Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un workflow semi-automatisé est présenté pour le séquençage des ARNr 16 s de lait maternel et d’autres types d’échantillons de faible biomasse ciblé.

Résumé

Études des communautés microbiennes sont multipliées avec le développement du séquençage relativement peu coûteux, rapide et haut débit. Cependant, comme avec toutes ces technologies, des résultats reproductibles dépendent un flux de travail de laboratoire qui intègre les contrôles et les précautions d’usage. Ceci est particulièrement important avec des échantillons de faible biomasse où la contamination ADN bactérien peut générer des résultats trompeurs. Cet article décrit un flux de travail semi-automatique pour identifier les microbes des échantillons de lait maternel à l’aide de séquençage ciblé de la région de V4 de l’ARN ribosomique (ARNr) 16 s sur une échelle de faible à moyenne throughput. Le protocole décrit la préparation de l’échantillon de lait entier, y compris : lyse, extraction des acides nucléiques, l’amplification de la région de la V4 du gène ARNr 16 s et préparation de bibliothèque avec des mesures de contrôle de la qualité de l’échantillon. Ce qui est important, le protocole et la discussion tenir compte des questions qui sont importantes pour la préparation et l’analyse des échantillons de faible biomasse, y compris les contrôles positifs et négatifs appropriés, enlèvement d’inhibiteur de la PCR, contamination des échantillons par environnement, réactif, ou sources expérimentales et des pratiques exemplaires expérimentaux visant à garantir la reproductibilité. Le protocole tel que décrit est spécifique aux échantillons de lait maternel, mais il est adaptable à nombreux types d’échantillons de faible et haute-biomasse, y compris les échantillons sur écouvillons, congelés soignée, ou stabilisés dans un tampon de préservation.

Introduction

Les communautés microbiennes qui colonisent les humains sont censées être d’une importance cruciale pour la santé humaine et les maladies qui influencent le métabolisme, développement immunitaire, susceptibilité à la maladie et les réponses à la vaccination et le médicament de thérapie1, 2. efforts pour comprendre l’influence de la microflore sur la santé humaine actuellement mettent l’accent sur l’identification des microbes associés définis compartiments anatomiques(p. ex., peau, intestin, oral, etc.), ainsi que des sites localisés au sein ces compartiments3,4. Ces efforts d’enquête repose sur l’émergence rapide et une plus grande accessibilité des technologies de séquençage de prochaine génération (NGS) qui fournissent une plate-forme massivement parallèle pour l’analyse du contenu génétique microbiens (microbiome) d’un échantillon. Pour beaucoup d’échantillons physiologiques, le microbiome associé est complexe et abondante (c.-à-d., selles), mais, pour certains échantillons, le microbiome est représenté par la biomasse microbienne faible (p. ex., le lait humain, des voies respiratoires inférieures) où sensibilité, objets d’art expérimentales et contamination possible devient grands enjeux. Les défis communs du microbiome études et conception expérimentale appropriée ont fait l’objet de multiples examen articles5,6,7,8.

Présentées ici un pipeline expérimental robuste de NGS repose sur le séquençage ciblé de l’ARNr 16 s V4 région9 pour caractériser le microbiome du lait maternel. Analyse de microbiome du lait maternel n’est pas compliqué que par une faible biomasse microbienne10, mais en plus de haut niveaux d’ADN humain fond11,12,13,14 et report éventuel du PCR inhibiteurs15,16 extrait acide nucléique. Ce protocole repose sur des plateformes semi-automatiques qui peuvent aider à réduire au minimum la variabilité entre les lots de préparation échantillon et de kits d’extraction disponible dans le commerce. Il intègre une communauté simulacre bactérienne bien définie comme un contrôle de la qualité pour valider chaque étape dans le protocole et fournir une métrique indépendante de la robustesse du pipeline de traitement aux côtés d’échantillons. Bien que le protocole comme décrit est spécifique pour les échantillons de lait maternel, il est facilement adaptable à d’autres types d’échantillon dont les selles, rectale, vaginale, peau, écouvillons aréolaires et orale10,17et peut servir de point de départ pour chercheurs qui souhaitent effectuer des analyses sur le microbiome.

Protocole

Pour toutes les étapes du protocole, portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté, et méthodes de prévention de contamination rigoureuses doivent être prises. Observer le flux de travail de pré-amplification zones de chantiers après amplification pour minimiser la contamination des échantillons de travail. Toutes les fournitures utilisées sont stériles, sans RNase, DNase, ADN et pyrogène. Toutes les pointes de pipette sont filtrés. Un diagramme des étapes protocole est fourni (Figure 1).

1. lyse de l’échantillon

NOTE : Lyse de l’échantillon et l’extraction des acides nucléiques sont effectuées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN/ARN dans un environnement de salle blanche où des contrôles techniques et des procédures sont en place pour réduire au minimum l’introduction de bactéries environnementales aux échantillons.

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le cabinet de prévention des risques biotechnologiques (BSC) travail endroit avec nettoyeur approprié afin d’éliminer toute contamination de l’acide nucléique.
    2. Allumez le vortexer thermorégulées et réglez-le à 37 ° C.
  2. Préparer le tampon de lyse guanidinium thiocyanate (voir Table des matières)
    1. Vérifier le tampon de lyse des précipités. Dissoudre à nouveau précipités par le réchauffement à 37 ° C.
    2. Préparez 600 µL de tampon de lyse avec 6 µL β-mercaptoéthanol (β-ME) pour chaque échantillon. Considérons un volume supplémentaire de 20 % par exemple.
  3. Préparation des échantillons
    1. Si le lait entier est gelé, il dégel sur glace. Aliquote 5 mL de tout le lait dans un 15 mL ou un tube de 5 mL stérile en BSC et garder sur glace.
    2. Faire tourner le lait 5 mL aliquot pendant 10 min à 5 000 x g à 4 ° C pour granuler des cellules.
    3. Enlever la couche de graisse, maintenant la couche supérieure dans le tube, avec une spatule en plastique ou grand alésage de pipette.
    4. Sans déranger le culot, retirez tous le surnageant à l’exception de 100 µL.
    5. Laver le culot de resuspendant dans 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
    6. Préparer, 1 contrôle négatif en ajoutant 1 mL de PBS stérile dans un tube de 5 mL.
    7. Transférer la suspension dans un tube à centrifuger de 1,5 mL nettoyer et tourner dans une micro-centrifugeuse pendant 1 min (5 000 x g à la température ambiante (RT)).
    8. Utiliser un embout de pipette filtré stérile 1 000 µL à jeter la couche entière de surnageant/gras.
    9. Si ne pas extraire le même jour, snap geler la cellule pellet en le plaçant dans une bouillie de glace éthanol/sec et transférez-le immédiatement au congélateur à-80 ° C.
  4. Perturbation de l’échantillon et homogénéisation (perle-battant)
    1. Ajouter 600 µL de tampon de lyse contenant du β-ME au culot et transférer la suspension dans un tube de perles.
    2. Chaque lot de l’extraction de 12 contienne 10 échantillons, 1 contrôle négatif (préparé à l’étape 3.7 ci-dessus) et 1 témoin positif (préparé à l’étape suivante).
      1. Préparer 1 contrôle positif avec le tampon de lyse et 20 µL de l’échantillon simulé bactérienne (la communauté de simulation utilisée a une concentration, une fois extraite, environ 0,2 ng/µL d’ADN).
    3. Vortex toutes perles tubes vigoureusement pendant 15 s.
    4. Échantillons de chaleur sur le vortexer thermorégulées à 37 ° C pendant 10 min, avec agitation à 700-800 tr/min.
    5. Charger des tubes dans l’ensemble d’adaptateurs de disruptor échantillon automatisé.
    6. Perle a battu PDT 1 min à 30 Hz.
    7. Démonter l’ensemble adaptateur et basculer manuellement l’adaptateur réglée avec les plaques de l’échantillon entre le bras gauche et le bras droit de l’instrument.
    8. Perle a battu pendant 1 min à 30 Hz.
    9. Tubes à centrifuger à 17 200 g, pendant 3 min à 25 ° C.
    10. Retirez toutes le surnageant avec une pipette de 200 µL, en veillant à ne pas obtenir l’un de la couche de graisse dans la partie supérieure de l’échantillon ou le talon résiduel au bas de l’échantillon et s’applique à une colonne de l’homogénéisateur.
    11. Colonnes de homogénisateur de centrifugeuse à vitesse maximale, 17 200 g, pendant 3 min à 25 ° C.
    12. Transfert 350 µL d’éluat à tube de microcentrifuge de 2 mL par le fabricant pour une utilisation avec l’instrument automatisé pour la purification d’ADN et d’ARN (ne pas utiliser n’importe quel autre tube). Veillez à ne pas transférer toute couche graisseuse résiduelle.
    13. Si le volume intermédiaire est inférieure à 350 µL, ajouter le tampon de lyse avec β-ME pour un volume final de 350 µL.
    14. Laisser les échantillons à ta jusqu'à 2 h avant de procéder à l’isolement des acides nucléiques à l’aide de l’instrument de purification ADN automatisé, ou congeler à-80 ° C.
  5. Nettoyage de la zone de travail
    1. Nettoyer toutes les surfaces en utilisent avec une solution de décontamination non enzymatique, laissent pendant 10 min, puis vaporiser avec l’éthanol à 70 % et essuient la surface.

2. isoler l’ADN/ARN

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Mettre en marche le bloc chauffant et régler la température à 70 ° C.
    2. Allumez le vortexer thermorégulées et régler la température à 37 ° C.
    3. Échauffement de la mémoire tampon d’élution (EB) contenant 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, dans un tube de 50 mL à 70 ° C.
    4. Chaude jusqu'à 350 µL de l’échantillon congelé lysats dans des tubes de 2 mL à 37 ° C jusqu'à ce que complètement décongelés sans n’importe quel précipité (environ 10 min).
  2. Purification d’ADN
    1. Vortex et centrifuger les tubes de 2 mL avec l’échantillon brièvement (3000 x g pendant 10 s).
    2. Insérer les tubes de 2 mL dans le shaker suite graphique de chargement de l’instrument automatisé de purification des ADN/ARN, par les instructions du fabricant.
    3. Obtenez les adaptateurs de rotor et mettre en place sur la barre d’État basé sur le nombre d’échantillons.
    4. Chaque adaptateur de rotor basé sur l’identification de l’échantillon (ID) de l’étiquette.
    5. Couper les couvercles et lisser les bords des colonnes à centrifuger individuels pour l’ADN et l’ARN.
    6. Insérer la colonne ADN sans le tube de prélèvement dans l’adaptateur de rotor. Jeter le tube de prélèvement.
    7. Étiqueter 1,5 mL tubes de prélèvement et insérez dans les adaptateurs de rotor.
    8. Définir les adaptateurs du rotor dans la centrifugeuse suite graphique de chargement de l’instrument automatisé de purification des ADN/ARN.
    9. Insérer 1 000 µL bouts du fabricant filtrants dans Astuce grilles.
    10. Ajouter l’eau exempte de RNase à tube de microcentrifuge de 2 mL du fabricant basé sur le nombre d’échantillons (selon les instructions de machine spécifique de protocole).
    11. Insérer le tube dans la fente de tube « A » d’emplacements de tubes de microcentrifuge.
    12. Jeter tout réactif restant dans les flacons de réactifs et de remplir avec un volume minimal de 10 mL.
    13. Insérer les flacons de réactifs dans le porte-bouteille réactif (sauf bouteille EB).
    14. Ajouter EB chaud d’un tube de 50 mL à la position de flacon de réactif 6.
    15. Vérifier les tubes de 1,5 mL sont placées étroitement dans les adaptateurs de rotor.
    16. Fermer le couvercle de l’appareil, puis sélectionnez : kit « ARN » → « extraction » → « Animal, tissus et cellules » → « du kit nom 350 µL partie un coutume ADN » → modifier Volume d’élution à 100 µL (par défaut) ou 50 µL de faible biomasse échantillons → « Start. »
    17. Lorsque vous avez terminé, enlever les adaptateurs du rotor de la centrifugeuse et placez-les sur le plateau.
    18. Jeter la colonne ADN de rotor adaptateur poste 3.
    19. Ne jetez pas les adaptateurs du rotor, l’ARN est en position 2.
    20. Retirer les tubes de prélèvement de 1,5 mL contenant de l’ADN éluée à la position 3 et stocker à −20 ° C.
    21. Recueillir des tubes contenant de l’échantillon du shaker et magasin à −20 ° C, si aucun échantillon n’est pas terminée, jeter autrement.
    22. Continuer avec le protocole « du kit nom 350 µL partie B ARN » pour davantage de purification de l’ARN.
    23. Purification de RNA se fera de l’environ 350 µL intermédiaires qui se trouve dans la position médiane de l’adaptateurs de rotor.
  3. Purification de RNA
    1. Insérer la colonne RNA sans son tube de prélèvement et le couvercle dans l’adaptateur de rotor.
    2. Label nouveau 1,5 mL tubes de prélèvement et introduisez-les dans adaptateur rotor comme il est indiqué dans le manuel.
    3. Définissez les adaptateurs du rotor dans la centrifugeuse suite graphique de chargement de l’instrument automatisé de purification des ADN/ARN.
    4. Fermer le couvercle de l’instrument et sélectionnez : « RNA » → « Du fabricant Kit » → « Animal, tissus et cellules » → « Standard partie B ARN » → « Start ».
    5. Une fois terminé, retirez les adaptateurs du rotor de la centrifugeuse et placez-les sur le plateau.
    6. Jeter la colonne RNA de la position 3.
    7. Retirer les tubes de prélèvement de 1,5 mL contenant 30 µL éluée ARN à la position 3 et stocker à −80 ° C.
    8. Retirer les flacons de réactifs.
    9. Disposer des matières adaptateur rotor par l’intermédiaire de canaux appropriés des déchets dangereux.
  4. Poste de travail propre
    1. Pulvérisation accessoires tous automatisés DNA/RNA purification de l’instrument, tels que grilles de réactif, plateau et toute autre surface en utilisent avec une solution de décontamination non enzymatique, laissent pendant 10 minutes et rincer avec désionisée (DI), puis laissez-les sécher.
    2. Vaporiser l’instrument automatisé avec seulement fabricant approuvé solution de décontamination non enzymatique, essuyez l’intérieur de la centrifugeuse ainsi que toutes les surfaces en cours d’utilisation, laisser pendant 10 min et puis essuyer avec l’éthanol à 70 %. Ne pas utiliser d’autres types de solutions de décontamination car ils peuvent endommager l’instrument.

