Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.

Abstract

מחקרים של קהילות מיקרוביאלי הפכו נרחבת עם הפיתוח של רצפי התפוקה יחסית זול, מהיר וגבוה. עם זאת, כמו עם כל הטכנולוגיות הללו, תוצאות לשחזור תלויות שזרימת עבודה במעבדה משלבת אמצעי הזהירות המתאימים ופקדים. דבר זה חשוב במיוחד עם דגימות נמוך-ביומסה איפה לזיהום חיידקי ה-DNA ניתן להפיק תוצאות מטעות. מאמר זה מפרט זרימת עבודה אוטומטית למחצה כדי לזהות חיידקים מדגימות חלב בשד האנושי באמצעות רצף יישוב של אזור V4 ribosomal RNA (rRNA) 16 בסולם נמוך - עד אמצע - throughput. הפרוטוקול מתאר הכנת הדוגמא של חלב מלא כולל: לטעום פירוק, חילוץ חומצת גרעין, הגברה של אזור V4 של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין, וכן ספריית הכנה עם אמצעי בקרה. חשוב, הפרוטוקול ואת הדיון לשקול סוגיות שאינן בולטות הכנה, ניתוח דוגמאות נמוך-ביומסה לרבות הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים, הסרת המעכב PCR, דוגמת זיהום על ידי הסביבה, מגיב, או מקורות ניסיוני, ושיטות עבודה מומלצות ניסיוני, שנועדו להבטיח הפארמצבטית. בעוד הפרוטוקול כפי שמתואר ספיציפית דגימות חלב, זה יכולת הסתגלות רבים סוגי דגימה ביומסה נמוכה ולא גבוהה, כולל דוגמאות שנאספו על דגימות, קפוא מסודר, או התייצב במאגר שימור.

Introduction

הקהילות אותן מיקרוביאלי לישוב בני האדם מאמינים כי חשובה ביותר לבריאות האדם ומחלות המשפיעים על חילוף החומרים, פיתוח המערכת החיסונית, נטייה למחלות, תגובות חיסון התרופות, טיפול1, 2. מאמצים כדי להבין את השפעת microbiota על בריאות האדם כיום מדגישים את הזיהוי של מיקרובים המשויכות מוגדרים תאים אנטומיים (כלומר, עור, בטן, אוראלי, וכו '), כמו גם אתרי מקומי בתוך אלה3,תאים4. המאמצים האלה החקירות לגורם המרכזי עליו מושתתת היא התפתחותה המהירה של נגישות מוגברת של טכנולוגיות הדור הבא רצפי (הגדרות) המספקים פלטפורמה בנפט במקביל לניתוח של התוכן הגנטי מיקרוביאלית (microbiome) של מדגם. לדוגמאות פיזיולוגיים רבים, microbiome המשויך הוא מורכב וגם בשפע (קרי, צואה), אבל עבור כמה דוגמאות, microbiome מיוצג על-ידי ביומסה מיקרוביאלית נמוך (כלומר, חלב, מערכת הנשימה התחתונה) שבו רגישות, חפצי אמנות ניסויית, זיהום אפשרי להפוך את הנושאים העיקריים. האתגרים המשותפים של microbiome לימודי עיצוב ניסיוני המתאים כבר הנושא של מספר סקירת מאמרים5,6,7,8.

שהוצגו במסמך זה צינור ניסיוני חזק המיתרים מבוסס על רצף יישוב של rRNA 16 שכבת ביטול v4 של אזור9 כדי לאפיין את microbiome של חלב. ניתוח Microbiome של חלב אינו מורכב רק על ידי נמוך מטבעו ביומסה מיקרוביאלית של10, אך בנוסף על ידי גבוהה רמות של דנ א אנושי רקע11,12,13,14 ו דחויים פוטנציאלי של PCR מעכבי15,16 בחומצות שחולצו. פרוטוקול זה מסתמך על ערכות חילוץ זמינים מסחרית, פלטפורמות חצי אוטומטיים כדי לסייע במזעור השתנות לאורך אצוות הכנת המדגם. הוא כולל קהילה מדומה חיידקי מוגדרים היטב, שמעובד לצד דוגמאות כמו בקרת איכות כדי לאמת כל שלב בפרוטוקול ולספק מדד עצמאית של צינור חוסן. אמנם הפרוטוקול כפי שתואר ספיציפית דגימות חלב, ניתנת להתאמה בקלות סוגים אחרים דוגמת כולל צואה, בפי הטבעת, בנרתיק, עור, מטליות מונטגומרי, אוראלי10,17, והוא יכול לשמש נקודת מוצא חוקרים המעוניינים לבצע ניתוח microbiome.

Protocol

עבור כל פרוטוקול השלבים, חובה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי), גישות למניעת זיהום מחמירים צריכים להילקח. לבחון את זרימת העבודה מן קדם הגברה לעבוד אזורים לאזורים הגברה שלאחר עבודה כדי למזער את הזיהום של דגימות. כל ציוד המשמש הן סטרילי, ללא RNase, DNase, ה-DNA ו- pyrogen. כל הטיפים פיפטה מסוננים. תרשים זרימה של המדרגות פרוטוקול מסופק (איור 1).

1. מדגם פירוק

הערה: פירוק מדגם והפקת חומצת גרעין מבוצעות באמצעות ערכת חילוץ DNA/RNA בסביבת חדר נקי איפה פקדים הנדסה והן פרוצדורלי במקום כדי למזער את ההקדמה של חיידקים סביבתיים הדגימות.

  1. הכנת שטח עבודה
    1. נקי הקבינט אבטחה (BSC) פועלים באזור עם שואב האבק השטח המתאים כדי למנוע כל זיהום חומצת גרעין.
    2. להפעיל את vortexer טמפרטורה מבוקרת, ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מאגר פירוק thiocyanate guanidinium (ראה טבלה של חומרים)
    1. בדוק את המאגר פירוק עבור פוחת משקעים. מחדש להמיס פוחת משקעים על ידי ההתחממות ב 37 º C.
    2. להכין µL 600 פירוק מאגר עם µL 6 β-mercaptoethanol (β-ME) עבור כל דגימה. לשקול אמצעי 20% תוספת עבור דגימה.
  3. הכנת הדוגמא
    1. אם חלב קפוא, להפשיר זה על קרח. Aliquot מ ל כל חלב של 15-mL או צינור סטרילי 5-mL BSC ולשמור אותו בקרח.
    2. לסובב את החלב 5-mL aliquot 10 דקות ב g x 5,000-4 ° C עד הצניפה תאים.
    3. להסיר את שכבת השומן, עכשיו השכבה העליונה בצינור, עם מרית פלסטיק או גדול נשא פיפטה עצה.
    4. מבלי להפריע בגדר, להסיר כל תגובת שיקוע חוץ 100 µL.
    5. לשטוף את צניפה מאת resuspending ב- 1 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS).
    6. להכין 1 בקרה שלילית על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS סטרילי צינור 5-mL.
    7. להעביר את המתלים שפופרת צנטרפוגה נקי 1.5-mL ויסתובב ב microcentrifuge עבור 1 דקות (5000 g x בטמפרטורת החדר (RT)).
    8. השתמש טיפ פיפטה מסוננים סטרילי 1,000 µL כדי למחוק את כל השכבה תגובת שיקוע/שומן.
    9. אם לא חילוץ באותו היום, וכהרף עין להקפיא התא הצניפה על ידי הכנסתו של slurry קרח אתנול/יבש ולא מיד להעביר אותו למקפיא-80 ° C.
  4. דוגמה הפרעות וחוסר המגון (חרוז-מכות)
    1. הוסף µL 600 פירוק מאגר המכיל β-ME כדי בגדר, להעביר את המתלים צינור חרוז.
    2. כל אצווה החילוץ של 12 מכיל דגימות 10, 1 בקרה שלילית (להכין בשלב 3.7 לעיל) ושליטה 1 חיובית (להכין בשלב הבא).
      1. להכין 1 בקרה חיובית עם פירוק מאגר, µL 20 המדגם מעושה חיידקי (הקהילה המדומה בשימוש יש ריכוז, פעם חילוץ הקבצים, כ 0.2 ng/µL של ה-DNA).
    3. מערבולת כל חרוז צינורות נמרצות עבור 15 s.
    4. מחממים את דגימות על vortexer טמפרטורה מבוקרת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ברעידות-700-800 סל ד.
    5. לטעון צינורות לתוך ערכת מתאם מפצל דגימה אוטומטית.
    6. חרוז לנצח עבור 1 דקות ב- 30 הרץ.
    7. לפרק את ערכת מתאם והחלף ידנית את מתאם להגדיר עם הצלחות מדגם מ בזרוע רובוטית השמאלי בזרוע רובוטית נכון של המכשיר.
    8. חרוז לנצח בשביל עוד 1 דקות ב- 30 הרץ.
    9. צנטריפוגה צינורות ב g x 17,200, למשך 3 דקות ב 25 º C.
    10. הסר את כל תגובת שיקוע עם פיפטה 200 µL, נזהר שלא לקבל כל אחד שכבת השומן בראש המדגם או החרוז שיורית בחלק התחתון של המדגם, להחיל על עמודה מהמגן.
    11. צנטריפוגה מהמגן עמודות במהירות המרבית, g x 17,200, למשך 3 דקות ב 25 º C.
    12. העברה 350 µL של eluate של יצרן 2-mL צינור microcentrifuge לשימוש עם המכשיר האוטומטי עבור טיהור של DNA ו- RNA (אל תשתמש כל שפופרת אחרים). יש להיזהר לא להעביר כל שכבת השומן שיורית.
    13. אם אמצעי האחסון זרימה דרך µL פחות מ- 350, להוסיף נפח סופי של 350 µL פירוק מאגר עם β-ME.
    14. יוצאים הדגימות RT עד 2 שעות לפני שתמשיך לבידוד חומצת גרעין באמצעות מכשיר טיהור DNA אוטומטית, או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. ניקוי משטח עבודה
    1. נקי כל המשטחים ב השתמש עם פתרון טיהור אנזימטי, להשאיר 10 דקות, ואז לרסס עם 70% אתנול, לנקות את פני השטח.

2. לבודד את ה-DNA/RNA

  1. הכנת שטח עבודה
    1. תפעיל את גוש חום ולא מוגדר בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס.
    2. תפעיל את vortexer טמפרטורה מבוקרת ולא מוגדר בטמפרטורה של 37 ° C.
    3. חממו המאגר • תנאי (EB) המכיל 10 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.5, שפופרת 50-mL ל 70 מעלות צלזיוס.
    4. לחמם 350 µL של lysates הקפואה לדוגמה צינורות 2 מ"ל ב 37 ° C עד לחלוטין הקרת ללא כל המשקע (כ- 10 דקות).
  2. טיהור DNA
    1. מערבולת, צנטריפוגה צינורות 2-mL עם לטעום בקצרה (3000 x g עבור 10 s).
    2. הכנס 2 מ ל צינורות ניעור בעקבות תרשים טעינה אוטומטית DNA/RNA טיהור הכלי, לפי הוראות היצרן.
    3. לקבל את מתאמי הרוטור ולהגדיר אותם על מגש מבוסס על מספר דוגמאות.
    4. תווית לכל מתאם הרוטור בהתבסס על (זיהוי המדגם).
    5. לחתוך את עפעפיו, להחלקת קצות ספין בודדים עמודות עבור DNA ו- RNA.
    6. הכנס את העמודה ספין DNA ללא הצינור אוסף מתאם הרוטור. למחוק את הצינור אוסף.
    7. תווית 1.5 mL אוסף צינורות, והכנס לתוך הרוטור מתאמים.
    8. הגדר הרוטור מתאמים לתוך לצנטריפוגה בעקבות תרשים טעינה אוטומטית DNA/RNA טיהור הכלי.
    9. הכנס 1,000 µL המסנן-טיפים של היצרן עצה ארונות תקשורת.
    10. להוסיף מים נטולי RNase microcentrifuge צינור של יצרן 2-mL מבוסס על מספר דוגמאות (לפי הוראות פרוטוקול מסוים המכונה).
    11. הכנס את הצינור לחריץ צינור "A" החריצים שפופרת של microcentrifuge.
    12. להתעלם כל ריאגנט שנותר על ריאגנט בקבוקים, מילוי עם נפח מינימלי של 10 מ"ל.
    13. הכנס ריאגנט בקבוקים המדף בקבוק ריאגנט (למעט הבקבוק EB).
    14. הוסף EB חמים שפופרת 50-mL למיקום בקבוק ריאגנט 6.
    15. הסימון 1.5 mL הצינורות מוכנסים בחוזקה מתאמים הרוטור.
    16. סגור את המכסה של הכלי ובחר: "RNA" ← "ערכת חילוץ" ← "חיה, רקמות ותאים" ← "שם 350 µL חלק א מותאם אישית DNA, ערכת" ← לערוך • תנאי האחסון µL 100 (ברירת המחדל) או µL 50 עבור ביומסה נמוך דגימות ← "התחל".
    17. כשהפעולה תסתיים, להסיר מתאמים הרוטור מחוץ לצנטריפוגה ומניחים על המגש.
    18. למחוק את העמודה ספין DNA מהמיקום מתאם 3 של הרוטור.
    19. אל תמחק הרוטור מתאמים, RNA בעמדה 2.
    20. להסיר את צינורות איסוף 1.5 mL המכילה DNA eluted בעמדה 3, ואחסן −20 מעלות צלזיוס.
    21. לאסוף את צינורות לדוגמה, המכיל בשייקר, בחנות −20 ° C, אם דוגמה שאריות, להשליך אחרת.
    22. ממשיכים עם פרוטוקול "שם 350 µL חלק ב' RNA, ערכת" לטיהור נוספת של RNA.
    23. טיהור RNA ייעשה מ כ 350 µL הזרימה דרך זה במצב האמצעי של מתאמים הרוטור.
  3. RNA טיהור
    1. הכנס את העמודה ספין RNA ללא שלו אוסף שפופרת, המכסה מתאם הרוטור.
    2. תווית חדשה mL 1.5 אוסף צינורות ולהוסיפם הרוטור מתאם כפי שמצוין במדריך.
    3. הגדר את מתאמי הרוטור לתוך לצנטריפוגה בעקבות תרשים טעינה אוטומטית DNA/RNA טיהור הכלי.
    4. סגור את המכסה של הכלי ובחר: "RNA" ← "של היצרן ערכת" ← "חיה, רקמות ותאים" ← "RNA B חלק סטנדרטי" ← "התחל".
    5. לאחר השלמת, להסיר מתאמים הרוטור מחוץ לצנטריפוגה ומניחים על המגש.
    6. מחק עמודה ספין RNA מעמדת 3.
    7. הסר 1.5 mL צינורות אוסף המכיל 30 RNA µL eluted בעמדה 3, ולאחסן ב −80 מעלות צלזיוס.
    8. הסר ריאגנט בקבוקים.
    9. תשליך הרוטור תוכן מתאם בערוצים המתאימים פסולת מסוכנת.
  4. תחנת עבודה נקייה
    1. ריסוס כל אוטומטיות DNA/RNA טיהור הכלי עזרים, כגון ארונות תקשורת ריאגנט, מגש על כל משטח אחר ב השתמש עם פתרון טיהור אנזימטי, להשאיר 10 דקות ולשטוף עם יונים מים (DI), אז תנו להן להתייבש.
    2. תרסיס המכשיר אוטומטית עם רק יצרן מאושר פתרון טיהור אנזימטי, לנגב את החלק הפנימי של צנטריפוגה יחד עם כל המשטחים בשימוש, להשאיר למשך 10 דקות ולאחר מכן נגב עם 70% אתנול. אל תשתמש/י סוגים אחרים של פתרונות טיהור כפי שהם יכולים לגרום נזק לכלי.

