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要約

人間のミルク、その他低バイオマス サンプル タイプから 16 s rrna ターゲット シーケンスの半自動化されたワークフローが表示されます。

要約

微生物の研究が比較的安価、迅速、かつ高スループット シーケンスの開発と普及します。しかし、これらのすべてのテクノロジと同様再現性のある結果は適切な予防とコントロールを組み込んだ室のワークフローに依存します。これは、バクテリアの DNA を汚染すると誤解を招く結果を生成できます低バイオマス サンプルと特に重要です。この記事は、低半ば throughput スケールの 16S リボソーム RNA (rRNA) V4 領域のターゲット シーケンスを使用して人間の母乳サンプルから微生物を識別するために半自動化されたワークフローを詳しく説明します。プロトコル記述から全乳を含む試料: 換散、核酸抽出、増幅 16S rRNA 遺伝子と品質への取り組みと図書館準備の V4 領域のサンプルします。重要なは、プロトコルおよび議論は顕著な準備と適切な正と負のコントロール、PCR 阻害物質の除去、サンプルの汚染を含む環境、試薬による低バイオマス試料の分析には、問題を考慮または実験のソース、および再現性を確保するために設計されたベスト ・ プラクティスの実験。前述のプロトコルは母乳サンプルに固有ですが、綿棒、きちんとした、または保全バッファーで安定化を凍結で収集されたサンプルを含む多数の低と高バイオマス サンプル タイプに適応されます。

概要

人間を植民地化する微生物は人間の健康、代謝、免疫の開発、疾患感受性と予防接種や薬物療法1,への応答に影響を及ぼす疾患はとても重要と考えられて2. 現在細菌叢の人間の健康に及ぼす影響を理解するための努力を強調内のローカライズされたサイトだけでなく、定義された解剖学的なコンパートメント(すなわち皮膚、腸、口腔など)に関連付けられている微生物の同定これらのコンパートメント3,では、4が。これらの調査の努力を支え、急速な出現と増加アクセシビリティ サンプルの微生物の遺伝の内容 (マイクロバイ) の解析の並列プラットフォームを提供する次世代シーケンサー (NGS) 技術です。多くの生理学的なサンプルに関連付けられたマイクロバイは複雑で豊富な (すなわちスツール), しかし、いくつかのサンプル、マイクロバイで表される (すなわち母乳、下気道) の低いバイオマス、感度、実験的工芸品および可能な汚染の主要な問題になります。マイクロバイ研究と適切な実験的なデザインの共通の課題複数レビュー記事5,6,7,8の対象とされています。

ここに記載した NGS の堅牢な実験的パイプラインは母乳のマイクロバイを特徴付ける rRNA の 16S V4 地域9のターゲット シーケンスに基づきます。人間のミルクのマイクロバイ分析は複雑なヒトの DNA レベル背景11,12,13,14の本質的に低いバイオマス10でだけ、また高と抽出した核酸の PCR 阻害剤15,16の潜在的な持ち越し。このプロトコルは、市販の抽出キットおよびサンプル調製バッチの間で変動を最小限に抑え、半自動化されたプラットフォームに依存します。プロトコルの各ステップを検証し、パイプラインの頑健性の独立したメトリックを提供する品質管理としてのサンプルと一緒に処理は、明確に定義された細菌モック コミュニティを組み込まれています。スツール、直腸、膣、皮膚、疎性結合、および経口綿棒10,17, を含む他のサンプル タイプに容易に適応可能であるそれとの開始点として使用できるプロトコルとしては説明母乳サンプルに固有ですが、マイクロバイ解析を実行したい研究者。

プロトコル

すべてのプロトコルについては、適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要がありますと厳しい汚染防止アプローチが取られる必要があります。作業後の増幅作業領域のサンプルの汚染を最小限に抑えるために領域中古増幅から作業の流れを確認します。使用すべての供給、無菌、パイロジェン DNA、DNase、RNase の無料です。すべてのピペット チップ、フィルターされます。プロトコル手順のフローチャート (図 1) を提供しています。

1. サンプル換散

注: サンプル換散および核酸抽出、クリーン ルーム環境で DNA ・ RNA 抽出キットを使用して、エンジニア リングと手続き型のコントロールがあるサンプルへの環境細菌の導入を最小限にするを実行するされます。

  1. 作業領域の準備
    1. きれいな安全キャビネット (BSC) 作業領域の任意の核酸の汚染を除去するために適切な表面クリーナー付きです。
    2. 温度制御 vortexer をオンにし、37 ° C に設定
  2. ためチオシアン酸溶解バッファーを準備 (材料の表を参照)
    1. 析出物の換散バッファーをチェックします。37 ° C で温暖化によって再溶解析出物
    2. 6 μ L β-メルカプトエタノール (β-ME) の換散バッファーの 600 μ L を各サンプルに備えます。サンプルあたりの余分な 20% ボリュームを検討します。
  3. サンプル準備
    1. 全乳が固定されている場合は、氷の上解凍します。全体の分注 5 mL 15 mL または 5 mL BSC の生殖不能の管にミルク氷の上保管してください。
    2. 細胞のペレットへの 4 ° C で 5,000 × g で 10 分間の分注 5 mL ミルクをスピンします。
    3. チューブ、プラスチック製のヘラや大型の最上位のレイヤーがピペット チップを退屈させる今、脂肪質の層を削除します。
    4. ペレットを乱すことがなく 100 μ L を除くすべての上清を除去します。
    5. 1 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の再でペレットを洗浄します。
    6. 1 ネガティブ コントロールを準備するには、5 mL チューブに 1 mL の滅菌 PBS を追加します。
    7. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに懸濁液を転送し、1 分 (室温 (RT) で 5,000 g x) の遠心機でスピンします。
    8. 清/脂肪酸レイヤー全体を破棄するのに 1,000 μ L 滅菌フィルターのピペット チップを使用します。
    9. 凍結されませんを同じ日に、スナップ抽出セルは、エタノール/ドライ氷スラリーのそれを置くことによってペレット、-80 ° C のフリーザーにすぐに転送すること。
  4. サンプルの混乱と均質化 (ビーズ)
    1. ペレットには β-ME を含む換散バッファーの 600 μ L を追加し、懸濁液をビード管に転送します。
    2. 12 の各抽出バッチには、(次の手順で準備) 1 肯定的な制御、1 ネガティブ コントロール (上記のステップ 3.7 で準備)、10 個のサンプルが含まれています。
      1. 1 肯定的な制御の換散バッファーと細菌のモック サンプル (使用する模擬コミュニティの濃度がある、一度抽出 DNA の約 0.2 ng/μ L) の 20 μ L を準備します。
    3. 渦すべてビーズ 15 は積極的にチューブ s。
    4. 700-800 の rpm で振とうしながら 10 分の 37 ° C に温度制御 vortexer のサンプルを加熱します。
    5. チューブを自動サンプル攪乱アダプター セットに読み込みます。
    6. ビーズを 30 hz 1 分間破った。
    7. アダプタ セットを分解し、左アームから楽器の右アームに設定サンプル プレートとアダプターを手動で切り替えます。
    8. ビーズは、30 Hz で別の 1 分のビート。
    9. 25 ° C で 3 分間 17,200 x g で遠心管
    10. 200 μ L ピペット、サンプルかビーズの上部に脂肪層の下部にサンプルの残留を取得されホモジナイザー列に適用しないように注意して、上清をすべて取り外します。
    11. 最高速度は、25 ° C で 3 分間 17,200 の x g で遠心ホモジナイザー列
    12. (他のチューブを使用していない) DNA と RNA の浄化用自動計測器で使用するため 2 mL 製造元の遠心チューブに 350 μ L の溶出液を転送します。任意の残留脂肪層を転送しないように注意します。
    13. 流水量が未満 350 μ L の場合は、350 μ L の最終巻に β ME の換散バッファーを追加します。
    14. 自動 DNA 精製装置を用いて核酸の分離に 2 h まで進む前に RT でサンプルのまままたは-80 ° C で凍結
  5. 作業領域をクリーニング中
    1. きれいにすべての表面非酵素的除染液を使用、10 分残して 70% エタノールをスプレーし、表面を拭きます。

2. DNA ・ RNA を分離します。

  1. 作業領域の準備
    1. 熱ブロックをオンにし、温度を 70 ° C に設定
    2. 温度制御 vortexer をオンにし、温度を 37 ° C に設定
    3. ウォーム アップ 10 mM トリス-塩素、pH 8.5、70 ° C に 50 mL のチューブを含む溶出バッファー (EB)
    4. ウォーム アップ 350 μ L まで完全に 37 ° C で 2 mL 管の凍結サンプル溶解液の解凍せず任意の沈殿物 (約 10 分)。
  2. DNA 精製
    1. 渦と遠心と 2 mL チューブ サンプルに簡潔に (10 の 3000 × g s)。
    2. 次の製造元の指示に従って、自動 DNA ・ RNA 精製機器の読み込みグラフ シェーカーに 2 mL の管を挿入します。
    3. ローター アダプターを得るし、サンプルの数に基づいてトレイにそれらを設定します。
    4. サンプルの識別 (ID) に基づいて各ローター アダプターのラベルを付けます。
    5. 蓋を切断し、DNA および RNA のための個々 のスピンの列の縁を滑らか。
    6. ローター アダプターにコレクションの管なし DNA スピン列を挿入します。コレクションの管を破棄します。
    7. コレクション チューブ 1.5 mL のラベル、ローター アダプターに差し込みます。
    8. 自動化された DNA ・ RNA 精製機器の負荷グラフを次遠心分離機にローター アダプターを設定します。
    9. チップラックに製造元の 1,000 μ L フィルター チップを挿入します。
    10. (特定プロトコル命令) あたりのサンプルの数に基づいて 2 mL 製造元の微量遠心チューブに RNase フリーの水を追加します。
    11. 遠心チューブ スロットのスロット"A"のチューブ、チューブを挿入します。
    12. 試薬瓶や 10 mL の最低量でいっぱいに残される試薬を破棄します。
    13. 試薬ボトルを除く EB ボトル) 試薬ボトル ラックに挿入します。
    14. 試薬ボトル位置 6 に 50 mL のチューブから温かみのある EB を追加します。
    15. 1.5 mL チューブ、ローター アダプターにしっかりと配置されますを確認します。
    16. 計測器のふたを閉じ、選択:"RNA"→「抽出キット」→「動物、組織および細胞」→「キットの名 350 μ l 一部 A カスタム DNA」→ 100 μ L (既定値) または低いバイオマス サンプル → 50 μ L の溶出容量の編集"を始めます。
    17. 完了したら、遠心分離機からローター アダプターを削除し、トレイの上に置きます。
    18. ローター アダプター位置 3 から DNA の回転カラムを破棄します。
    19. ローター アダプターは捨てないで、RNA は 2 の位置です。
    20. 1.5 mL 採血管の位置が 3 で溶離された DNA を含むを削除し、− 20 ° C で保存
    21. 任意のサンプルを残っている、そうでなければ破棄場合シェーカー、− 20 ° C でストアからサンプルを含むチューブを収集します。
    22. 「キットの名 350 μ l パーツ B RNA」さらに RNA の浄化のためのプロトコルを続行します。
    23. 約 350 μ L フロースルー ローター アダプターの中央の位置にあるからの RNA の浄化を行います。
  3. RNA の浄化
    1. ローター アダプターにコレクション チューブ、蓋なし RNA スピン列を挿入します。
    2. 新しい 1.5 mL を採血管ラベル、マニュアルに示されているように、それらをローター アダプターに挿入します。
    3. 自動化された DNA ・ RNA 精製機器の負荷グラフを次遠心分離機にローター アダプターを設定します。
    4. 計測器のふたを閉じ、選択:"RNA"→「製造元のキット」→「動物、組織および細胞」→「標準パーツ B RNA」→「スタート」
    5. 完了したら、遠心分離機からローター アダプターを削除し、トレイの上に置きます。
    6. 3 の位置から RNA スピン列を破棄します。
    7. 1.5 mL 採血管の位置が 3 で 30 μ L の溶出 RNA を含むを削除し、−80 ° C で保存
    8. 試薬ボトルを削除します。
    9. ローター アダプター内容を通じて適切な有害廃棄物の処分します。
  4. きれいな作業駅
    1. すべて自動化された DNA ・ RNA 精製機器の付属品、試薬棚、トレイの他の表面など非酵素的除染液を使って、10 分を残して、洗い流しスプレー (DI) は、純水、し、乾燥させます。
    2. スプレーだけメーカーと自動計測器承認非酵素的除染液、使用中のすべてのサーフェスとともに遠心分離機の内側を拭いて、10 分放置して、70% エタノールで拭いてくださいください。楽器を損傷することができますは、除染のソリューションの他の型を使用しないでください。

3. ターゲット 16S PCR セットアップ

注: 16S PCR のためセットアップはクリーン ルーム内にある指定された中古増幅ワークスペースで行われます。試薬およびサンプル準備、3 通 (30 サンプル、96 の合計のための 3 通の真のサンプルと抽出の正と負のコントロール プラス 2 PCR 水コントロールを含む各サンプルの PCR を行う液体ハンドラーに読み込まれます複合サンプルやコントロール)。PCR の反作用はアセンブルされ、シール、一度サンプル プレートはサイクリングの後の増幅領域にあるサーマルサイクラーに移ります。

  1. 作業領域の準備
    1. PCR のワークステーションをクリーンアップします。スプレー DNase、RNase DNA で使用中のすべての表面 decontaminant、DI 水 2 回に続いて、最終的に 70% のエタノール。
    2. 16S PCR ワークシートを準備 (ターゲット 16S PCR ワークシートを参照してください)、正確なサンプル リストと各サンプル9に割り当てる別のバーコードのプライマー。ワークシートと (プレート 1 参照) プレート マップを印刷します。
  2. PCR マスター ミックスの準備
    注: 16S プライマー選択特定の研究関心領域に基づいており、研究やサンプルの種類によって変更することがあります。そのため、プライマーを注文する前に最高の 16S rRNA の領域を増幅する特定の研究のための興味の微生物を確認することが重要です。書かれているように、このプロトコルは、増幅 16S V4 地域です。熱サイクル焼鈍温度で異なるプライマー/地域を選択すると、調整が必要があります。
    1. すべての準備を PCR のワークステーションで作業します。
    2. -20 ° C からの DNA のサンプルの 50-100 μ L と、必要なすべての試薬を取り出して、氷の上にそれらを解凍します。渦と簡単に回転停止。
    3. プライマーは、20 μ L の最小ボリュームで 5 μ M の作業濃度に希釈して事前。
    4. ワークシート上の計算によると前方のプライマーだけで特定 5 mL チューブ PCR マスター ミックスを準備します。
  3. 自動化された PCR セットアップのロボットの液体ハンドラーを準備
    1. サンプルについては、32 よく楽器のサンプル アダプターを取るし、製造元の指示に従って 96 ウェル プレート マップによると DNA サンプルの 50-100 μ L を読み込みます。
      1. 各 PCR プレート 30 μ L の PCR 水きれいなサンプル チューブ内に配置することによって 2 つの否定的なコントロールを設定します。
      2. オープン ポジションでロック キャップと 32 も楽器のサンプル アダプターにすべてのサンプルを配置します。
    2. 逆のプライマー9
      1. 固有のバーコードをそれぞれ逆プライマーのキャップを削除 # ' s の 1 つ時 (間にクロス汚染を避けるために手袋を変更)。
      2. 楽器の試薬アダプターで最大 32 プライマーを配置します。
    3. 96 ウェル PCR プレートを取り出し、試験名、サンプル数、日付、および技術者のイニシャルとラベルします。
    4. ロボットの液体ハンドラーの読み込み
      1. B1 の位置に試薬アダプターを配置します。エッジ効果を避けるためには、グリップ側に対してアダプターの一方の端を慎重に配置、ゆっくり他のエッジをもたらします。アダプターのすべてのコーナーにプッシュすることを確認します。
      2. 位置 C1 にサンプル アダプターを配置します。アダプターのすべてのコーナーにプッシュすることを確認します。
      3. 渦 5 mL マスター ミックスは、キャップを開き、楽器のマスター ミックス試薬ブロックを位置 A に配置します。
      4. 半分はいた PCR プレートを保持するために、96 ウェル楽器のアダプターに PCR プレートを配置します。
      5. 実行を開始し、新しいファイルとして保存します。
      6. 画面の指示に従って、チェック マーク各プロンプト: 1 つのヒントがあります、2、廃棄物ボックスがあり、3 つを開始。
    5. 実行が完了した後は、エラー メッセージのためにマシンをチェックしてエラーがないを確認します。
    6. 積極的に、12 または 8 ストリップ キャップ、渦とプレートをシールし 96 ウェル プレート スピナーを使用して 1 分のスピン ・ ダウンと氷や冷蔵庫の中に配置。
    7. 逆のプライマーとサンプルを含むチューブを取り外します。
    8. 後増幅部屋に 96 ウェル プレートを取るし、サーマルサイクラーと温度サイクル条件 (表 1参照) の表に従ってサイクルの上にプレートをロードします。

4. ターゲット 16S ポスト PCR 品質管理ゲル電気泳動用テープ ベースのプラットフォームを使用して

注: ポスト PCR 品質管理 (QC) およびすべてのそれに続くステップ演習の指定後増幅領域で実行されます。DNA は、自動の DNA ・ RNA フラグメント アナライザーで分析されます。

  1. 作業領域の準備
    1. RNase、DNase、DNA で使用中のすべての面の decontaminant、続いて DI 水 2 回散布、最終的に 70% のエタノールでワークステーションをクリーンアップします。
    2. すべての消耗品と装備品を収集します。
  2. 試薬を準備します。
    1. 30 分以上の 25 ° c の温度制御 vortexer のサンプル バッファーとはしごを配置します。
  3. 試薬をウォーミング アップ中、単管に各サンプルに対して 3 PCR レプリケートをプールすることによって PCR のサンプルを準備します。
  4. 楽器のサンプルを読み込みます。
  5. 簡単に渦とプールされた PCR の製品でチューブをスピン。
  6. RT でラックに楽器の 96 ウェル プレートを置き、それをラベルします。
  7. 簡単に渦とスピンはダウン サンプル バッファーとはしご。
  8. (必要性少なくとも 53 μ L/スクリーン テープ) 96 well プレートの各ウェルに 3 μ L のサンプル バッファーを追加します。
  9. 偶数の数サンプルを実行します。サンプルの数が奇数がある場合空井戸にサンプル バッファーの 4 μ L を追加します。
  10. はしごにも梯子の 1 μ L を追加します。
  11. その指定にプールされた PCR の製品の 1 μ L を追加次のマップも。
  12. 箔シールとカバー プレート
  13. 渦 2,000 rpm で 1 分の楽器の vortexer とアダプターを使用してプレート。
  14. ある場合は、管の下部にサンプルをスピンの泡の位置まで再びスピンします。
  15. ソフトウェアを起動します。
  16. 楽器に画面のテープと読み込みヒントを読み込みます。
  17. 96 ウェル アダプターとフラグメント解析にサンプルをロードします。
  18. コント ローラーのソフトウェアの実行を設定します。
  19. 偶数の井戸を選択することを確認します。
  20. サンプル Id を記述します。
  21. スクリーン テープのすべての井戸が灰色で強調表示されることを確認します。
  22. アナライザーがすべてのピペット チップを認識していることを確認します。
  23. 開始を選択し、(名前、サンプル番号と日付を調査) 結果を保存するファイル名を指定します。
  24. 詳細については、製造元の指示を参照してください。
  25. 実行の完了後は、ヒント、スクリーン テープやチューブを破棄します。
  26. 16S ピーク nM (V4 用 315 450 bp) の間のデータを分析します。このピークは、プライマーの選択によって異なります。

5. ライブラリの計算、プーリング、クリーンアップ、および QC

  1. 増幅サイズとすべてのサンプルのモル濃度が決まったら、プール最終目的のボリュームとプールされたライブラリの nM を達成するためにライブラリ (サンプル計算を参照してください)。
  2. クリーンアップと濃縮シリカ膜による浄化を使用してプールのライブラリ キットの製造元によると、PCR の製品のプロトコル (材料の表を参照してください)。
    1. 50 μ L の最終巻で DNA を溶出します。
  3. 製造元のプロトコルによると、蛍光光度計の二重鎖 DNA 高感度キットを使用してすぐに洗浄されたライブラリの濃度を測定します。
    1. 198 μ L 希釈バッファー プラス色素 (1: 100 希釈) のプールと洗浄されたライブラリの 2 μ L を希釈します。
    2. 蛍光装置から測定値を記録し、希釈倍率によると変換します。
  4. プールされたライブラリの (ng/μ L) を読み取り濃度を使用すると、nM のライブラリのモル濃度を計算します。1 μ L 原液ライブラリを使用すると、微量分光光度計の OD260/280 を測定します。
    注: 1.8 2.0 の値は、ライブラリの適切な純度を示します。
  5. 次世代シーケンシングの準備ができるまで、-20 ° C で最後のライブラリを格納します。

結果

ここで提示されたプロトコルには、生成されたデータのミートがプロトコルの感度、特異性、および汚染制御のベンチマーク テストを確認する重要な品質管理 (QC) 手順が含まれています。プロトコルの最初の品質管理手順に従います PCR 増幅 16S V4 地域 (図 2)。各サンプルからの PCR の製品の 1 つの μ L は 315 450 bp (図 2の赤?...

ディスカッション

16S rRNA の対象となる次世代シーケンスは、マイクロバイ評価18の広く使用されている、急速な手法です。バッチの効果、環境汚染、サンプルのクロスコンタミネーション、感度、再現性など、多くの要因が悪影響実験結果に影響を与えるし、その解釈7,19を混同,20. 良い実験的なデザイン、適切なコントロ?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

プロトコルの開発の Helty Adisetiyo 博士と Shangxin 博士はヤンに感謝したいと思います。全体的なサポートのため、国際母性小児思春期エイズ臨床試験グループ (IMPAACT) は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の国立衛生の健康 (NIH) [受賞番号によって提供されました。UM1AI068632 (IMPAACT LOC)、UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) と UM1AI106716 (IMPAACT LC)、児童保健および人間の開発 (NICHD) のユーニス · ケネディ · シュライバーの国立研究所、国立精神衛生研究所 (NIMH) からの共同資金とします。内容は著者の責任と NIH の公式見解を必ずしも表さない。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extraction kit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo MixerFisher Scientifictemperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME BeadsMP Biomedicals116914050bead tube
QIAgen TissueLyzerQiagen85300automated sample disruptor adapter set
QIAshredder columnQiagen 79654
QIAgen RB tubemanufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticwareQiagen9001292automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plusApplichemA7089non-enzymatic decontamination solution
EB BufferQiagen19086elution buffer
QIAgility and related plasticwareQiagen9001532robotic liquid handler
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinNo Catalog #'sdesigned and ordered
 96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticwareAgilentG2964AAautomated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent5067-5585Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research50444470PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeq   IlluminaNo Catalog #'snext generation sequencer

参考文献

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