Fabricação de superfícies de vidro de qualidade óptica para estudar a fusão do macrófago

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de superfícies de vidro ótico-qualidade adsorvido com compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser usados para monitorar fusão macrófago de espécimes vivos e permite a microscopia de super-resolução de espécimes fixos .

Resumo

Visualizando a formação de células gigantes multinucleadas (MGCs) de espécimes vivos tem sido um desafio devido ao fato de que mais técnicas de imagem ao vivo requerem a propagação da luz através do vidro, mas no vidro fusão macrófago é um evento raro. Este protocolo apresenta a preparação de várias superfícies de vidro de qualidade óptica onde a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa transforma o vidro em uma superfície de fusogenic. Em primeiro lugar, a preparação de superfícies de vidro limpo como material para a modificação da superfície de partida é descrita. Em segundo lugar, um método é fornecido para a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa para converter não-fusogenic vidro em um substrato de fusogenic. Em terceiro lugar, este protocolo descreve a fabricação de superfície micropatterns que promovem um elevado grau de controle spatiotemporal sobre formação de MGC. Finalmente, fabricar pratos de vidro inferior é descrito. Exemplos de utilização deste sistema de célula em vitro como um modelo para estudar a fusão do macrófago e MGC formação são mostrados.

Introdução

A formação de MGCs acompanha uma série de estados patológicos, no corpo humano distinto de inflamação crônica¹. Apesar do acordo que mononucleadas macrófagos fundem-se para formar MGCs², surpreendentemente poucos estudos têm mostrado a fusão em contexto com vivos espécimes^3,4. Isso ocorre porque as superfícies de vidro limpo que são necessárias para a maioria das técnicas de imagem não promover fusão macrófago quando induzida por citocinas inflamatórias⁵. Com efeito, se limpa vidro é usado como substrato para a fusão do macrófago, então baixa a objectivos intermédios ampliação (ou seja, 10-20 X) e mais de 15 h de contínua imagens são geralmente necessário para observar um evento único de fusão.

Na outra mão, fusogenic superfícies plásticas (por exemplo, permanox) ou plástico grade bacteriológica promova fusão². No entanto, imagens através do plástico é problemática, porque o substrato é espesso e dispersa a luz. Isso complica a imagem latente, pois há muito trabalho objectivos de distância (LWD) são necessários. No entanto, objectivos LWD geralmente têm baixa capacidade em comparação com suas contrapartes da lamela-corrigido de captura de luz. Além disso, técnicas que exploram as mudanças na polaridade da luz que passa através da amostra como contraste de interferência diferencial são impossíveis, já que o plástico é birrefringentes. As barreiras associadas ao uso do plástico são ressaltou ainda mais pelo fato de que é impossível prever onde a formação de fusão/MGC macrófago ocorrerá na superfície. Juntos, essas limitações restringem a visualização da fusão do macrófago a óptica de contraste de fase, estendido durações de imagem totais (> 15 horas contínuas) e baixa resolução.

Recentemente, nós identificamos uma superfície de vidro altamente fusogenic durante a realização de microscopia de resolução super single-molécula com macrófagos fixos/MGCs⁴. Esta observação foi surpreendente porque limpa vidro superfícies promovem fusão à baixíssima taxa de ~ 5% após 24 h na presença de interleucina-4 (IL-4), conforme determinado pela fusão do índice⁴. Descobrimos que a capacidade de promover fusão era devido à contaminação de oleamide. Adsorção de oleamide ou outros compostos que da mesma forma continham hidrocarbonetos de cadeia longa feita a fusogenic de vidro. A maioria dos compostos fusogenic (parafina) foi micropatterned, e é transmitido a um alto grau de controle spatiotemporal sobre fusão de macrófagos e um aumento de 2 vezes no número de eventos de fusão observado dentro a mesma quantidade de tempo em comparação com permanox. Estas superfícies ópticas-qualidade desde o primeiro vislumbre nas características morfológicas e cinética que regem a formação de MGCs em espécimes vivos.

Neste protocolo, descrevemos a fabricação de uma variedade de superfícies de vidro que pode ser usado para monitorar a formação de MGCs de espécimes vivos. Além disso, mostramos que essas superfícies são receptivos às técnicas de super-resolução consideravelmente-campo. Fabricação de superfície é dependente sobre o objetivo do experimento, e cada superfície é descrito com exemplos relacionados no texto processo.

Protocolo

Procedimentos que utilizam animais foram aprovados pelas comissões de utilização na clínica Mayo, Campus de pesquisa Janelia e Arizona State University e cuidado Animal.

1. preparar o ácido-limpa vidro de tampa

Nota: tampa vidro comprado de muitos fabricantes podem não ser tão limpo como esperado. Considere-se rotineiramente limpeza lotes de vidro de tampa, antes de qualquer procedimento onde microscopia está envolvida.

