie nach 30 min die Oberflächen mit HBSS ergänzt mit 0,1 % BSA-anhaftende Zellen zu entfernen und ersetzen mit frischem Nährmedium. Die Kulturen in den Inkubator (5 % CO₂ in der Luft bei 37 ° C) zurück.
5. 2 h später, aspirieren Sie das Medium und ersetzen mit Kulturmedium mit 10 ng/mL IL-4 ergänzt. Bild der Zellen wie⁴an anderer Stelle beschrieben.

Ergebnisse

Physikalisch-chemischen Parameter der Materialien haben dramatische Auswirkungen auf das Ausmaß der Makrophagen Fusion^7,8,9,10. Darüber hinaus sind Oberflächenverunreinigungen bekannt, Makrophagen Fusion¹¹zu fördern. Daher ist es wichtig zu sauberen Deckglas als Negativkontrolle für Makrophagen Fusion. Beim Reinigen, wie im Protokoll...

Diskussion

Die Notwendigkeit zu identifizieren und anschließend entwickeln optische Qualität Glasflächen, die Makrophagen Fusion fördern ergab sich aus der Tatsache, die bis vor kurzem nicht veröffentlichte Studie direkt Makrophagen Fusion im Rahmen des Wohnens visualisiert Proben^{3, 4}. Dies ist dass Fusogenic Kunststoff-Oberflächen, die häufig verwendet werden, LWD Ziele erfordern und beschränken sich weitgehend auf Phase Kontrast-Optik. Diese Hindernisse wurden du...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PCD-32G
Finder grid	Electron microscopy sciences	G400F1-Au	any gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)	Thor Labs	CG15CH	use only high stringency cover glass
Paraffin wax	Sigma Aldrich	17310
Petrolatum	Sigma Aldrich	16415	must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide	Sigma Aldrich	O2136	prepare fresh
Isopropanol	Sigma Aldrich	278475
Toluene	Sigma Aldrich	244511
Acetone	VWR International	BDH1101
Ethanol	Electron microscopy sciences	15050	use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid	Fischer Scientific	A144C-212	use to acid wash cover glass
Slyguard 184	VWR International	102092-312	mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish	Santa Cruz Biotech	sc-351864
Dumont no. 5 forceps	Electron microscopy sciences	72705	ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS	Atlanta Biological	S11550
DMEM:F12	Corning	10-092	contains 15 mM HEPES
Pen/Strept	Corning	30-002-Cl
HBSS	Corning	21-023
BSA solution	Sigma Aldrich	A9576	use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4	Genscript	Z02996	aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice	n/a	n/a	use for live fluorescence imaging
Kimwipe	Kimberly Clark	34155	use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces