Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد سير شبه الآلي لتسلسل الرنا الريباسي 16S من اللبن البشري وأنواع العينة منخفض-الكتلة الأحيائية الأخرى المستهدفة.

Abstract

وقد أصبحت دراسات المجتمعات الميكروبية على نطاق واسع مع وضع تسلسل غير مكلفة نسبيا والسريع، وارتفاع الإنتاجية. ومع ذلك، كما هو الحال مع جميع هذه التكنولوجيات، تعتمد النتائج استنساخه على سير عمل مختبر الذي يشتمل على الاحتياطات اللازمة والضوابط. وهذا أهمية خاصة مع العينات منخفضة-الكتلة الحيوية حيث تلويث الحمض النووي البكتيري يمكن أن تولد نتائج مضللة. هذه المادة تفاصيل سير شبه الآلي التعرف على الميكروبات من عينات حليب الثدي البشري استخدام تسلسل المستهدفة من منطقة V4 الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) 16S على نطاق throughput منخفضة إلى متوسطة. وصف البروتوكول إعداد عينة من الحليب الكامل الدسم بما في ذلك: عينة تحلل، واستخراج الحمض النووي، والتضخيم من منطقة V4 16S الرنا الريباسي الجينات، وإعداد مكتبة بتدابير مراقبة الجودة. الأهم من ذلك، البروتوكول والمناقشة النظر في القضايا التي البارزة في إعداد وتحليل العينات منخفضة-الكتلة الحيوية بما في ذلك الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية، وإزالة المانع بكر، تلوث العينة بالبيئية، الكاشف، أو مصادر تجريبية، وأفضل الممارسات التجريبية الرامية إلى ضمان إمكانية تكرار نتائج. حين البروتوكول كما هو موضح محددة لعينات اللبن البشري، أنها قابلة للتكيف للعديد من أنواع عينة الكتلة الأحيائية المنخفضة والعالية، بما في ذلك عينات جمعت في مسحات، مجمدة نظيفة، أو استقر في المخزن مؤقت الحفاظ على.

Introduction

يعتقد أن المجتمعات الميكروبية التي استعمار البشر أن تكون الأهمية لصحة الإنسان، والأمراض التي تؤثر على الأيض والتنمية محصنة والتعرض للمرض، والردود على التطعيم والمخدرات العلاج1، 2-التأكيد على الجهود المبذولة لفهم تأثير الحجمية على صحة الإنسان حاليا تحديد الميكروبات المرتبطة بالمكونات التشريحية المحددة (أي، الجلد، الأمعاء، عن طريق الفم، إلخ)، فضلا عن مواقع محلية داخل هذه المقصورات3،4. التي تدعم هذه الجهود التحقيق هو الظهور السريع، وزيادة إمكانية الحصول على تكنولوجيات الجيل التالي التسلسل (خ ع) التي توفر منصة موازية على نطاق واسع لتحليل محتوى الجينية الميكروبية (ميكروبيومي) من عينة. للعديد من عينات الفسيولوجية، ميكروبيومي المرتبطة بها على حد سواء معقدة ووفرة (أيالبراز)، ولكن لبعض العينات، ممثلة في ميكروبيومي بانخفاض الكتلة الحيوية الميكروبية (أي، واللبن البشري، والجهاز التنفسي السفلي) حيث حساسية والتحف الفنية التجريبية، والتلوث المحتمل تصبح القضايا الرئيسية. التحديات المشتركة في الدراسات ميكروبيومي والتصميم التجريبي المناسب قد خضعت متعددة استعراض المواد5،6،،من78.

المقدمة في هذه الوثيقة هو خط أنابيب تجريبية قوية خ ع استناداً إلى المستهدفة تسلسل الرنا الريباسي 16S V4 المنطقة9 تميز ميكروبيومي اللبن البشري. التحليل ميكروبيومي اللبن البشري معقدة ليس فقط طبيعتها منخفضة الكتلة الحيوية الميكروبية10، بل بالإضافة إلى ذلك بارتفاع مستويات الحمض النووي البشري الخلفية11،12،،من1314 و احتمال ترحيل PCR مثبطات15،16 في الحمض النووي المستخرج. يعتمد هذا البروتوكول على مجموعات استخراج المتاحة تجارياً ومنصات شبه الآلية التي يمكن أن تساعد في تقليل التغير عبر نموذج إعداد دفعات. ويضم مجتمع صورية بكتيرية المعالم التي يتم معالجتها جنبا إلى جنب مع عينات كعنصر تحكم الجودة للتحقق من صحة كل خطوة في البروتوكول، وتوفير مقياس مستقل من متانة الأنابيب. ورغم أن البروتوكول كوصف محدد لعينات اللبن البشري، وهو القابلة للتكييف وفقا لأنواع العينة الأخرى بما في ذلك البراز، المستقيم، المهبل، والجلد، ومسحات أريولار، وعن طريق الفم10،17، ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق الباحثين الذين يرغبون في إجراء تحليلات ميكروبيومي.

Protocol

لكل بروتوكول الخطوات، يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية)، ونهج الوقاية من التلوث الصارمة التي تدعو الحاجة إلى اتخاذها. مراقبة سير العمل من قبل التضخيم العمل المجالات إلى مجالات العمل بعد التضخيم التقليل من تلوث العينات. جميع اللوازم المستخدمة عقيمة، وخال من رناسي، الدناز، والحمض النووي، ومولد. يتم تصفية جميع ماصة نصائح. مخطط انسيابي للخطوات بروتوكول يتم توفيرها (الشكل 1).

1-عينة تحلل

ملاحظة: تحلل عينة واستخراج الحمض النووي تجري باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي في بيئة غرفة نظيفة فيها الضوابط الهندسية والإجرائية على حد سواء لتقليل إدخال البكتيريا البيئية للعينات.

  1. إعداد مساحة عمل
    1. تنظيف منطقة مع نظافة السطح المناسب للقضاء على أي تلوث من الحمض النووي العمل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (BSC).
    2. قم بتشغيل فورتيكسير التحكم في درجة الحرارة، وتعيينها إلى 37 درجة مئوية.
  2. إعداد جوانيدينيوم ثيوسيانات تحلل المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)
    1. التحقق من المخزن المؤقت تحلل لرواسب. إعادة حل رواسب من الاحترار في 37 درجة مئوية.
    2. إعداد 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت مع 6 ميليلتر β-mercaptoethanol (β-ME) لكل عينة. النظر حجم 20% إضافية كل عينة.
  3. إعداد نموذج
    1. إذا كان يتم تجميد الحليب الكامل الدسم، الذوبان في الجليد. الكوة 5 مل من كل الحليب إلى 15 مل أو 5 مل أنبوب عقيمة في بكالوريوس العلوم وإبقائه على الجليد.
    2. زيادة ونقصان الحليب 5 مل الكوة لمدة 10 دقيقة في 5,000 ز x عند 4 درجة مئوية بيليه الخلايا.
    3. إزالة طبقة الدهون، والآن تتحمل الطبقة العليا في الأنبوب، مع ملعقة بلاستيكية كبيرة أو تلميح ماصة.
    4. دون الإخلال بيليه، إزالة جميع المادة طافية باستثناء 100 ميليلتر.
    5. أغسل بيليه ريسوسبيندينج في 1 مل فوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
    6. إعداد المراقبة السلبية 1 بإضافة 1 مل PBS العقيمة إلى أنبوب 5 مل.
    7. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل نظيفة، وتدور في ميكروسينتريفوجي لمدة 1 دقيقة (5,000 س ز، في درجة حرارة الغرفة (RT)).
    8. استخدام تلميح عقيمة التي تمت تصفيتها ماصة ميليلتر 1,000 لتجاهل المادة طافية/الدهنية الطبقة بأكملها.
    9. في حالة عدم استخراج في نفس اليوم، التقط تجميد الخلية بيليه بوضعه في ملاط جليد جاف إيثانول، ونقل على الفور إلى الثلاجة-80 درجة مئوية.
  4. اضطراب العينة والتجانس (حبة-الضرب)
    1. إضافة 600 ميليلتر من تحلل مخزن يحتوي على β-ME لبيليه، ونقل التعليق إلى أنبوب حبة.
    2. ويتضمن كل دفعة الاستخراج من 12 10 عينات والمراقبة السلبية 1 (تم إعداده في الخطوة 3، 7 أعلاه) ومراقبة إيجابية 1 (تم إعداده في الخطوة التالية).
      1. إعداد التحكم الإيجابي 1 مع المخزن المؤقت لتحلل و 20 ميكروليتر من عينة صورية البكتيرية (المجتمع صورية تستخدم لديها تركيز، تستخرج مرة واحدة، لما يقارب 0.2 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي).
    3. دوامة كل حبة أنابيب بقوة لمدة 15 ثانية.
    4. الحرارة العينات في فورتيكسير درجة الحرارة التي تسيطر على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع الهز 700-800 لفة في الدقيقة.
    5. تحميل أنابيب إلى مجموعة محول disruptor عينة الآلي.
    6. تغلب حبة لمدة 1 دقيقة في 30 هرتز.
    7. تفكيك مجموعة محول والتبديل يدوياً في محول مجموعة مع لوحات عينة من الذراع الروبوتية اليسرى في الذراع الروبوتية حق الصك.
    8. تغلب حبة لآخر دقيقة 1 في 30 هرتز.
    9. أنابيب الطرد المركزي في 17,200 س ز، لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    10. قم بإزالة كافة من المادة طافية مع ماصة 200 ميليلتر، مع الحرص على عدم الحصول على أي من الطبقة الدهنية في الجزء العلوي من النموذج أو حبة المتبقية في الجزء السفلي من النموذج، وتنطبق على عمود الخالطون.
    11. أجهزة الطرد المركزي الخالطون الأعمدة في أقصى سرعة، 17,200 س ز، لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    12. نقل 350 ميليلتر من النذرة بأنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل الشركة المصنعة للاستخدام مع أداة مؤتمتة لتنقية الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي (لا تستخدم أي أنابيب أخرى). احرص على عدم نقل أي طبقة الدهنية المتبقية.
    13. إذا كان حجم التدفق من خلال أقل من 350 ميليلتر، إضافة المخزن المؤقت تحلل مع β-لي إلى وحدة تخزين نهائي من 350 ميليلتر.
    14. ترك العينات على RT ليصل إلى 2 حاء قبل المتابعة إلى عزل الحمض النووي باستخدام أداة تنقية الحمض النووي الآلي، أو تجميد في-80 درجة مئوية.
  5. تنظيف مساحة العمل
    1. نظيفة جميع الأسطح في استخدام حل تلوث غير الانزيمية وتترك لمدة 10 دقائق، ثم رش مع الإيثانول 70% ومسح أسفل السطح.