1. Comprar vidro de tampa de elevado rigor. Tome especial cuidado para escolher a espessura correta (0,15 ou 0.17 mm).
   Nota: A escolha da espessura do vidro de cobertura depende do objectivo do microscópio e está listada diretamente no tambor da objetivo.
2. Incube o vidro de tampa em 12 M ácido clorídrico em uma coifa química bem ventilado para 1 h com sonication (42 kHz, 70 W). Repita esta etapa para dois horários adicionais com frescos de 12 M de HCl.
3. Encha um copo separado com água ultrapura e adicione o cobertura de vidro. Proceda à sonicação o vidro de tampa por 5-10 min numa vizinhança de química bem ventilada. Repita dez vezes.
4. Incube o vidro de tampa em acetona pura em uma capa de química ventilada por 30 min com sonication. Repita esta etapa para mais duas vezes.
5. Encha um copo separado com água ultrapura estéril e adicionar o tampa de vidro. Proceda à sonicação o vidro de tampa por 5-10 min numa vizinhança de química bem ventilada. Repita dez vezes.
6. Incube o vidro de cobertura em 100% de álcool etílico em um capuz químico por 30 min com sonication. Repita mais duas vezes.
   Nota: A pureza do álcool etílico é importante. Contaminantes na forma de sólidos dissolvidos vão secar no vidro e podem promover a fusão do macrófago.
7. Para armazenamento a longo prazo, coloca o vidro de tampa limpa de ácido em um recipiente com álcool etílico puro. Alternativamente, seque o vidro de cobertura com nitrogênio e loja num exsicador de vácuo.

2. preparação de superfícies ópticas Fusogenic qualidade

1. Dissolver livre de DMSO fundição alta a ponto de cera de parafina em tolueno ultrapura.
   Nota: Concentrações de estoque são feitas em 10 mg/mL e estão diluído 1:9 em tolueno ultrapura tornar um 1 mg/mL solução de trabalho.
   Cuidado: Tolueno deve ser manuseado com cuidado, como um teratógeno. Descarte de tolueno, de acordo com o plano de higiene química institucional.
2. Aplica a parafina trabalhando a solução para um vidro de tampa de ácido-limpo seco em um volume que cobre uniformemente a superfície do vidro. Decantar a solução em excesso e seque o vidro de cobertura com nitrogênio ou ar. Para a preparação da massa, use uma jarra de Coplin projetada para acomodar o tampa de vidro.
3. Polir o vidro de tampa por 3 pancadas no eixo x e em seguida por 3 pancadas no eixo y com uma limpeza de fiapos (veja a Tabela de materiais).
4. Imediatamente antes que o experimento é conduzido, lave o tampa de vidro com água ultrapura esterilizada e posteriormente esterilizar por 15-30 min com luz ultravioleta em uma capa de segurança biológica. Alternativamente, esterilize o vidro de cobertura por irradiação de óxido ou gama de etileno.

3. Micropatterning hidrocarbonetos contendo compostos de confinar a fusão para predeterminado de regiões

1. Seque o vidro tampa ácido-limpos e imobilizar o vidro sobre uma superfície plana.
2. Com cuidado usando fórceps, mergulhe uma grade de localizador de microscopia eletrônica de transmissão ouro em uma solução de trabalho de compound(s) o hidrocarboneto. Escolher um hidrocarboneto composto que atenda o objetivo final do experimento (ver tabela 1). Pavio fora excesso solução tocando suavemente a grade no papel de filtro e imediatamente coloque a grelha no centro da tampa de vidro. Permitir que o tolueno secar por 2 min antes de prosseguir para a próxima etapa.
3. Certifique-se que a grade é ligada ao vidro por inversão suavemente o vidro. Se a grade desanexa repita a etapa 3.2 usando um vidro de tampa novo.
   Nota: Se não houver um plasma líquido de limpeza, omita passo 3.4.
4. Plasma limpar o vidro de cobertura pelo tratamento com plasma de gás vácuo.
   Nota: A grade de localizador funciona como uma máscara para proteger a superfície subjacente adsorvida com hidrocarbonetos de cadeia longa do plasma. As regiões que estão desprotegidas pela rede são processadas não-fusogenic pela exposição de plasma. A quantidade de tempo que o vidro de cobertura é expor para o plasma deve ser determinada empiricamente.
5. Usando pinças de ponta fina, Retire cuidadosamente a grade de superfície de vidro para expor a micropattern.

4. fabricação de pratos de vidro inferior

1. Faça um furo circular de 6-10 mm na parte inferior de um plástico de 35mm prato de Petri, usando uma broca de passo.
   Nota: É fundamental usar uma broca de etapa para criar bordas lisas. Se as bordas são muito fortes, o vidro de cobertura não ligarão plana para o fundo do prato. Superfícies planas imperfeitamente dificultam a microscopia.
2. Com cuidado Misture e desgaseificar elastômero de silicone de acordo com as instruções do fabricante (ou seja, polidimetilsiloxano; PDMS).
3. Aplique uma camada fina de elastômero apenas próximos à borda do (i.e., circunscrever) o buraco.
   Nota: O elastômero deve aparecer como uma faixa contínua, embora fina em torno do buraco.
4. Aplica suavemente o vidro de tampa de fusogenic (descrito na secção 2), ou o vidro de tampa ácido-limpo seco (descrito na secção 1) para o prato para cobrir o buraco rodeado de elastômero. Certifique-se que a tampa de vidro aparece nivelado com o fundo do prato e se estende além do diâmetro do furo para que uma parte substancial do vidro está em contato com o plástico. Cure o elastômero cozendo a 50 ° C, durante 2-3h.
5. Se fusogenic de vidro é o preferido, UV esterilizar as células prato e cultura de acordo com protocolos padrão. No entanto, se um micropattern é o preferido, prossiga para a etapa 3.2 para preparação de micropattern (o plasma de gás utilizado durante micropatterning Esteriliza o prato e fortemente casais PDMS para vidro).

5. recolha de macrófagos tioglicolato-suscitou

1. Injete camundongos C57BL/6 de 8 semanas com 0,5 mL de uma solução estéril de tioglicolato 4% Brewer como descrito anteriormente,^3,4,6.
2. Eutanásia em setenta e duas horas depois, o animal de acordo com o aprovado cuidado animal use diretrizes e coletar os macrófagos pela lavagem peritoneal com gelada fosfato salino suplementado com 5 mM etilenodiaminotetracético.
3. Centrifugue os macrófagos a 300 x g por 3 min e Resuspenda em 1 mL de DMEM:F12 suplementado com 15 mM HEPES, 10% FBS e 1% de antibióticos (meio de cultura).
   Nota: As células são posteriormente contadas com um hemocytometer de Neubauer. Os macrófagos são diluídos na concentração adequada e aplicados sobre as superfícies. O número de células para aplicar a uma dada superfície deverão ser cuidadosamente considerado pelo investigador para efeitos a questão experimental. Consulte padrões conhecidos na literatura primária.
4. Após 30 min lave as superfícies com HBSS suplementado com 0,1% de BSA para remover as células não-aderentes e substituir com meio de cultura fresco. Retorno as culturas para a incubadora (5% CO₂ no ar a 37 ° C).
5. 2h depois, Aspire o meio e substituir com meio de cultura suplementado com 10 ng/mL de IL-4. As células conforme descrito em outra parte⁴da imagem.

Resultados

Parâmetros físico-químicos de materiais tem efeitos dramáticos sobre a extensão do macrófago fusão^7,8,9,10. Além disso, contaminantes superficiais são conhecidos por promover o macrófago fusão¹¹. Portanto, é importante começar com limpo vidro de tampa como um controle negativo para fusão de macrófagos. Quando limpo conforme...

Discussão

A necessidade de identificar e desenvolver posteriormente as superfícies de vidro ótico-qualidade que promovem a fusão do macrófago resultou do fato de que até recentemente não publicado estudo diretamente visualizado fusão macrófago no contexto de vida espécimes^{3, 4}. Isto é devido ao fato de que fusogenic as superfícies plásticas que são comumente usadas exigem objectivos LWD e são em grande parte limitadas a óptica de contraste de fase. Estas ba...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PCD-32G
Finder grid	Electron microscopy sciences	G400F1-Au	any gold TEM grid will work
Cover glass (22x22 mm)	Thor Labs	CG15CH	use only high stringency cover glass
Paraffin wax	Sigma Aldrich	17310
Petrolatum	Sigma Aldrich	16415	must be α-tocopherol-free if substituted
Oleamide	Sigma Aldrich	O2136	prepare fresh
Isopropanol	Sigma Aldrich	278475
Toluene	Sigma Aldrich	244511
Acetone	VWR International	BDH1101
Ethanol	Electron microscopy sciences	15050	use low dissolved solids ethanol
Hydrochloric acid	Fischer Scientific	A144C-212	use to acid wash cover glass
Slyguard 184	VWR International	102092-312	mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h
35 mm petri dish	Santa Cruz Biotech	sc-351864
Dumont no. 5 forceps	Electron microscopy sciences	72705	ideal for removing TEM grid in section 3.5
FBS	Atlanta Biological	S11550
DMEM:F12	Corning	10-092	contains 15 mM HEPES
Pen/Strept	Corning	30-002-Cl
HBSS	Corning	21-023
BSA solution	Sigma Aldrich	A9576	use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages
IL-4	Genscript	Z02996	aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents
eGFP-LifeAct mice	n/a	n/a	use for live fluorescence imaging
Kimwipe	Kimberly Clark	34155	use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces