Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Riepilogo

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Abstract

Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso - medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D'importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l'analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.

Introduzione

Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia^{1, 2}. gli sforzi per comprendere l'influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l'identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all'interno questi scomparti^3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l'analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli^5,6,7,8.

Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione⁹ per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa¹⁰, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base^11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori^15,16 in estratti dell'acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale^10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.

Protocollo

Per tutti i passaggi di protocollo, dispositivi di protezione personale (PPE) devono essere indossati e approcci di prevenzione contaminazione rigorosi devono essere prese. Osservare il flusso di lavoro da pre-amplificazione aree di aree di lavoro di post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dei campioni di lavoro. Tutte le forniture utilizzate sono sterili, libero della RNasi, DNasi, DNA e pirogeni. Tutti i puntali vengono filtrati. Un diagramma di flusso dei passaggi del protocollo è fornito (Figura 1).

1. lisi del campione

Nota: Lisi del campione ed estrazione di acidi nucleici vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione di DNA/RNA in un ambiente pulito dove sia procedurali che ingegneria dei controlli sono in atto per ridurre al minimo l'introduzione di batteri ambientali ai campioni.

1. Preparazione dell'area di lavoro
   1. Pulire l'armadio di sicurezza biologica (BSC) lavora zona con detergente appropriato superficie per eliminare eventuali contaminazioni di acido nucleico.
   2. Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostarlo a 37 ° C.
2. Preparare il tampone di lisi tiocianato di guanidinium (Vedi tabella materiali)
   1. Controllare il buffer di lisi per precipitati. Ri-sciogliere precipitati dal riscaldamento a 37 ° C.
   2. Preparare 600 µ l di tampone di lisi con 6 µ l β-mercaptoetanolo (β-ME) per ogni campione. Si consideri un volume di 20% supplementare per campione.
3. Preparazione del campione
   1. Se il latte intero è congelato, scongelare su ghiaccio. Aliquotare 5ml di intero latte in un 15 mL o in una provetta sterile 5 mL in BSC e tenerlo sul ghiaccio.
   2. Girare il latte 5 mL aliquota per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C per agglomerare le cellule.
   3. Rimuovere lo strato di grasso, ora lo strato superiore del tubo, con una spatola di plastica o grande foro punta della pipetta.
   4. Senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il supernatante ad eccezione di 100 µ l.
   5. Lavare la pallina di risospensione in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
   6. Preparare 1 controllo negativo aggiungendo 1 mL di PBS sterile in una provetta 5 mL.
   7. Trasferire la sospensione in una provetta pulita 1,5 mL centrifuga e spin in una microcentrifuga per 1 min (a temperatura ambiente (TA) fino a 5.000 x g).
   8. Per scartare l'intero livello di surnatante/grassi, usare una punta di pipetta sterile filtrata 1.000 µ l.
   9. Se non estraendo lo stesso giorno, snap congela la cella a pellet inserendolo in un etanolo/a secco ghiaccio semiliquido e trasferire immediatamente al congelatore-80 ° C.
4. Rottura del campione e l'omogeneizzazione (tallone-battente)
   1. Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi contenente β-ME al pellet e trasferire la sospensione in una provetta di tallone.
   2. Ogni lotto di estrazione di 12 contiene 10 campioni, 1 controllo negativo (preparata al punto 3.7 sopra) e 1 controllo positivo (preparato nel passaggio successivo).
      1. Preparare 1 controllo positivo con buffer di lisi e 20 µ l del campione finto batterico (la comunità finta utilizzata ha una concentrazione, una volta estratta, di circa 0,2 ng / µ l di DNA).
   3. Vortice tutti perlina tubi energicamente per 15 s.
   4. Riscaldare i campioni sul Vortex termostatato a 37 ° C per 10 min, con agitazione a 700-800 giri/min.
   5. Caricare il set di adattatori di apparecchiature automatiche disruptor tubi.
   6. Tallone battere per 1 min a 30 Hz.
   7. Smontare il set di adattatori e passare manualmente la scheda impostata con le piastre di campione dal braccio robotico di sinistra del braccio robotico destra dello strumento.
   8. Tallone battere per un altro 1 min a 30 Hz.
   9. Provette per centrifuga a 17.200 x g, per 3 min a 25 ° C.
   10. Rimuovere tutti il surnatante con una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a non ottenere qualsiasi dello strato di grasso nella parte superiore del campione o il tallone residua nella parte inferiore del campione e si applicano a una colonna di omogeneizzatore.
   11. Colonne di omogeneizzatore centrifuga alla massima velocità, 17.200 x g per 3 min a 25 ° C.
   12. Trasferire 350 µ l di eluato microcentrifuga di un produttore di 2 mL per uso con lo strumento automatizzato per la purificazione di DNA e RNA (non usare qualsiasi altro tubo). Fare attenzione a non trasferire qualsiasi strato residuo di grasso.
   13. Se il volume di flusso continuo è a meno di 350 µ l, aggiungere tampone di lisi con β-ME ad un volume finale di 350 µ l.
   14. I campioni di lasciare RT per fino a 2 h prima di procedere all'isolamento dell'acido nucleico utilizzando lo strumento di purificazione automatizzato del DNA, o congelare a-80 ° C.
5. Area di lavoro di pulizia
   1. Pulire tutte le superfici in utilizzano con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min, poi spruzzare con etanolo al 70% e pulire la superficie.

2. isolare il DNA/RNA

1. Preparazione dell'area di lavoro
   1. Attivare il blocco di calore e regolare la temperatura di 70 ° C.
   2. Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostare la temperatura a 37 ° C.
   3. Scaldare il buffer di eluizione (EB) contenente 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, in un tubo da 50 mL a 70 ° C.
   4. Scaldare 350 µ l di campione congelato lisati in provette da 2 mL a 37 ° C fino a quando completamente scongelato senza alcun precipitato (circa 10 min).
2. Purificazione del DNA
   1. Vortex e centrifugare le provette 2 mL con campione brevemente (3000 x g per 10 s).
   2. Inserire 2 mL provette nello shaker seguendo il grafico del carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA, secondo le istruzioni del produttore.
   3. Ottenere i rotore adattatori e impostarle sul vassoio in base al numero di campioni.
   4. Etichettare ogni adattatore rotore basata sull'identificazione del campione (ID).
   5. Tagliare i coperchi e lisciare i bordi delle colonne singole spin per DNA e RNA.
   6. Inserire la colonna di spin di DNA senza il tubo di raccolta nell'adattatore del rotore. Gettare la provetta di raccolta.
   7. Etichetta 1,5 mL provette per la raccolta e inserire gli adattatori del rotore.
   8. Set adattatori per rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.
   9. Inserire 1.000 µ l-puntali del produttore con filtro in rack di punta.
   10. Aggiungere acqua RNAsi-libera al tubo del microcentrifuge del costruttore 2 mL dipenda dal numero di campioni (per istruzioni di macchina specifico protocollo).
   11. Inserire il tubo nella fessura del tubo "A" di slot di tubo del microcentrifuge.
   12. Scartare qualsiasi reagente che è rimasto in flaconi di reagente e riempire con un volume minimo di 10 mL.
   13. Il portabottiglie di reagente (tranne bottiglia EB), inserire i flaconi dei reagenti.
   14. Aggiungere EB caldo da un tubo da 50 mL per la posizione di bottiglia del Reagente 6.
   15. Verifica provette da 1,5 mL sono collocate strettamente negli adattatori del rotore.
   16. Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "estrazione kit" → "Animale, tessuti e cellule" → "del kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" → modificare Volume di eluizione per 100 µ l (impostazione predefinita) o 50 µ l per biomassa basso campioni → "Start".
   17. Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.
   18. Scartare la colonna di spin di DNA dalla posizione del rotore adattatore 3.
   19. Non gettare gli adattatori del rotore, il RNA è in posizione 2.
   20. Rimuovere i tubi di raccolta 1,5 mL contenente DNA eluito nella posizione 3 e memorizzare in − 20 ° C.
   21. Raccogliere campione contenente tubi da shaker e negozio a − 20 ° C, se qualsiasi campione è lasciato sopra, altrimenti scartare.
   22. Continuare con il protocollo "del kit nome 350 µ l parte B RNA" per ulteriore purificazione del RNA.
   23. Purificazione RNA sarà fatto dai circa 350 µ l flusso continuo che è in posizione centrale di adattatori del rotore.
3. Purificazione di RNA
   1. Inserire la colonna di spin di RNA privo di coperchio e tubo di raccolta nell'adattatore del rotore.
   2. Etichetta del nuovo 1,5 mL provette per la raccolta e inserirli nell'adattatore del rotore, come indicato nel manuale.
   3. Impostare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.
   4. Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "Kit del produttore" → "Animale, tessuti e cellule" → "Standard parte B RNA" → "Start".
   5. Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.
   6. Scartare la colonna spin RNA dalla posizione 3.
   7. Provette da 1,5 mL contenente 30 µ l eluiti RNA alla posizione 3 di rimuovere e conservare a − 80 ° C.
   8. Rimuovere i flaconi dei reagenti.
   9. Smaltire i contenuti di adattatore di rotore attraverso i canali appropriati rifiuti pericolosi.
4. Postazione di lavoro pulita
   1. Spray accessori tutti automatizzato del DNA/RNA purificazione dello strumento, quali cremagliere del reagente, vassoio e qualsiasi altra superficie in uso con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min e risciacquare con acqua deionizzata (DI), poi lasciarli asciugare.
   2. Spruzzo strumento automatizzato con solo produttore approvato soluzione di decontaminazione non enzimatici, pulire l'interno della centrifuga insieme a tutte le superfici in uso, lasciare per 10 min e poi pulire con etanolo al 70%. Non utilizzare altri tipi di soluzioni di decontaminazione, poichè possono danneggiare lo strumento.

3. mirati 16S PCR set-up

Nota: Il set-up per la PCR 16S avviene in un'area di lavoro pre-amplificazione designato che si trova all'interno della camera bianca. I reagenti ed i campioni sono preparati e quindi caricati su un gestore liquido per eseguire la PCR per ciascun campione in triplice copia (30 campioni, sono veri campioni e controlli positivi e negativi di estrazione, più 2 PCR acqua controlli in triplice copia, per un totale di 96 combinato di campioni e controlli). Una volta che le reazioni di PCR sono assemblate e sigillate, piatto del campione viene trasferito un termociclatore situato in una zona di post-amplificazione per il ciclismo.

1. Preparazione dell'area di lavoro
   1. Pulire la workstation PCR. Spruzzo che tutte le superfici in uso con un DNA di RNasi, DNasi, decontaminante, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.
   2. Preparare il foglio di lavoro di PCR 16S (vedere il foglio di lavoro di Targeted 16S PCR) con un elenco di esempi precisi e primer con codici a barre diversi assegna a ciascun campione⁹. Stampare il foglio di lavoro e le mappe di piastra (Vedi Tavola 1).
2. Preparazione della master mix PCR
   Nota: selezione dell'iniettore 16S si basa sulla regione di interesse per lo studio particolare e può cambiare dal tipo studio o campione. Pertanto, prima di ordinare il primer, è importante confermare quale area del rRNA 16S migliori amplifica i microbi di interesse per lo studio particolare. Questo protocollo come scritto è per l'amplificazione della regione 16S V4. Se vengono selezionata diversa primer/regione, quindi la temperatura di annealing nel ciclismo termica potrebbe richiedere la modifica.
   1. Lavorare nella workstation PCR per preparare tutto.
   2. Prendere 50-100 µ l di campioni di DNA da-20 ° C e tutti i reagenti necessari e li scongelare su ghiaccio. Vortice e brevemente rotazione verso il basso.
   3. I primers sono pre-diluiti alla concentrazione di lavoro di 5 µM in un volume minimo di 20 µ l.
   4. Preparare il mix master di PCR nel tubo 5ml specifici con solo il primer in avanti secondo il calcolo del foglio di lavoro.
3. Preparando il manipolatore robotizzato liquido per l'installazione automatica di PCR
   1. Per i campioni, prendere fuori adattatore campione di uno strumento di 32-pozzo e caricare 50-100 µ l di campioni di DNA secondo la mappa di piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
      1. Per ogni piatto PCR, impostare 2 controlli negativi inserendo 30 µ l di acqua PCR in una provetta pulita.
      2. Posto tutti i campioni su adattatore campione dello strumento 32-pozzo con tappi bloccati in posizione aperta.
   2. Per iniettori d'inversione⁹
      1. Rimuovere il tappo di ogni primer reverse con codice a barre specifico # s uno alla volta (cambiare i guanti in mezzo per evitare la contaminazione incrociata).
      2. Inserire un massimo di 32 primer sull'adattatore Reagente dello strumento.
   3. Prendete una piastra PCR a 96 pozzetti ed etichettarlo con Studio nome, numero di campioni, data e le iniziali del tecnico.
   4. Il gestore di liquido robotico di caricamento
      1. Posizionare l'adattatore reagente B1. Al fine di evitare un effetto contorno, posizionare un bordo dell'adattatore contro il lato di presa e portare lentamente l'altro bordo. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.
      2. Inserire l'adattatore di campione in posizione C1. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.
      3. Vortice il mix master 5 mL, aprire il tappo e inserirlo nella posizione al blocco dello strumento matrice mix e reagente.
      4. Posizionare la piastra PCR su adattatore 96 pozzetti dello strumento che è destinato a contenere metà costeggiava piastre PCR.
      5. Avviare l'esecuzione e salvare come nuovo file.
      6. Seguire le istruzioni e spunta ogni prompt: uno, i consigli sono disponibili, due, scatola degli scarti è disponibile, e tre, iniziare.
   5. Dopo che viene completata l'esecuzione, verificare che non siano presenti errori controllando la macchina per i messaggi di errore.
   6. Sigillare la piastra con i 12 o strip 8 tappi, vortice vigorosamente e spin giù per 1 min utilizzando un filatore piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul ghiaccio o in frigorifero.
   7. Rimuovere le provette contenenti i campioni e iniettori d'inversione.
   8. Prendere la piastra a 96 pozzetti per la camera di post-amplificazione e caricare la piastra sul termociclatore e ciclo in base alla tabella delle condizioni termiche-ciclismo (Vedi tabella 1).

4. controllo di qualità Post-PCR 16S mirate utilizzando la piattaforma basata su nastro per elettroforesi del Gel

Nota: Post-PCR (controllo qualità) e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una determinata area di post-amplificazione del laboratorio. Il DNA viene analizzato in un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA.

1. Preparazione dell'area di lavoro
   1. Pulire la workstation spruzzando che decontaminante tutte le superfici in uso con RNAsi, DNasi, DNA, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.
   2. Raccogliere tutte le forniture e le attrezzature necessarie.
2. Preparare i reagenti
   1. Tampone del campione posto e scaletta nel Vortex a temperatura controllata a 25 ° C per un minimo di 30 min.
3. Mentre i reagenti si scaldano, preparazione di campioni PCR mettendo in comune i 3 repliche PCR per ogni campione in un singolo tubo
4. Caricare i campioni sullo strumento.
5. Brevemente vortex e centrifugare tubi con pool prodotto di PCR.
6. Posizionare la piastra a 96 pozzetti dello strumento su una cremagliera a RT ed etichettarlo.
7. Brevemente vortice e spin giù il buffer del campione e la scaletta.
8. Aggiungere 3 µ l di tampone di campione in ciascun pozzetto della piastra ben 96 (necessità almeno 53 µ l/schermo nastro).
9. Eseguire un numero pari di campioni; Se c'è un numero dispari di campioni, è possibile aggiungere 4 µ l di sample buffer in un pozzetto vuoto.
10. Aggiungere 1 µ l di scaletta per una scaletta ben.
11. Seguendo la mappa, aggiungere 1 µ l di prodotto PCR riunita al suo designato bene.
12. Piastra di copertura con sigillo
13. Vortice la piastra utilizzando lo strumento Vortex e adattatore a 2.000 giri/min per 1 min.
14. Girare fino a posizione l'esempio nella parte inferiore del tubo, se ci sono bolle spin giù di nuovo.
15. Avviare il software.
16. Caricare la schermata di caricamento e nastro suggerimenti nello strumento.
17. Caricare i campioni nell'analizzatore frammento con un adattatore di 96 pozzetti.
18. Impostare una corsa con il software del controller.
19. Assicurarsi di selezionare anche numerati pozzi.
20. Scrivere ID campione.
21. Verifica che tutti i pozzi del nastro schermo sono evidenziati in grigio.
22. Assicurarsi che l'analizzatore riconosce tutte le punte di pipetta.
23. Selezionare avvia e specificare un nome file per salvare i risultati (Studio nome, numero del campione e data).
24. Riferimento alle istruzioni del produttore per maggiori dettagli.
25. Dopo che viene completata l'esecuzione, scartare punta, nastro schermo e tubi.
26. Analizzare i dati per nM picco 16S (tra 315-450 bp per V4). Questo picco variano a seconda i primers selezionati.

5. Biblioteca calcolo, pool, Clean-up e QC

1. Dopo aver determinato la dimensione amplicone e molarità di tutti i campioni, le librerie per raggiungere il volume desiderato finale e nM per la libreria di pool della piscina (Vedi esempio di calcolo).
2. Clean-up e concentrato la libreria pool utilizzando una purificazione basati su silice-membrana kit per i prodotti PCR, secondo il produttore di protocollo (Vedi Tabella materiali).
   1. Eluire il DNA con un volume finale di 50 µ l.
3. Misurare la concentrazione della biblioteca pulita immediatamente utilizzando un kit di alta sensibilità DNA incagliato doppio per un fluorimetro, secondo il protocollo del produttore.
   1. Diluire 2 µ l della biblioteca in pool e pulita con 198 µ l di tampone di diluizione plus tintura (diluizione 1: 100).
   2. Registrare il valore misurato dal dispositivo fluorometrica e convertirlo secondo il fattore di diluizione.
4. Usando la concentrazione (ng / µ l) di lettura per la libreria di pool, calcolare la molarità di biblioteca in nM. Utilizzare 1 µ l non diluito libreria per misurare la OD260/280 su uno spettrofotometro di microvolume.
   Nota: Un valore di 1.8-2.0 indica purezza adeguata della biblioteca.
5. Archiviare la libreria finale a-20 ° C fino al momento per il sequenziamento di nuova generazione.

Risultati

Il protocollo presentato qui include passaggi importante controllo qualità (QC) per assicurarsi che il soddisfare di dati generati i valori di riferimento per il controllo di sensibilità, specificità e contaminazione di protocollo. Primo passo QC del protocollo segue l'amplificazione di PCR della regione 16S V4 (Figura 2). Un µ l del prodotto PCR di ogni campione è stato analizzato tramite l'elettroforesi per confermare che era all'interno della gamma di...

Discussione

Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione¹⁸. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione^{7,19 , 20}. per meglio facilitare 16S robust...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit	Qiagen	80204	DNA/RNA extraction kit
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer	Fisher Scientific		temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus	Qiagen	1053393	guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads	MP Biomedicals	116914050	bead tube
QIAgen TissueLyzer	Qiagen	85300	automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column	Qiagen	79654
QIAgen RB tube			manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware	Qiagen	9001292	automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus	Applichem	A7089	non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer	Qiagen	19086	elution buffer
QIAgility and related plasticware	Qiagen	9001532	robotic liquid handler
PCR water	MO BIO	17000-
5PRIME HotMasterMix	Quantabio	2200400
Barcoded reverse primers	Eurofin	No Catalog #'s	designed and ordered
96 well PCR plate	USA scientific	1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware	Agilent	G2964AA	automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation	Agilent	5067-5585	Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit	Zymo Research	50444470	PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216
NanoDrop	Thermo Fisher		microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	No Catalog #'s	next generation sequencer