3. ciblées 16 s PCR Set-up

NOTE : La mise en place pour l’ACP 16 s s’effectue dans un espace de travail de pré-amplification désigné situé à l’intérieur de la salle blanche. Les réactifs et les échantillons sont préparés et puis chargées sur un gestionnaire liquid pour effectuer le PCR pour chaque échantillon en triple exemplaire (30 échantillons, qui comprennent des échantillons véritables et contrôles positifs et négatifs d’extraction, ainsi que 2 contrôles PCR de l’eau en trois exemplaires, pour un total de 96 combinée des échantillons et des contrôles). Une fois que les réactions de PCR sont assemblées et scellées, la plaque d’échantillon est transférée à un thermocycleur, situé dans une zone après amplification pour le cyclisme.

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le poste de travail PCR. Spray que décontaminant toutes les surfaces en cours d’utilisation avec une RNase, DNase, ADN, suivie de l’eau distillée deux fois, et enfin l’éthanol à 70 %.
    2. Préparer la feuille de calcul 16 s PCR (voir la feuille de calcul cible 16 s PCR) avec une liste d’exemples précis et assign barcoded différentes amorces à chaque échantillon9. Imprimer la feuille de calcul ainsi que les cartes de la plaque (voir photo 1).
  2. Préparation du mélange maître PCR
    NOTE : 16 s amorce sélection est basée sur la région d’intérêt pour l’étude particulière et peut changer de type d’étude ou de l’échantillon. Par conséquent, avant de commander des amorces, il est important de confirmer quelle zone de l’ARNr 16 s meilleurs amplifie les microbes d’intérêt pour l’étude particulière. Ce protocole comme écrit est pour l’amplification de la région de V4 16 s. Si les différente amorces/région sont sélectionnée, puis la température de recuit dans le cyclage thermique peut exiger un ajustement.
    1. Travailler dans la station de travail PCR tout préparer.
    2. Sors de 50-100 µL d’échantillons d’ADN de-20 ° C et tous les réactifs nécessaires et les décongeler sur la glace. Vortex et essorer brièvement vers le bas.
    3. Les amorces sont préalablement dilués à la concentration de travail de 5 µM dans un volume minimal de 20 µL.
    4. Préparer le mélange maître PCR dans le tube spécifique 5 mL avec seulement l’amorce vers l’avant selon le calcul sur la feuille de calcul.
  3. Préparer le robot gestionnaire liquide d’installation automatisée de PCR
    1. Pour les échantillons, retirez adaptateur d’échantillon de l’instrument d’un 32-puits et charger 50-100 µL d’échantillons d’ADN selon le plan de la plaque à 96 puits selon les instructions du fabricant.
      1. Pour chaque plaque PCR, mis en place 2 témoins négatifs en plaçant 30 µL d’eau PCR dans un tube à essais propre.
      2. Placez tous les échantillons sur échantillon adaptateur de l’instrument 32 puits avec bouchons verrouillés en position ouverte.
    2. Pour les amorces inverse9
      1. Enlever le bouchon de chaque amorce inverse avec code à barres spécifique # s un à la fois (changer de gants dans l’intervalle pour éviter la contamination croisée).
      2. Placez un maximum de 32 amorces sur adaptateur réactif de l’instrument.
    3. Prendre une plaque à 96 puits PCR et l’étiquette avec le nom de l’étude, numéro d’échantillon, date et initiales du technicien.
    4. Charger le gestionnaire liquid robotique
      1. Placez l’adaptateur réactif B1. Afin d’éviter un effet de bord, placez-la sur une extrémité de l’adaptateur contre le côté de la poignée et abaisser lentement l’autre bord. Veillez à pousser sur tous les coins de l’adaptateur.
      2. Placez l’adaptateur de l’échantillon en Position C1. Veillez à pousser sur tous les coins de l’adaptateur.
      3. Vortex 5 mL master mix, ouvrez le bouchon et placez-le en position A sur bloc maître de mix et réactif de l’instrument.