2-عزل الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي

  1. إعداد مساحة عمل
    1. قم بتشغيل كتلة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى 70 درجة مئوية.
    2. قم بتشغيل فورتيكسير التحكم في درجة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    3. الاحماء شطف المخزن المؤقت (EB) التي تحتوي على 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 8.5، في أنبوب 50 مل إلى 70 درجة مئوية.
    4. الاحماء 350 إذابة ميليلتر ليساتيس العينة المجمدة في أنابيب 2 مل عند 37 درجة مئوية حتى تماما دون أي ترسبات (حوالي 10 دقائق).
  2. تنقية الحمض النووي
    1. دوامة وأنابيب 2 مل مع عينة بإيجاز للطرد المركزي (ز 3000 x ل 10 ق).
    2. إدراج أنابيب 2 مل شاكر بعد تحميل المخطط أداة تنقية الحمض النووي/رنا الآلي، كل إرشادات الشركة المصنعة.
    3. الحصول على محولات الدوار وإعدادها على درج على أساس العدد العينات.
    4. قم بتسمية كل محول دوار استناداً إلى عينة التعريف (ID).
    5. قطع الأغطية وتنعيم حواف الأعمدة الفردية تدور للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي.
    6. إدراج عمود الدوران الحمض النووي دون أنبوب جمع محول الدوار. تجاهل أنبوب جمع.
    7. تسمية 1.5 مل أنابيب جمع، وإدراج محولات الدوار.
    8. تعيين محولات الدوار في أجهزة الطرد المركزي بعد تحميل المخطط أداة تنقية الحمض النووي/رنا الآلي.
    9. إدراج 1,000 ميليلتر التصفية-النصائح الشركة المصنعة نصيحة الرفوف.
    10. إضافة المياه خالية من رناسي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي الشركة المصنعة 2 مل استناداً إلى عدد العينات (لكل تعليمات بروتوكول الجهاز محددة).
    11. إدراج الأنبوب في فتحه الأنبوب "ألف" من فتحات أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    12. تجاهل أي كاشف هو خلفها في زجاجات الكاشف والتعبئة مع حجم الحد أدنى من 10 مل.
    13. إدراج الزجاجات الكاشف في الرف زجاجة الكاشف (باستثناء زجاجة EB).
    14. إضافة EB الحارة من أنبوب 50 مل إلى موقف زجاجة الكاشف 6.
    15. تحقق من يتم وضع أنابيب 1.5 مل محكم في محولات الدوار.
    16. إغلاق غطاء هذا الصك وحدد: "الجيش الملكي النيبالي" ← "مجموعة أدوات استخراج" ← "الحيوانات والأنسجة والخلايا" ← "اسم 350 ميليلتر جزء مخصص بالحمض النووي كيت" ← "تحرير حجم شطف" 100 ميليلتر (افتراضي) أو 50 ميليلتر للكتلة الحيوية منخفضة عينات ← "البدء".
    17. عند الانتهاء، إزالة محولات الدوار من أجهزة الطرد المركزي ووضعها في العلبة.
    18. تجاهل العمود تدور الحمض النووي من دوار محول موقف 3.
    19. عدم تجاهل محولات الدوار، والجيش الملكي النيبالي في الموضع 2.
    20. إزالة أنابيب جمع 1.5 مل تحتوي على الحمض النووي التيد في موقف 3، وتخزينها في −20 درجة مئوية.
    21. جمع الأنابيب التي تحتوي على عينة من شاكر ومخزن في −20 درجة مئوية، إذا ترك أي عينة أكثر، تجاهل خلاف ذلك.
    22. تواصل مع البروتوكول "اسم 350 ميليلتر جزء ب الحمض النووي الريبي كيت" لتنقية المزيد من الجيش الملكي النيبالي.
    23. وسوف يتم تطهير الجيش الملكي النيبالي من حوالي 350 ميليلتر التدفق من خلال في الموقف الوسط من محولات الدوار.
  3. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. إدراج العمود تدور رنا دون أنبوب جمع وغطاء في محول الدوار.
    2. تسمية جديدة 1.5 مل أنابيب جمع وإدراج محول الدوار كما هو مبين في الدليل.
    3. تعيين محولات الدوار في أجهزة الطرد المركزي بعد تحميل المخطط أداة تنقية الحمض النووي/رنا الآلي.
    4. إغلاق غطاء هذا الصك وحدد: "الجيش الملكي النيبالي" ← "مجموعة الشركة المصنعة" ← "الحيوانات والأنسجة والخلايا" ← "القياسية جزء ب الحمض النووي الريبي" ← "بداية".
    5. عند الانتهاء، إزالة محولات الدوار من أجهزة الطرد المركزي ووضعها في العلبة.
    6. تجاهل الجيش الملكي النيبالي تدور العمود من موقف 3.
    7. إزالة أنابيب جمع 1.5 مل تحتوي على 30 ميليلتر التيد الجيش الملكي النيبالي في موقف 3، وتخزينها في −80 درجة مئوية.
    8. إزالة زجاجات كاشف.
    9. التخلص من محتويات محول الدوار من خلال القنوات الملائمة للنفايات الخطرة.
  4. محطة العمل نظيفة
    1. رش الملحقات جميع الآلي الحمض النووي/رنا تنقية الصك، مثل رفوف كاشف، وصينية، وأي أرض أخرى في استخدام حل تلوث غير الانزيمية وتترك لمدة 10 دقائق وشطف مع منزوع الماء (دي)، ثم السماح لهم الجافة.
    2. رذاذ الصك الآلي مع الشركة المصنعة فقط وافق الحل إزالة التلوث غير الانزيمية ويمسح داخل جهاز الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع جميع الأسطح في استعمال، وتترك لمدة 10 دقائق وثم يمسح مع الإيثانول 70%. لا تستخدم أنواع أخرى من الحلول التلوث كما أنها يمكن أن تلحق الضرر الصك.

3-المستهدفة 16S PCR الإعداد

ملاحظة: يجري الإعداد لبكر 16S في مساحة ما قبل تضخيم معين يقع داخل غرفة النظيفة. وتعد الكواشف والعينات وثم تحميلها على معالج سائل لأداء ال [بكر] لكل عينة في ثلاث نسخ (30 عينة، التي تشمل عينات حقيقية واستخراج عناصر إيجابية وسلبية، بالإضافة إلى عناصر المياه بكر 2 في ثلاث نسخ، لما مجموعة 96 العينات المجمعة وعناصر التحكم). بمجرد تجميع ردود فعل بكر ومختومة، يتم تحويل لوحة عينة cycler حرارية يقع في منطقة ما بعد تضخيم لركوب الدراجات.

  1. إعداد مساحة عمل
    1. تنظيف محطة عمل PCR. رش جميع الأسطح في الاستخدام مع الحمض النووي رناسي، الدناز، ديكونتامينانت، تليها المياه دي مرتين، وأخيراً إيثانول 70%.
    2. إعداد ورقة عمل PCR 16S (انظر ورقة عمل PCR 16S المستهدفة) مع قائمة عينة دقيقة، وتعيين المراقب مختلفة كبسولة تفجير لكل عينة9. طباعة ورقة العمل والخرائط لوحة (انظر 1 لوحة).
  2. إعداد مزيج سيد بكر
    ملاحظة: الاختيار التمهيدي 16S يستند إلى منطقة أهمية بالنسبة لدراسة معينة، وقد تتغير حسب نوع الدراسة أو عينة. ولذلك، قبل أن يأمر كبسولة تفجير، من المهم تأكيد ما هو مجال الرنا الريباسي 16S أفضل يستفيض ميكروبات الاهتمام لدراسة خاصة. هذا البروتوكول كما هو مكتوب لتضخيم المنطقة V4 16S. إذا لم يتم تحديد مختلف أجهزة الإشعال/المنطقة، ثم درجة الحرارة انلينغ في الدراجات الحرارية قد تتطلب التكيف.
    1. العمل في محطة عمل PCR إعداد كل شيء.
    2. إخراج 50-100 ميليلتر من عينات الحمض النووي من-20 درجة مئوية، وجميع المواد الكاشفة اللازمة، وذوبان الجليد لهم على الجليد. دوامة وتدور بإيجاز إلى أسفل.
    3. قبل هي المخفف الإشعال إلى تركيز العامل 5 ميكرومتر في حجم الحد أدنى من 20 ميليلتر.
    4. إعداد مزيج PCR الرئيسي في الأنبوب محددة 5 مل مع فقط التمهيدي إلى الأمام وفقا لحساب ورقة العمل.
  3. إعداد معالج السائل الروبوتية لإعداد PCR المؤتمتة
    1. للعينات، وإخراج محول عينة أداة 32-جيدا، وتحميل 50-100 ميليلتر من عينات الحمض النووي وفقا للخريطة لوحة 96-جيدا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      1. لكل لوحة بكر، قم بإعداد عناصر سلبية 2 بوضع 30 ميليلتر من الماء بكر في أنبوب عينة نظيفة.
      2. ضع جميع العينات على محول عينة الصك 32-جيدا مع قبعات مؤمنة في موقف فتح.
    2. لعكس كبسولة تفجير9
      1. إزالة الحد الأقصى لكل التمهيدي عكسي مع الباركود محددة # ق واحدة في وقت واحد (قفازات التغيير بينهما لتجنب التلوث المتبادل).
      2. وضع حد أقصى من 32 كبسولة تفجير على كاشف محول الصك.
    3. إخراج لوحة بكر 96-جيدا وتسميته باسم الدراسة ورقم العينة والتاريخ والأحرف الأولى الفني.
    4. تحميل معالج السائل الروبوتية
      1. ضع محول الكاشف في موقف B1. من أجل تجنب تأثير الحافة، بعناية وضع حافة واحدة من محول ضد الجانب قبضة، وبطء إسقاط حافة أخرى. تأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات.
      2. ضع محول عينة في موقف C1. تأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات.
      3. دوامة مزيج الرئيسي 5 مل، فتح الغطاء، ووضعه في موقف بشأن الرئيسي ميكس وكاشف البلوك الصك.
      4. ضع لوحة بكر على محول الصك 96-جيدا أن المقصود بعقد نصف تحاشي PCR لوحات.
      5. بدء التشغيل وحفظها كملف جديد.
      6. اتبع التعليمات والاختيار وضع علامة على كل موجه: واحد، تلميحات متوفرة، وهما، يتوفر مربع النفايات، وثلاثة، وابدأ.
    5. بعد الانتهاء من التشغيل، تحقق من وجود أخطاء التحقق من الجهاز لرسائل الإعلام بالخطأ.
    6. ختم اللوحة 12 أو قطاع 8 أحرف استهلالية، ودوامه بقوة، وتدور إلى أسفل لمدة 1 دقيقة استخدام لغزل لوحة 96-جيدا، ووضعه على الجليد أو في الثلاجة.
    7. إزالة الأنابيب التي تحتوي على عكس أجهزة الإشعال والعينات.
    8. تأخذ اللوحة 96-جيدا للغرفة بعد التضخيم وتحميل لوحة على cycler الحرارية ودورة وفقا للجدول لظروف ركوب الدراجات الحرارية (انظر الجدول 1).

4-استهداف 16S بكر وظيفة مراقبة الجودة باستخدام منصة المستندة إلى الشريط لجل التفريد

ملاحظة: بكر وظيفة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) وجميع الخطوات اللاحقة تجري في مجال تضخيم بعد معين للمختبر. ويتم تحليل الحمض النووي في محلل بلغة الحمض النووي/رنا الآلي.

  1. إعداد مساحة عمل
    1. تنظيف محطة العمل عن طريق رش جميع الأسطح في الاستخدام مع رناسي، الدناز، الحمض النووي ديكونتامينانت، تليها المياه دي مرتين، وأخيراً إيثانول 70%.
    2. جمع جميع اللوازم والمعدات اللازمة.
  2. إعداد الكواشف
    1. وضع المخزن المؤقت للعينة، وسلم في فورتيكسير التحكم في درجة الحرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. في حين الكواشف هي الاحماء، إعداد عينات PCR بتجميع replicates بكر 3 لكل عينة في أنبوب واحد
  4. تحميل عينات في الصك.
  5. باختصار من دوامة وتدور أسفل أنابيب مع المجمعة PCR المنتج.
  6. ضع لوحة 96، حسنا هذا الصك على رف في الرايت وتسميته.
  7. بإيجاز ودوامه، وتدور أسفل سلم وعينه المخزن المؤقت.
  8. إضافة ميليلتر 3 عينة المخزن المؤقت لكل بئر من لوحة جيدا 96 (حاجة على الأقل 53 ميليلتر/شاشة الشريط).
  9. تشغيل عدد زوجي من العينات؛ إذا كان هناك عدد فردي من العينات، إضافة 4 ميليلتر من عينة المخزن المؤقت إلى بئر فارغة.
  10. إضافة 1 ميليلتر من سلم إلى سلم جيدا.
  11. عقب الخريطة، وإضافة 1 ميليلتر من المجمعة PCR المنتج في مكان مخصص جيدا.
  12. لوحة غطاء مع ختم إحباط
  13. دوامة لوحة باستخدام فورتيكسير هذا الصك ومحول 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  14. تدور وصولاً إلى موقف العينة في الجزء السفلي من الأنبوب، إذا كان هناك فقاعات تدور إلى أسفل مرة أخرى.
  15. بدء تشغيل البرنامج.
  16. تحميل نصائح الشريط وتحميل الشاشة في الصك.
  17. تحميل عينات إلى محلل بلغة مع محول 96-جيدا.
  18. إعداد تشغيل مع برنامج وحدة تحكم.
  19. تأكد من تحديد الآبار حتى مرقمة.
  20. اكتب معرفات عينة.
  21. تحقق من أن يسلط الضوء على جميع الآبار من الشريط الشاشة باللون الرمادي.
  22. تأكد من المحلل تسلم جميع النصائح ماصة.
  23. حدد ابدأ ثم حدد اسم ملف حفظ النتائج (دراسة اسم ورقم العينة وتاريخ).
  24. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل.
  25. بعد الانتهاء من التشغيل، تجاهل تلميح الشاشة الشريط وأنابيب.
  26. تحليل البيانات لذروة 16S شمال البحر الأبيض المتوسط (بين 315-450 شركة بريتيش بتروليوم ل V4). ستختلف هذه الذروة كبسولة تفجير المحدد.

5-مكتبة حساب، وتجميع الموارد، وتنظيف، ومراقبة الجودة

  1. وبعد تحديد حجم أمبليكون ومولاريتي لجميع العينات، تجميع المكتبات لتحقيق الحجم المطلوب النهائي وشمال البحر الأبيض المتوسط لمكتبة المجمعة (انظر نموذج الحساب).
  2. تنظيف والتركيز مكتبة المجمعة باستخدام تنقية السليكا-المستندة إلى غشاء كيت لمنتجات PCR، وفقا للشركة المصنعة البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
    1. الوت الحمض النووي مع وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر.
  3. قياس تركيز المكتبة تنظيفها فورا باستخدام مجموعة مزدوجة من حساسية عالية الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل فلوروميتير، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    1. تمييع 2 ميليلتر من مكتبة المجمعة وتنظيفها مع ميليلتر 198 تمييع المخزن المؤقت بالإضافة إلى صبغ (تخفيف 1: 100).
    2. سجل القيمة المقاسة من جهاز فلوروميتريك وتحويلها وفقا لعامل التخفيف.
  4. استخدام تركيز القراءة (نانوغرام/ميليلتر) لمكتبة المجمعة، حساب molarity مكتبة في شمال البحر الأبيض المتوسط. استخدام 1 ميليلتر مكتبة غير مخفف لقياس OD260/280 عن جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي.
    ملاحظة: تشير قيمة 1.8 2.0 إلى النقاء الكافية للمكتبة.
  5. تخزين مكتبة النهائي-20 درجة مئوية حتى جاهزة لتسلسل الجيل القادم.

النتائج

ويشمل البروتوكول المعروضة هنا خطوات مهمة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) لضمان أن تجتمع البيانات التي تم إنشاؤها بالنقاط المرجعية لبروتوكول التحكم حساسية وخصوصية، والتلوث. يتبع الأول QC خطوة البروتوكول [بكر] تضخيم المنطقة V4 16S (الشكل 2). ميليلتر واحد من المنت...

Discussion

تستهدف الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S تقنية تستخدم على نطاق واسع وسريع ل توصيف ميكروبيومي18. ومع ذلك، العديد من العوامل، بما في ذلك الآثار دفعة والتلوث البيئي، والتلوث عبر العينة، حساسية وإمكانية تكرار نتائج يمكن أن تضر بالنتائج التجريبية وارباك على تفسير7<...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نود أن نشكر هيلتي أديسيتييو، دكتوراه، وشانجكسين يانغ، دكتوراه لتطوير البروتوكول. وقدمت الدعم الشامل للدولي الأمهات طب الأطفال المراهقين الإيدز السريرية المحاكمات المجموعة (إيمباكت) "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ضمن "أرقام جائزة" UM1AI068632 (خط إيمباكت)، UM1AI068616 (إيمباكت سدمك) و UM1AI106716 (LC إيمباكت)، بتمويل مشترك من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extraction kit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo MixerFisher Scientifictemperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME BeadsMP Biomedicals116914050bead tube
QIAgen TissueLyzerQiagen85300automated sample disruptor adapter set
QIAshredder columnQiagen 79654
QIAgen RB tubemanufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticwareQiagen9001292automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plusApplichemA7089non-enzymatic decontamination solution
EB BufferQiagen19086elution buffer
QIAgility and related plasticwareQiagen9001532robotic liquid handler
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinNo Catalog #'sdesigned and ordered
 96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticwareAgilentG2964AAautomated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent5067-5585Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research50444470PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeq   IlluminaNo Catalog #'snext generation sequencer

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 16S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved