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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Zusammenfassung

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Einleitung

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.

Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.

Protokoll

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).

1. Probe lyse

Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein DNA/RNA-Extraktion-Kit in einem Reinraum wo gibt es technische und verfahrenstechnische Kontrollen, die Einführung von Umweltbakterien zu den Proben zu minimieren.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Das Biosafety-Kabinett (BSC) Arbeitsbereich sauber mit entsprechenden Oberflächen Reiniger, Nukleinsäure-Verunreinigungen zu beseitigen.
    2. Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer, und setzen Sie ihn auf 37 ° C.
  2. Guanidinium-Thiocyanat-Lyse-Puffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien)
    1. Überprüfen Sie die Lyse-Puffer für Ausscheidungen. Wieder lösen sich Ausscheidungen durch die Erwärmung bei 37 ° C.
    2. Bereiten Sie 600 µL Lyse Puffer mit 6 µL β-Mercaptoethanol (β-ME) für jede Probe. Betrachten Sie ein extra 20 % Volumen pro Probe.
  3. Vorbereitung der Probe
    1. Wenn Vollmilch eingefroren ist, lassen tauen Sie es auf Eis auf. Aliquoten 5 mL des ganzen Milch in einem 15 mL oder eine 5 mL steriles Röhrchen im BSC und halten sie auf dem Eis.
    2. Drehen Sie die 5 mL Milch aliquoten für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C, pellet-Zellen.
    3. Die Fettschicht zu entfernen, jetzt die oberste Schicht in der Röhre, mit einem Kunststoffspachtel oder große Bohrung Pipettenspitze.
    4. Ohne zu stören das Pellet, entfernen des Überstands mit Ausnahme von 100 µL.
    5. Waschen Sie die Pellets von resuspending in 1 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    6. Bereiten Sie 1 negative Kontrolle durch Zugabe von 1 mL sterile PBS, eine 5-mL-Tube.
    7. Die Aussetzung auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und spin in einem Microcentrifuge für 1 min (5.000 x g bei Raumtemperatur (RT)).
    8. Verwenden Sie eine 1.000 µL steriler gefilterter Pipettenspitze um die gesamte Ebene überstand/Fettsäuren zu verwerfen.
    9. Wenn nicht extrahieren am selben Tag snap frieren die Zelle pellet-indem man es in einem Ethanol/trocken Eis Gülle und sofort auf die-80 ° C Gefrierschrank zu übertragen.
  4. Probe-Störung und Homogenisierung (Wulst-schlagen)
    1. Fügen Sie 600 µL Lyse Puffer mit β-ME zum Pellet und übertragen Sie die Aussetzung zu einem Wulst-Schlauch.
    2. Jede Charge der Extraktion von 12 enthält 10 Proben, 1 Negativkontrolle (vorbereitet in Schritt 3.7 oben) und 1 positiv-Kontrolle (im nächsten Schritt vorbereitet).
      1. Bereiten Sie 1 Positivkontrolle mit Lyse-Puffer und 20 µL der bakteriellen mock Probe (mock Gemeinschaft verwendet hat eine Konzentration, die einmal extrahiert, von ca. 0,2 ng/µL DNA).
    3. Vortex alle bead Tubes energisch für 15 s.
    4. Erwärmen Sie Proben über temperaturgesteuerte Vortexer bei 37 ° C für 10 min, mit Schütteln bei 700-800 u/min.
    5. Laden Sie Rohre in das automatisierte Sample Disruptor Adapterset.
    6. Wulst schlagen für 1 min bei 30 Hz.
    7. Zerlegen Sie das Adapter-Set und manuell wechseln des Adapters set mit die Musterplatten aus der linken Roboterarm, der rechts Roboterarm des Instruments.
    8. Wulst schlagen für ein weiteres 1 min bei 30 Hz.
    9. Zentrifuge Röhren 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.
    10. Entfernen Sie alle der Überstand mit einer 200 µL Pipette, wobei Sie darauf achten, nicht um eine der fetthaltigen Schicht an der Spitze der Probe oder die Perle Rückstände an der Unterseite der Probe, und gelten für eine Spalte Homogenisator.
    11. Zentrifuge Homogenisator Spalten mit maximaler Geschwindigkeit, 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.
    12. Übertragen Sie 350 µL Eluat auf ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch für den Einsatz mit dem automatisierten Instrument zur Reinigung von DNA und RNA (verwenden Sie nicht anderen Röhre). Achten Sie darauf, dass Sie keine verbleibende Fettschicht zu übertragen.
    13. Bei der Durchströmung Größe von weniger als 350 µL fügen Sie Lyse Puffer mit β-ME zu einem Endvolumen von 350 µL hinzu.
    14. Lassen Sie die Proben an RT für bis zu 2 Stunden bevor Sie fortfahren Nukleinsäure-Isolierung mit dem automatisierten DNA-Reinigung-Instrument oder Einfrieren bei-80 ° C.
  5. Reinigung Arbeitsbereich
    1. Sauber alle Oberflächen in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 min, dann sprühen Sie mit 70 % Ethanol und wischen Sie die Oberfläche.

(2) isolieren Sie DNA/RNA

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Schalten Sie den Heizblock und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C.
    2. Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
    3. Wärmen Sie die Elution Puffer (EB) mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in einem 50-mL-Röhrchen bis 70 ° C.
    4. Wärmen Sie 350 µL eingefrorene Samenprobe Lysates in 2 mL Röhrchen bei 37 ° C, bis Sie vollständig aufgetaut ohne jede Niederschlag (ca. 10 min).
  2. DNA-Reinigung
    1. Wirbel und Zentrifuge der 2-mL-Röhrchen mit kurz Probe (3000 X g für 10 s).
    2. Legen Sie 2 mL Röhrchen in den Shaker nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gemäß den Herstellerangaben.
    3. Bekommen Sie die Rotor-Adapter und richten Sie diese auf dem Tablett, basierend auf der Anzahl der Proben.
    4. Beschriften Sie jeden Rotor Adapter anhand des Beispiels Identifikation (ID).
    5. Schneiden Sie den Deckel und glätten Sie die Kanten der einzelnen Spin Spalten für DNA und RNA.
    6. Fügen Sie die DNA Spin Spalte ohne das Sammelröhrchen in den Rotor-Adapter. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen.
    7. Label 1,5 mL Röhrchen und Rotor-Adapter stecken.
    8. Rotor-Adapter in die Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.
    9. Tipp-Racks stecken Sie des Herstellers 1.000 µL Filterspitzen.
    10. Ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch basierend auf der Anzahl der Proben (je spezifischen Maschinenanweisungen Protokoll) fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu.
    11. Stecken Sie das Rohr in Rohr-Steckplatz "A" Microcentrifuge Schlauch Slots.
    12. Entsorgen Sie Reagenz, das in Flaschen Reagenz und füllen mit einem Mindestvolumen von 10 mL übrig bleibt.
    13. Das Reagenz Flaschenregal (außer EB Flasche) stecken Sie Reagenz Flaschen.
    14. Die Position der Reagenz Flasche 6 warme EB aus der 50-mL-Tube hinzufügen.
    15. Check-1,5 mL-Tuben sind eng in die Rotor-Adapter platziert.
    16. Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Extraktion Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Kit Name 350 µL Teil A Custom DNA" → Elution Lautstärke 100 µL (Standard) oder 50 µL für niedrigen Biomasse Proben → bearbeiten "Start."
    17. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf dem Tablett.
    18. Entsorgen Sie die DNA Spin Spalte von Rotorposition Adapter 3.
    19. Rotor-Adapter nicht wegwerfen, RNA ist in der Position 2.
    20. 1,5 mL Röhrchen mit eluierten DNA an Position 3 zu entfernen und speichern in −20 ° C.
    21. Sammeln Sie Probe-haltige Rohre im Shaker und Store in −20 ° C, wenn jede Probe, sonst verwerfen übrig ist.
    22. Fahren Sie mit dem Protokoll "Kit Name 350 µL Teil B RNA" für die weitere Reinigung der RNA.
    23. RNA-Reinigung erfolgt von der rund 350 µL durchströmten, die in der mittleren Position des Rotors Adapter ist.
  3. RNA-Reinigung
    1. Fügen Sie die RNA Spin Spalte ohne seine Sammelröhrchen und Deckel in den Rotor-Adapter.
    2. Beschriften Sie neue 1,5 mL Röhrchen und in Rotor-Adapter setzen Sie ein, wie im Handbuch angegeben.
    3. Die Rotor-Adapter in der Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.
    4. Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Des Herstellers Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Standard Teil B RNA" → "Start."
    5. Nach Fertigstellung, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge zu und legen Sie sie auf dem Tablett.
    6. RNA-Spin-Spalte von Position 3 zu verwerfen.
    7. 1,5 mL Röhrchen mit 30 µL eluiert RNA an Position 3 zu entfernen und Lagern bei −80 ° C.
    8. Reagenz-Flaschen zu entfernen.
    9. Rotor-Adapter Inhalt durch entsprechende Sondermüll Kanäle entsorgen.
  4. Sauberen Arbeitsplatz
    1. Spray alle automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments Zubehör wie Reagenz Racks, Tablett und einer anderen Oberfläche in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 Minuten und Spülen mit entionisiertem Wasser (DI), dann trocknen lassen.
    2. Spray die automatisierten Instrument mit nur Hersteller genehmigt nicht-enzymatische Dekontaminationslösung, wischen Sie die Innenseite der Zentrifuge zusammen mit allen Oberflächen lassen für 10 min und wischen Sie dann mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie andere Arten von Dekontamination Lösungen nicht, da diese das Gerät beschädigen können.

3. gezielte 16 s PCR Setup

Hinweis: Das Setup für die 16 s-PCR wird in einem dafür vorgesehenen Vorverstärkung Arbeitsbereich befindet sich innerhalb der Reinraum durchgeführt. Die Reagenzien und Proben sind vorbereitet und dann auf einen flüssigen Handler durchführen die PCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung (30 Proben, darunter wahre Proben und Extraktion positive und negative Kontrollen, plus 2 PCR Wasser steuert in dreifacher Ausführung, für eine Gesamtmenge von 96 verladen kombinierten Proben und Kontrollen). Sobald die PCR-Reaktionen montiert und abgedichtet sind, ist ein Thermocycler befindet sich in einer Post-Verstärkung-Gebiet zum Radfahren Probenteller übertragen.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Reinigen Sie die PCR-Workstation. Spray, die alle Oberflächen mit einer RNase, DNase, DNA Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.
    2. Vorbereiten der 16 s-PCR-Arbeitsblatt (siehe gezielte 16 s PCR Arbeitsblatt) eine genaue Liste und weisen unterschiedliche Barcodes Primer an jede Probe-9. Drucken Sie das Arbeitsblatt und die Platte Karten (siehe Plate 1).
  2. PCR-master-Mix-Vorbereitung
    Hinweis: 16 s Grundierung Auswahl basiert auf der Region von Interesse für die Studie und kann durch Studium oder Probe-Typ ändern. Daher vor der Bestellung Primer, ist es wichtig, welchem Bereich der 16 s rRNA beste verstärkt die Mikroben von Interesse für die Studie zu bestätigen. Dieses Protokoll wie geschrieben ist für die Verstärkung der 16 s V4 Region. Verschiedenes Grundierungen/Region ausgewählt sind, kann die Anlasstemperatur in die Temperaturzyklen Anpassung verlangen.
    1. Arbeiten Sie in der PCR-Arbeitsstation, um alles vorzubereiten.
    2. Nehmen Sie 50-100 µL DNA-Proben von-20 ° C und alle benötigten Reagenzien und tauen sie auf Eis. Wirbel und kurz spin-down.
    3. Die Primer werden vorab zur Arbeit Konzentration von 5 µM in ein Mindestvolumen von 20 µL verdünnt.
    4. Bereiten Sie die PCR-master-Mix in der spezifischen 5 mL Tube mit nur die forward Primer nach der Berechnung auf dem Arbeitsblatt.
  3. Vorbereitung des Roboter liquiden Handlers für automatisierte PCR setup
    1. Für Proben ein 32-gut Instrument Probe Adapter herausnehmen, und 50-100 µL DNA-Proben nach der 96-Well-Platte-Karte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu laden.
      1. Für jede PCR-Platte 2 Negativkontrollen indem man 30 µL des PCR-Wasser in einem sauberen Probenröhrchen eingerichtet.
      2. Legen Sie alle Proben auf das 32-gut Instrument Probe Adapter mit Kappen verschlossen in Offenstellung.
    2. Für reverse Primer9
      1. Entfernen Sie die Kappe von jedem rückwärts-Primer mit bestimmten Barcode # es eins zu einem Zeitpunkt (Handschuhe wechseln dazwischen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden).
      2. Legen Sie maximal 32 Primer auf das Instrument Reagenz Adapter.
    3. Nehmen Sie eine 96-Well-PCR-Platte und beschriften Sie sie mit Studiennamen, Probennummer, Datum und Initialen des Technikers.
    4. Laden den Roboter liquiden handler
      1. Setzen Sie den Reagenz-Adapter auf B1. Um einen Effekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und langsam die andere Kante herab. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.
      2. Setzen Sie die Probe-Adapter in Position C1. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.
      3. Wirbel der 5-mL-master-Mix, öffnen Sie die Kappe, und legen Sie sie in Position A auf das Instrument master Mix und Reagenz Block.
      4. Legen Sie die PCR-Platte auf der 96-Well-Instrument-Adapter, der halb skirted PCR-Platten halten soll.
      5. Den Durchlauf starten und als neue Datei speichern.
      6. Folgen Sie den Anweisungen und Häkchen jeder Eingabeaufforderung: einerseits Tipps gibt es, zwei, Abfallbehälter ist verfügbar, und drei, starten.
    5. Nach der abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, es gab keine Fehler durch die Überprüfung der Maschine für Fehlermeldungen.
    6. Dichtplatte mit den 12 oder 8 Streifen Kappen, Strudel kräftig, spin-down für 1 min mit einem 96-Well-Platte-Spinner und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank stellen.
    7. Röhrchen mit reverse Primer und Proben zu entfernen.
    8. Nehmen Sie die 96-Well-Platte um den Post-Verstärkung-Raum und laden Sie die Platte auf den Thermocycler und Zyklus entsprechend der Tabelle des thermischen Radfahren Bedingungen (siehe Tabelle 1).

4. gezielte 16 s Post-PCR-Qualitätskontrolle mit Band-basierte Plattform für Gelelektrophorese

Hinweis: Post-PCR-Qualitätskontrolle (QC) und alle weiteren Schritte werden in einem bestimmten Bereich der Post-Verstärkung des Labors durchgeführt. Die DNA wird in einen automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer analysiert.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Reinigen Sie die Arbeitsstation durch Spritzen, die alle Oberflächen mit RNase, DNase, DNA-Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.
    2. Sammeln Sie alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände benötigt.
  2. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Der temperaturgesteuerten Vortexer bei 25 ° C für mindestens 30 min entgegenbringen Sie Probenpuffer und Leiter.
  3. Während die Reagenzien Aufwärmen, bereiten Sie PCR Proben vor, durch die Bündelung der 3 PCR-Wiederholungen für jede Probe in ein einzelnes Rohr
  4. Proben am Instrument zu laden.
  5. Kurz Wirbel und Spin-down Rohre mit gepoolten PCR-Produkt.
  6. Platzieren Sie das Instrument 96-Well-Platte auf eine Zahnstange bei RT und beschriften Sie sie.
  7. Kurz nach unten Wirbel und Spin Probenpuffer und Leiter.
  8. Geben Sie 3 µL Probenpuffer in jedes der 96-well-Platte (Notwendigkeit mindestens 53 µL/Bildschirm Klebeband).
  9. Führen Sie eine gerade Anzahl von Proben; besteht eine ungerade Anzahl von Proben, geben Sie 4 µL Probenpuffer in eine leere.
  10. Hinzu kommt 1 µL Leiter Anlegeleiter gut.
  11. Nach der Karte hinzufügen 1 µL der gepoolten PCR-Produkt seiner ausgewiesenen gut.
  12. Abdeckplatte mit Folienversiegelung
  13. Wirbel der Platte mit des Instruments Vortexer und Adapter bei 2.000 u/min für 1 min.
  14. Drehen Sie wieder nach unten in Position, die die Probe an der Unterseite des Rohres, wenn es gibt Spin down sprudelt.
  15. Starten Sie die Software.
  16. Laden Sie Bildschirmtipps Band und laden in das Gerät.
  17. Proben in den Fragment-Analysator mit einem 96-Well-Adapter zu laden.
  18. Richten Sie ein mit der Controller-Software laufen.
  19. Achten Sie darauf, wählen geradzahligen Brunnen.
  20. Beispiel-IDs zu schreiben.
  21. Überprüfen Sie, dass die Brunnen des Bandes Bildschirm grau hervorgehoben werden.
  22. Stellen Sie sicher, dass der Analyzer erkennt die Pipettenspitzen.
  23. Wählen Sie Start, und geben Sie einen Dateinamen, um die Ergebnisse zu speichern (Studie Probennummern, Name und Datum).
  24. Beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für weitere Details.
  25. Nachdem das abgeschlossen ist, entsorgen Sie Tipp, Bildschirm Klebeband und Röhren.
  26. Analysieren von Daten für 16 s Peak nM (zwischen 315-450 bp für V4). Dieser Gipfel variieren je nach dem Primer ausgewählt.

5. Bibliothek Berechnung, Pooling, Clean-Up, und QC

  1. Nach der Bestimmung der Größe der Amplifikate und Molarity aller Proben, bündeln die Bibliotheken zur Erreichung der gewünschten Endvolumen und nM für die gepoolten Bibliothek (siehe Beispielrechnung).
  2. Clean-Up und Konzentrat die gepoolte Bibliothek mit einer Silica-Membran-basierten Läuterung kit für PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Eluieren Sie die DNA mit einem Endvolumen von 50 µL.
  3. Messen Sie die Konzentration der gereinigten Bibliothek sofort mit den doppelten gestrandeten DNA-hohe Empfindlichkeit Kit für ein Fluorometer laut Protokoll des Herstellers.
    1. Verdünnen Sie 2 µL der gebündelt und gereinigte Bibliothek mit 198 µL des Verdünnungspuffer plus Farbstoff (1: 100 Verdünnung).
    2. Nehmen Sie den gemessenen Wert vom fluorometrisch Gerät und nach den Verdünnungsfaktor zu konvertieren.
  4. Mit der Konzentration (ng/µL) für die gepoolten Bibliothek lesen, berechnen Sie die Bibliothek Molarity in nM. Verwenden Sie 1 µL unverdünnte Bibliothek der OD260/280 auf einem Microvolume Spektralphotometer messen.
    Hinweis: Der Wert von 1,8-2,0 gibt ausreichende Reinheit der Bibliothek.
  5. Speichern Sie die endgültige Bibliothek bei-20 ° C bis bereit für die nächste Generation-Sequenzierung.

Ergebnisse

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-45...

Diskussion

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu er...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extraction kit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo MixerFisher Scientifictemperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME BeadsMP Biomedicals116914050bead tube
QIAgen TissueLyzerQiagen85300automated sample disruptor adapter set
QIAshredder columnQiagen 79654
QIAgen RB tubemanufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticwareQiagen9001292automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plusApplichemA7089non-enzymatic decontamination solution
EB BufferQiagen19086elution buffer
QIAgility and related plasticwareQiagen9001532robotic liquid handler
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinNo Catalog #'sdesigned and ordered
 96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticwareAgilentG2964AAautomated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent5067-5585Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research50444470PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeq   IlluminaNo Catalog #'snext generation sequencer

Referenzen

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