3. הגדרת ה-PCR 16 יישוב

הערה: השטויות PCR מטוסי אף-16 מתבצע בסביבת עבודה קדם הגברה המיועד ממוקם בתוך חדר נקי. ריאגנטים ודוגמאות מוכן, אז טענת עוזר נוזלי כדי לבצע את ה-PCR עבור כל דגימה שהפקידים (דגימות 30, הכוללים דוגמאות נכון, פקדים חיוביים ושליליים החילוץ, וכן פקדי מים PCR 2 דולר, עבור סכום כולל של 96 דוגמאות משולב ופקדים). לאחר תגובות PCR הם מורכבים, אטום, הצלחת מדגם מועבר הצנטרפוגה תרמי הממוקם באזור שלאחר הגברה עבור רכיבה על אופניים.

  1. הכנת שטח עבודה
    1. ניקוי תחנת ה-PCR. ריסוס שכל המשטחים בשימוש עם ה-DNA RNase, DNase, decontaminant, ואחריו DI מים שתי פעמים, ולבסוף 70% אתנול.
    2. הכינו גליון ה-PCR 16 (ראה ממוקד מטוסי אף-16 PCR גליון) עם רשימת הדגימה מדויק, הקצאת תחל לבר-קוד שונה בכל מדגם9. הדפס את גליון העבודה ואת המפות צלחת (ראה לוח 1).
  2. PCR מיקס מאסטר הכנה
    הערה: מטוסי אף-16 פריימר ובחירת מבוסס על האזור של ריבית לצורך המחקר מסוים, עשוי להשתנות לפי סוג המחקר או לטעום. לפני שמזמינים תחל, לכן חשוב לוודא מהו האזור הטוב ביותר מטוסי אף-16 rRNA מגביר את החיידקים עניין למחקר מסוים. פרוטוקול זה כפי שכתוב היא הגברה של אזור V4 מטוסי אף-16. אם נבחרו צבעי יסוד/אזור אחרים, אז הטמפרטורה מחזק של תרמית רכיבה על אופניים עשויים לדרוש התאמה.
    1. עובד תחנת ה-PCR כדי להכין הכל.
    2. תוציא 50-100 µL של דגימות דנ א-20 ° C, ואת כל ריאגנטים הדרושים, להפשיר אותם על קרח. מערבולת בקצרה ספין מטה.
    3. צבעי יסוד הם מראש מדולל לריכוז עבודה 5 מיקרומטר באמצעי אחסון מינימלי של 20 µL.
    4. הכנת המיקס מאסטר PCR בצינור הספציפי מ עם רק פריימר לפנים על פי החישוב בגליון העבודה.
  3. הכנת המטפל נוזלי רובוטית להתקנה אוטומטית של ה-PCR
    1. לקבלת דוגמאות, להוציא מתאם מדגם של מכשיר 32-ובכן, וטען µL 50-100 דגימות דנ א לפי המפה 96-ובכן צלחת לפי הוראות היצרן.
      1. על כל צלחת PCR, להגדיר 2 פקדים שליליים על ידי הצבת µL 30 PCR מים בצינור מדגם נקי.
      2. במקום כל הדגימות על לדוגמה המתאם הכלי 32-ובכן עם כמוסות נעול במצב פתוח.
    2. תחל הפוכה9
      1. הסירי את הפקק של כל פריימר הפוכה עם ברקוד ספציפי # של אחד בכל פעם (שינוי כפפות בין כדי למנוע זיהום צולב).
      2. במקום מספר מרבי של 32 תחל על מתאם ריאגנט של המכשיר.
    3. תוציא צלחת PCR 96-ובכן עם מדבקה עם השם המחקר, דוגמית מספר, תאריך ואת ראשי התיבות של הטכנאי.
    4. טעינת המטפל נוזלי רובוטית
      1. למקם את מתאם ריאגנט במיקום B1. כדי למנוע אפקט קצה, בזהירות המקום לאחד מקצוות המתאם כנגד הצד אחיזה, לאט להפיל את הקצה השני. הקפד ללחוץ על כל הפינות של מתאמים.
      2. מקם את מתאם מדגם C1 עמדה. הקפד ללחוץ על כל הפינות של מתאמים.
      3. מערבולת מיקס מאסטר של 5-mL, פתח את הפקק, ולמקם אותו עמדה A בבלוק מיקס, ריאגנט הראשי של המכשיר.
      4. מניחים את הצלחת ה-PCR על המתאם של המכשיר 96-ובכן זה נועד להחזיק צלחות PCR חצי skirted.
      5. להתחיל לברוח ולשמור בתור קובץ חדש.
      6. בצע את ההוראות ולסמן הסימון בכל הודעה כזו: אחד, טיפים זמינים, שתיים, תיבת פסולת זו זמינה ולאחר שלוש, התחל.
    5. בתום ההפעלה, ודא היו שגיאות על-ידי בדיקה של המחשב עבור הודעות שגיאה.
    6. לאטום את הצלחת עם ה-12 או רצועה 8 כמוסות, מערבולת, נמרצות, ספין למטה עבור 1 דקות באמצעות ספינר 96-ובכן צלחת ו למקם אותו על קרח או במקרר.
    7. הסר את הצינורות המכילים צבעי יסוד הפוך ודוגמאות.
    8. קח את הצלחת 96-ובכן לחדר הגברה שלאחר וטען את הצלחת הצנטרפוגה תרמי ועל מחזור על פי הטבלה של תנאי רכיבה-תרמי (ראה טבלה 1).

4. יישוב מטוסי אף-16 פוסט-PCR בקרת איכות באמצעות סרט המבוסס על פלטפורמה עבור אלקטרופורזה בג'ל

הערה: פוסט-PCR בקרת איכות (QC) ואת כל והשלבים מבוצעים באזור שלאחר הגברה המיועדת של המעבדה. ה-DNA הוא ניתח במנתח פרגמנט האוטומטי ה-DNA/RNA.

  1. הכנת שטח עבודה
    1. לנקות את תחנת העבודה על ידי ריסוס שכל המשטחים בשימוש עם RNase, DNase, DNA decontaminant, ואחריו DI מים שתי פעמים, ולבסוף 70% אתנול.
    2. לאסוף אספקה וכל הציוד הדרוש.
  2. להכין ריאגנטים
    1. מקום דוגמת המאגר ואת הסולם vortexer מבוקרי טמפרטורה 25 ° c למשך תקופה מינימלית של 30 דקות.
  3. בזמן ריאגנטים הם מתחמם, להכין דגימות ה-PCR על ידי איגוד משכפל PCR 3 עבור כל דגימה לתוך צינור יחיד
  4. לטעון דוגמאות על כלי נגינה.
  5. בקצרה מערבולת, ספין למטה צינורות עם מוצר ה-PCR במאגר.
  6. מניחים צלחת 96-ובכן הכלי על מתלה-RT עם מדבקה.
  7. בקצרה המערבולת ו ספין למטה את דוגמת המאגר ואת הסולם.
  8. להוסיף 3 מאגר מדגם µL כל טוב של הצלחת היטב 96 (הקלטת µL/מסך צריך לפחות 53).
  9. הפעלת מספר זוגי של דגימות; אם יש מספר אי-זוגי של דגימות, להוסיף µL 4 מדגם מאגר באר ריקה.
  10. להוסיף 1 µL של סולם סולם טוב.
  11. בעקבות המפה, להוסיף 1 µL של מוצר ה-PCR במאגר ייעודי שלו טוב.
  12. לוחית כיסוי עם כשסרט האטימה
  13. מערבולת הצלחת באמצעות הכלי vortexer, מתאם ב-2000 סל ד 1 דקות.
  14. ספין אל מיקום הדגימה בחלק התחתון של הרכבת התחתית, אם יש בועות ספין למטה שוב.
  15. הפעל את התוכנה.
  16. לטעון את הטיפים הקלטת וטעינה של המסך לתוך הכלי.
  17. לטעון דגימות לתוך במנתח שבר עם מתאם 96-ובכן.
  18. בצע כיוונון ריצה עם התוכנה בקר.
  19. הקפד לבחור בארות אפילו ממוספרות.
  20. לכתוב מדגם חתימות.
  21. בדוק כי כל הבארות של הקלטת מסך מודגשים באפור.
  22. ודא שבמנתח מזהה כל הטיפים פיפטה.
  23. בחר התחל ' וציין שם קובץ לשמירת התוצאות (ללמוד שם, לדוגמה מספרים ותאריך).
  24. עיין הוראות היצרן לקבלת פרטים נוספים.
  25. בתום המרוץ, להתעלם עצה, הקלטת המסך ואת צינורות.
  26. ניתוח נתונים עבור מטוסי אף-16 שיא nM (בין 315-450 bp V4). שיא זה ישתנה בהתאם תחל שנבחרו.