      4. Placer la plaque PCR sur l’adaptateur de l’instrument de 96 puits qui est destiné à contenir la moitié jupette plaques PCR.
      5. Lancer l’exécution et l’enregistrer dans un nouveau fichier.
      6. Suivez les invites et case à cocher chaque invite : one, conseils sont disponibles, deux, boîte à déchets est disponible, et trois, commencer.
    5. Une fois que la série est terminée, vérifier il n’y a aucune erreur en vérifiant la machine pour les messages d’erreur.
    6. Sceller la plaque avec le 12 ou les couvercles de barrette 8, vortex vigoureusement et tournez vers le bas pendant 1 min à l’aide d’une toupie en plaque 96 puits et placez-le sur la glace ou au réfrigérateur.
    7. Retirer les tubes contenant les inverses des amorces et des échantillons.
    8. Prendre la plaque à 96 puits à la salle après amplification et charger la plaque sur le thermocycleur et cycle selon le tableau des conditions thermiques-cyclisme (voir tableau 1).

4. 16 s ciblée Post-PCR contrôle de la qualité à l’aide de plate-forme sur bande pour électrophorèse

Remarque : Contrôle de la qualité Post-PCR (QC) et toutes les étapes subséquentes sont effectuées dans une zone délimitée d’après amplification du laboratoire. L’ADN est analysé dans un analyseur automatique de fragments ADN/ARN.

  1. Préparation de la zone de travail
    1. Nettoyer le poste de travail par pulvérisation de toutes les surfaces en utilisation DNase, RNase, ADN décontaminant, suivie de l’eau distillée deux fois, et, enfin, éthanol à 70 %.
    2. Rassembler toutes les fournitures et le matériel nécessaires.
  2. Préparer des réactifs
    1. Tampon d’échantillon place et échelle dans le vortexer thermorégulées à 25 ° C pendant au moins 30 min.
  3. Alors que les réactifs sont réchauffent, préparer les échantillons de la PCR en mettant en commun les 3 répétitions PCR pour chaque échantillon dans un tube unique
  4. Charger des échantillons sur l’instrument.
  5. Brièvement de vortex et la centrifuger tubes avec mise en commun produit PCR.
  6. Placer la plaque à 96 puits de l’instrument sur une grille à la droite et l’étiquette.
  7. Brièvement vortex et spin down la solution tampon et l’échelle.
  8. Ajouter 3 µL de tampon échantillon dans chaque puits de la plaque 96 puits (nécessité au moins 53 µL/écran bande).
  9. Exécuter un nombre pair d’échantillons ; s’il y a un nombre impair d’échantillons, ajouter 4 µL de tampon de dans un puits vide.
  10. Ajouter 1 µL d’échelle à une échelle bien.
  11. Suite à la carte, ajouter 1 µL du produit PCR regroupée à son désigné bien.
  12. Plaque de recouvrement avec opercule
  13. Vortex la plaque à l’aide de l’instrument vortexer et adaptateur à 2 000 tr/min pendant 1 min.
  14. Tourner de nouveau vers la position de l’échantillon au fond du tube, s’il y a des bulles spin down.
  15. Lancez le logiciel.
  16. Charger les conseils de bande et le chargement d’écran dans l’instrument.
  17. Charger des échantillons dans l’analyseur de fragment avec un adaptateur de 96 puits.
  18. Mettre en place une course avec le logiciel de contrôleur.
  19. Prenez soin de sélectionner les paires de puits.
  20. Écrire l’ID d’échantillon.
  21. Vérifiez que tous les puits de la cassette de l’écran sont surlignés en gris.
  22. Assurez-vous que l’analyseur reconnaît toutes les pointes de pipette.
  23. Sélectionnez Démarrer et spécifiez un nom de fichier pour enregistrer les résultats (nom, numéros de l’échantillon et la date à l’étude).
  24. Consulter les instructions du fabricant pour plus de détails.
  25. Une fois la course terminée, jeter pointe, écran bande et tubes.
  26. Analyser les données pour 16 s pic nM (entre bp 315-450 pour V4). Ce pic peut varier selon les amorces sélectionnées.

5. Bibliothèque calcul, mise en commun, Clean-up et QC

  1. Après avoir déterminé la taille de l’amplicon et molarité de tous les échantillons, mettre en commun les bibliothèques pour atteindre le volume souhaité final et nM pour la bibliothèque de mise en commun (voir exemple de calcul).
  2. Nettoyage et concentré la bibliothèque regroupée à l’aide d’une purification de silice à base de membranes kit pour les produits PCR, selon les directives du fabricant du protocole (voir Table des matières).
    1. Éluer l’ADN avec un volume final de 50 µL.
  3. Mesurer la concentration de la bibliothèque nettoyée immédiatement en utilisant un kit de haute sensibilité ADN brin double pour un fluorimètre, selon le protocole du fabricant.
    1. Diluer 2 µL de la bibliothèque de mise en commun et nettoyée avec 198 µL de tampon de dilution plus colorant (dilution 1 : 100).
    2. Enregistrer la valeur mesurée de l’appareil fluorimétrique et convertissez-le en fonction du facteur de dilution.
  4. À l’aide de la concentration (ng/µL) de lecture de la bibliothèque de mise en commun, calculer la molarité de la bibliothèque en nM. Utiliser 1 µL de bibliothèque non dilué pour mesurer la OD260/280 sur un spectrophotomètre microvolume.
    NOTE : Une valeur de 1,8 à 2,0 indique pureté adéquate de la bibliothèque.
  5. Stocker la finale à-20 ° C jusqu’au moment de séquençage de la génération suivant.

Résultats

Le protocole présenté ici comprend important contrôle qualité (CQ) des mesures pour s’assurer que la rencontre de données générées de repères pour le contrôle de sensibilité, spécificité et contamination protocole. Première étape QC du protocole suit amplification par PCR de la région de V4 16 s (Figure 2). 1 µL du produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il était dans la plage de la tail...

Discussion

Ciblée génération séquençage des ARNr 16 s est une technique largement utilisée, rapide pour microbiome caractérisation18. Cependant, de nombreux facteurs, y compris les effets du traitement par lots, contamination de l’environnement, cross-contamination des échantillons, sensibilité et reproductibilité peuvent nuire résultats expérimentaux et confondre leur interprétation7,19 , 20. pour mi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Helty Adisetiyo, Ph.d et Shangxin Yang, Ph.d pour l’élaboration du protocole. Soutien global pour l’International maternelle pédiatrique Adolescent sida clinique essais Group (IMPAACT) a été fourni par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) sous les numéros de prix UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) et UM1AI106716 (IMPAACT LC), avec un cofinancement de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) et le National Institute of Mental Health (NIMH). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extraction kit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo MixerFisher Scientifictemperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME BeadsMP Biomedicals116914050bead tube
QIAgen TissueLyzerQiagen85300automated sample disruptor adapter set
QIAshredder columnQiagen 79654
QIAgen RB tubemanufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticwareQiagen9001292automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plusApplichemA7089non-enzymatic decontamination solution
EB BufferQiagen19086elution buffer
QIAgility and related plasticwareQiagen9001532robotic liquid handler
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinNo Catalog #'sdesigned and ordered
 96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticwareAgilentG2964AAautomated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent5067-5585Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research50444470PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeq   IlluminaNo Catalog #'snext generation sequencer

Références

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Immunologie et Infectionnum ro 13316 s ARNrMicrobiomes quen age de nouvelle g n rationle lait maternellait maternelfaible biomasse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.