5. ספריית חישוב, שינוים, לנקות, ו- QC

  1. לאחר קביעת molarity של כל הדגימות בגודלם אמפליקון, מאגר של ספריות כדי להשיג את האחסון הרצוי הסופי ואת nM עבור הספריה במאגר (ראה לדוגמה חישוב).
  2. ניקיון ולהתרכז הספרייה במאגר באמצעות הוא לטיהור סיליקה-המבוסס על רפידה קיט למוצרי ה-PCR, על פי היצרן פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
    1. Elute ה-DNA עם נפח סופי של 50 µL.
  3. למדוד את הריכוז של הספרייה נקי באופן מיידי באמצעות ערכת רגישות גבוהה DNA כפול נטושים fluorometer, על פי הפרוטוקול של היצרן.
    1. למהול 2 µL של הספרייה במאגר וניקו עם 198 µL של דילול מאגר בתוספת צבע (דילול מטריים).
    2. להקליט את הערך שנמדד מהמכשיר fluorometric ולהמיר אותו לפי הגורם דילול.
  4. באמצעות ריכוז קריאה (ng/µL) עבור הספריה במאגר, לחשב את molarity הספרייה ב- nM. השתמש בספריית מדולל µL 1 כדי למדוד את OD260/280 על ספקטרופוטומטרים microvolume.
    הערה: ערך של 1.8-2.0 מציין טוהר נאותה של הספרייה.
  5. לאחסן בספריה הסופי ב-20 ° C עד מוכן עבור רצף הדור הבא.

תוצאות

פרוטוקול המוצג כאן כולל שלבים חשובים בקרת איכות (QC) כדי להבטיח כי הפגישה נתונים שנוצרו ובחינות עבור פרוטוקול בקרת רגישות, ירידה לפרטים, זיהום. הצעד הראשון של הפרוטוקול QC בעקבות PCR הגברה של אזור V4 16 (איור 2). µL אחד של מוצר ה-PCR של כל מדגם נותחה על ידי אלקטרופורז...

Discussion

רצף יישוב הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA היא טכניקה בשימוש נרחב, מהיר microbiome אפיון18. עם זאת, גורמים רבים, כולל אפקטים אצווה, זיהום סביבתי, זיהום, לדוגמה, רגישות הפארמצבטית יכול להשפיע לרעה להשפיע על תוצאות הניסוי, וחיסול7,שלהם פרשנות19 , 20<...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות Helty Adisetiyo, PhD, Shangxin יאנג, PhD לפיתוח של הפרוטוקול. הכוללת תמיכה עבור הבינלאומי אימהי בילדים מתבגרים איידס קליניים ניסויים קבוצה (IMPAACT) סופק על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של במכון הלאומי של בריאות (NIH) תחת מספרי פרס UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC), UM1AI106716 (IMPAACT LC), עם השתתפות במימון המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר של ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD), את נבחרת המכון לבריאות הנפש (NIMH). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extraction kit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo MixerFisher Scientifictemperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME BeadsMP Biomedicals116914050bead tube
QIAgen TissueLyzerQiagen85300automated sample disruptor adapter set
QIAshredder columnQiagen 79654
QIAgen RB tubemanufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticwareQiagen9001292automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plusApplichemA7089non-enzymatic decontamination solution
EB BufferQiagen19086elution buffer
QIAgility and related plasticwareQiagen9001532robotic liquid handler
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinNo Catalog #'sdesigned and ordered
 96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticwareAgilentG2964AAautomated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent5067-5585Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research50444470PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeq   IlluminaNo Catalog #'snext generation sequencer

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 16 Ribosomal RNAMicrobiome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved