Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

Resumen

Se presenta un flujo de trabajo semi-automático para específica secuenciación de 16S rRNA de la leche humana y otros tipos de biomasa, bajo muestra.

Resumen

Estudios de comunidades microbianas se han generalizado con el desarrollo de la secuencia relativamente barato, rápido y alto rendimiento. Sin embargo, al igual que con todas estas tecnologías, la reproducibilidad depende de un flujo de trabajo de laboratorio que incorpora controles y precauciones apropiadas. Esto es particularmente importante con las muestras de baja biomasa donde contaminantes ADN bacteriano pueden generar resultados engañosos. Este artículo detalla un flujo de trabajo semi automatizado para identificar microbios de las muestras de leche materna humana utilizando secuenciación específica de la región de V4 de ARN ribosómico (ARNr) 16S en una escala de bajo a medio throughput. El protocolo describe la preparación de las muestras de leche entera, incluyendo: lisis, extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de la región V4 del gene del rRNA 16S y preparación de la biblioteca con las medidas de control de calidad de la muestra. Lo importante, el protocolo y la discusión consideran cuestiones que son salientes a la preparación y análisis de muestras de baja biomasa incluyendo controles positivos y negativos adecuados, eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena, contaminación de las muestras ambiental, reactivo, o fuentes experimentales y experimentales mejores prácticas destinadas a garantizar la reproducibilidad. Mientras que el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es adaptable a numerosos tipos de muestras de biomasa de baja y alta, incluyendo las muestras recogidas en torundas, congelados aseado o estabilizado en un buffer de conservación.

Introducción

Las comunidades microbianas que colonizan seres humanos se creen que son críticamente importantes para la salud y la enfermedad que influyen en el metabolismo, desarrollo inmune, susceptibilidad a la enfermedad y las respuestas a la vacunación y medicamentos terapia^{1, 2}. esfuerzos para comprender la influencia de la microbiota en la salud humana en la actualidad destacan la identificación de los microbios asociados con compartimentos anatómicos definidos (es decir, piel, intestinal, oral, etc.), así como de sitios localizados dentro de Estos compartimentos^3,4. Estos esfuerzos de investigación que se basa es la rápida aparición y mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) que proporcionan una plataforma masiva y en paralelo para el análisis del contenido genético microbiano (microbioma) de una muestra. Para muchos las muestras fisiológicas, el microbioma asociado es complejo y abundante (es decir, heces), pero, para algunas muestras, el microbioma está representada por la baja biomasa microbiana (es decir, leche humana, tracto respiratorio inferior) donde sensibilidad, artefactos experimentales y posible contaminación se convierten en cuestiones importantes. Los desafíos comunes de microbioma estudios y el diseño experimental apropiado han sido objeto de varios artículos de revisión^5,6,de^7,8.

Presentados en este documento es una tubería experimental robusta de NGS en base específica secuenciación del rRNA 16S V4 región⁹ para caracterizar el microbioma de la leche humana. Análisis de microbioma de la leche humana son complicado no sólo por una de biomasa microbiana inherentemente baja¹⁰, pero además por altos niveles de ADN humano fondo^11,12,13,14 y potencial remanente de PCR inhibidores^15,16 en ácido nucleico extraído. Este protocolo se basa en kits de extracción disponibles en el mercado y plataformas semi-automatizadas que pueden ayudar a minimizar la variabilidad entre lotes de preparación de muestra. Incorpora una comunidad simulada bacteriana bien definida que es procesada junto a las muestras como un control de calidad para validar cada paso en el protocolo y proporcionar una métrica independiente de robustez de la tubería. Aunque el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es fácilmente adaptable a otros tipos de muestras como heces, rectal, vaginal, piel, frotis oral y areolar^10,17y puede servir como punto de partida para investigadores que deseen realizar análisis de microbioma.

Protocolo

Para todos los pasos de protocolo, debe llevarse equipo de protección personal apropiado (PPE) y estrategias de prevención de contaminación estrictas deben tomarse. Observar el flujo de trabajo de pre-amplificación áreas para las áreas de trabajo de la amplificación para minimizar la contaminación de las muestras de trabajo. Todos los materiales utilizados son estériles, libres de Rnasa, DNasa, ADN y pirógenos. Se filtran todas las puntas de pipeta. Un diagrama de flujo de los pasos del Protocolo se proporciona (figura 1).

1. lisis de la muestra

Nota: Lisis de la muestra y la extracción de ácidos nucleicos se realizan utilizando un kit de extracción de ADN/ARN en un ambiente de sala limpia donde son controles de ingeniería y procedimientos para minimizar la introducción de bacterias ambientales a las muestras.

1. Preparación del área de trabajo
   1. Limpia el área con limpiador apropiado para eliminar cualquier contaminación del ácido nucleic de trabajo el gabinete de seguridad biológica (BSC).
   2. Encienda el Vortex control de temperatura y establecer a 37 ° C.
2. Preparar el tampón de lisis de tiocianato de guanidinio (véase tabla de materiales)
   1. Comprobar el búfer de lisis para precipitados. Volver a disolver precipitados por el calentamiento a 37 ° C.
   2. Preparar 600 μl de tampón de lisis con 6 μl de β-mercaptoetanol (β-ME) para cada muestra. Considerar un volumen adicional de 20% por muestra.
3. Preparación de la muestra
   1. Si la leche está congelada, descongelar el hielo. Alícuota 5 mL de toda la leche en un 15-mL o en un tubo estéril de 5 mL en BSC y mantenerlo en hielo.
   2. Girar la leche 5 mL alícuota durante 10 min a 5.000 x g a 4 ° C para que sedimenten las células.
   3. Quitar la capa de grasa, ahora la capa superior del tubo, con una espátula de plástico o grandes diámetro punta de pipeta.
   4. Sin perturbar el pellet, quite todo el sobrenadante excepto 100 μl.
   5. Lavar el precipitado a resuspender en 1 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS).
   6. Preparar 1 control negativo añadiendo 1 mL de PBS estéril en un tubo de 5 mL.
   7. Transferir la suspensión a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL y centrifugar en una microcentrífuga durante 1 minuto (5.000 x g a temperatura ambiente (RT)).
   8. Utilice una punta de pipeta estéril filtrada de 1000 μL para eliminar toda la capa sobrenadante graso.
   9. Si no extraer el mismo día, broche de presión congela la célula pellets poniendo en una mezcla de hielo seco/etanol y transferirlo inmediatamente en el congelador de-80 ° C.
4. Alteración de la muestra y la homogeneización (grano-paliza)
   1. Añadir 600 μl de tampón de lisis que contienen β-ME a la pelotilla y transferir la suspensión a un tubo de bolas.
   2. Cada lote de extracción de 12 contiene 10 muestras y 1 control negativo (preparado en el paso 3.7 anterior) 1 control positivo (preparado en el paso siguiente).
      1. Preparar 1 control positivo con tampón de lisis y 20 μl de la muestra simulada bacteriana (la falsa comunidad utilizada tiene una concentración, una vez extraída, de aproximadamente 0,2 ng/μl de ADN).
   3. Vortex todo grano tubos vigorosamente durante 15 s.
   4. Calentar las muestras en el Vortex de temperatura controlada a 37 ° C durante 10 min, con agitación a 700-800 rpm.
   5. Cargar tubos en el conjunto de adaptadores de disruptor automatizada de la muestra.
   6. Grano de batir durante 1 min a 30 Hz.
   7. Desmontar el conjunto del adaptador y cambiar manualmente el adaptador establece con las placas de muestra de la robótica del brazo izquierda en el brazo robótico derecho del instrumento.
   8. Grano de batir durante otro 1 min a 30 Hz.
   9. Tubos de centrífuga a 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.
   10. Quite todo el sobrenadante con una pipeta de 200 μL, teniendo cuidado de no conseguir cualquiera de la capa de grasa en la parte superior de la muestra o el reborde residual en la parte inferior de la muestra y se aplican a una columna de homogeneizador.
   11. Columnas de homogeneizador de centrifugar a máxima velocidad, 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.
   12. Transferencia 350 μl de elución al tubo de microcentrífuga de fabricante de 2 mL para uso con el instrumento automatizado para la purificación de DNA y RNA (no use cualquier otro tubo). Tenga cuidado de no transferir cualquier capa de grasa residual.
   13. Si el volumen de flujo es inferior a 350 μl, añadir tampón de lisis con β-ME a un volumen final de 350 μl.
   14. Dejar las muestras en RT por hasta 2 h antes de proceder al aislamiento de ácidos nucleicos mediante el instrumento automatizado de purificación de ADN, o congelar a-80 ° C.
5. Limpiar área de trabajo
   1. Limpie todas las superficies en utilizan con una solución de descontaminación no enzimática, dejan durante 10 minutos, entonces rocíe con etanol al 70% y limpie la superficie.

2. aislar el ADN/ARN

1. Preparación del área de trabajo
   1. Activar el bloque de calor y la temperatura a 70 ° C.
   2. Encienda el Vortex control de temperatura y ajuste la temperatura a 37 ° C.
   3. Caliente el tampón de elución (EB) que contiene 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, en un tubo de 50 mL a 70 ° C.
   4. Calentamiento de 350 μl de lisados de muestra congelada en tubos de 2 mL a 37 ° C hasta completamente descongelado sin cualquier precipitado (aproximadamente 10 min).
2. Purificación de DNA
   1. Vortex y centrifugar los tubos de 2 mL con la muestra brevemente (3000 x g durante 10 s).
   2. Inserte los tubos de 2 mL en la coctelera siguiendo el diagrama de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN, según instrucciones del fabricante.
   3. Conseguir los adaptadores de rotor y configurar en la bandeja de base en el número de muestras.
   4. Etiqueta cada adaptador rotor basado en la identificación de la muestra (ID).
   5. Cortó los párpados y alisa los bordes de las columnas individuales de vuelta para ADN y ARN.
   6. Inserte la columna de la vuelta de ADN sin el tubo de la colección en el adaptador de rotor. Deseche el tubo de la colección.
   7. Etiqueta 1.5 mL tubos e inserte adaptadores de rotor.
   8. Conjunto adaptadores de rotor en la centrifugadora siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN.
   9. Insertar 1.000 μl puntas del fabricante de filtro racks de punta.
   10. Añadir agua libre de ARNasa a tubo de microcentrífuga de fabricante 2 mL basada en el número de muestras (instrucciones de máquina específico protocolo).
   11. Inserte el tubo en la ranura del tubo "A" de las ranuras del tubo de microcentrífuga.
   12. Deseche cualquier reactivo que queda en botellas de reactivo y se llenan de un volumen mínimo de 10 mL.
   13. Introduzca botellas de reactivo en el botellero de reactivo (excepto botellas EB).
   14. Añadir tibia EB de un tubo de 50 mL a la posición de la botella de Reactivo 6.
   15. Verificar tubos de 1.5 mL se colocan firmemente en los adaptadores de rotor.
   16. Cierre la tapa del instrumento y seleccione: "RNA" → "kit de extracción" → "Animal, tejidos y células" → "del kit nombre 350 μl parte A Custom ADN" → editar el volumen de elución de 100 μl (por defecto) o 50 μL para muestras de baja biomasa → "empezar".
   17. Cuando termine, retire los adaptadores de rotor de la centrífuga y colocarlos en la bandeja.
   18. Deseche el columna de vuelta ADN de rotor adaptador posición 3.
   19. No se deshaga de adaptadores de rotor, ARN es en la posición 2.
   20. Retirar tubos de 1,5 mL conteniendo ADN eluída en la posición 3 y almacenar en −20 ° C.
   21. Recoger los tubos que contiene la muestra de la coctelera y tienda de −20 ° C, si cualquier muestra queda, descartar lo contrario.
   22. Continuar con el protocolo "del kit nombre 350 μl parte B RNA" para la posterior purificación del ARN.
   23. Purificación del ARN se realizará desde los aproximadamente 350 μl fluir-por que está en la posición media de los adaptadores de rotor.
3. Purificación de RNA
   1. Inserte la columna de spin de RNA sin su tubo de la colección y la tapa en el adaptador de rotor.
   2. Etiqueta nueva 1.5 mL tubos e insertarlos en adaptador rotor como se indica en el manual.
   3. Configurar los adaptadores de rotor en la centrifugadora siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN.
   4. Cierre la tapa del instrumento y seleccione: "RNA" → "Kit del fabricante" → "Animal, tejidos y células" → "Estándar parte B ARN" → "Start."
   5. Cuando termine, quitar adaptadores de rotor de la centrífuga y colocarlos en la bandeja.
   6. Deseche el columna de RNA spin desde la posición 3.
   7. Retirar tubos de 1,5 mL conteniendo 30 μL eluyó RNA en la posición 3 y tienda a −80 ° C.
   8. Sacar botellas de reactivo.
   9. Disponer de contenidos de adaptador de rotor a través de canales apropiados de residuos peligrosos.
4. Estación de trabajo limpia
   1. Spray de accesorios todo automatizado DNA/RNA purificación del instrumento, tales como estantes el reactivo, bandeja y cualquier otra superficie en utilizan con una solución de descontaminación no enzimática, dejan durante 10 minutos y enjuague con desionizada (DI), luego deje secar.
   2. Spray el instrumento automatizado con sólo fabricantes había aprobado solución de descontaminación no enzimáticos, para limpiar el interior de la centrífuga junto con todas las superficies de uso, dejar durante 10 minutos y luego limpiar con etanol al 70%. No utilice otros tipos de soluciones de descontaminación ya que pueden dañar el instrumento.

3. objetivo 16S PCR configuración

Nota: La configuración para la PCR 16S se lleva a cabo en un área de pre-amplificación designado situado dentro de la sala limpia. Los reactivos y las muestras son preparadas y luego cargadas en un líquido controlador para realizar la PCR para cada muestra por triplicado (30 muestras, que incluyen muestras de verdadera y controles positivos y negativos de la extracción, además de 2 controles de agua PCR por triplicado, para un total de 96 combinado de las muestras y controles). Una vez que las reacciones de PCR se ensamblan y selladas, la placa de la muestra se transfiere a un termociclador situado en una zona de la amplificación para el ciclismo.

1. Preparación del área de trabajo
   1. Limpiar la estación de trabajo PCR. Rocíe que todas las superficies en uso con un ADN de Rnasa, DNasa, decontaminant, seguido por agua desionizada dos veces, y finalmente etanol al 70%.
   2. Preparar la hoja de trabajo de PCR 16S (ver hoja de trabajo PCR 16S de Targeted) con una lista precisa de la muestra y asignar código de barras diferentes cartillas para cada muestra⁹. Imprima la hoja de cálculo y los mapas de placa (ver placa de 1).
2. Preparación del master mix PCR
   Nota: 16S primer selección se basa en la región de interés para el estudio en particular y puede cambiar de tipo de estudio o muestra. Por lo tanto, antes de ordenar cartillas, es importante confirmar qué área del rRNA 16S mejor amplifica los microbios de interés para el estudio en particular. Este protocolo como escrito es para la amplificación de la región V4 de 16S. Si se seleccionan diferentes imprimaciones o región, la temperatura de recocido en los ciclos térmicos puede requerir ajuste.
   1. Trabajo en la estación de trabajo PCR para preparar todo.
   2. Tomar 50-100 μl de muestras de ADN de-20 ° C, y todos los reactivos necesitados y descongelar el hielo. Vortex y centrifugar brevemente abajo.
   3. Los iniciadores son previamente diluidos a la concentración de trabajo de 5 μm en un mínimo volumen de 20 μl.
   4. Preparar la mezcla principal de PCR en el tubo de 5 mL específico con sólo el primer avance según el cálculo en la hoja de cálculo.
3. Preparando el controlador robótico de líquido para configuración automatizada de la polimerización en cadena
   1. Para las muestras, sacar el adaptador de muestra del instrumento de un pozo de 32 y carga 50-100 μl de las muestras de ADN según el mapa de la placa de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante.
      1. Para cada placa PCR, configurar 2 controles negativos colocando 30 μl de agua PCR en un tubo de muestra limpia.
      2. Colocar todas las muestras en el adaptador de muestra del instrumento de 32 bien con tapas bloqueados en posición abierta.
   2. Para imprimaciones inversa⁹
      1. Quite la tapa de cada cartilla reversa con código de barras específico números de uno a la vez (cambio de guantes en el medio para evitar la contaminación cruzada).
      2. Colocar un máximo de 32 iniciadores en el adaptador de reactivos del instrumento.
   3. Tomar una placa de PCR de 96 pocillos y etiqueta con nombre del estudio, número de muestra, fecha y las iniciales del técnico.
   4. Carga el controlador robótico de líquido
      1. Coloque el adaptador de reactivo B1. Para evitar un efecto de borde, con cuidado, coloque un extremo del adaptador contra el lado del asidero y bajar lentamente el otro borde. Asegúrese de que en todos los rincones de los adaptadores.
      2. Coloque el adaptador muestra en la posición C1. Asegúrese de que en todos los rincones de los adaptadores.
      3. Vórtice la mezcla principal de 5 mL, abra la tapa y colóquela en la posición A en el bloque de mezcla y reactivo principal del instrumento.
      4. Coloque la placa PCR en adaptador del instrumento 96-bien que se pretende sostener medio bordeó las placas PCR.
      5. Iniciar la carrera y guardar como un archivo nuevo.
      6. Siga las instrucciones y compruebe cada indicador: uno, consejos están disponibles, dos, caja de residuos está disponible, y tres, empezar.
   5. Una vez finalizado el plazo, verificar había no hay errores de comprobación de la máquina para mensajes de error.
   6. Sellar la placa con la 12 o tira 8 casquillos, vortex vigorosamente, desactivación durante 1 min, utilizando una ruleta de placa de 96 pocillos y coloque en hielo o en el refrigerador.
   7. Quitar los tubos que contiene cebadores inversas y muestras.
   8. Llevar la placa de 96 pocillos a la sala de la amplificación y la carga de la placa en el termociclador y el ciclo según la tabla de condiciones de ciclos térmicos (ver tabla 1).

4. objetivo de Control de calidad de Post-PCR 16S utilizando la plataforma de cinta para electroforesis en Gel de

Nota: Post-PCR control de calidad (QC) y todos los pasos posteriores se llevan a cabo en un área designada de la amplificación del laboratorio. El ADN se analiza en un analizador automatizado del fragmento de ADN/ARN.

1. Preparación del área de trabajo
   1. Pulverizar que todas las superficies en uso con Rnasa, DNasa, DNA decontaminant, seguido por agua desionizada dos veces, y finalmente etanol al 70% para limpiar la estación de trabajo.
   2. Reúna todos los suministros y equipo necesario.
2. Preparar los reactivos
   1. Colocar el tampón de muestra y la escala en el Vortex de temperatura controlada a 25 ° C durante un mínimo de 30 minutos.
3. Mientras que los reactivos son calentamiento, preparar muestras PCR poniendo en común las 3 repeticiones PCR para cada muestra en un solo tubo
4. Cargar las muestras en el instrumento.
5. Brevemente vortex y giro de los tubos con los productos PCR.
6. Coloque la placa de 96 pocillos del instrumento en una parrilla a temperatura ambiente y etiqueta.
7. Brevemente vortex y vuelta por el tampón y la escala.
8. Agregar 3 μl de tampón de muestra a cada pocillo de la placa de la pozo 96 (necesidad de al menos 53 μl/pantalla cinta).
9. Ejecutar un número de muestras; Si hay número impar de muestras, añadir 4 μL del tampón de muestra a un pozo vacío.
10. Añadir 1 μl de escalera a escalera bien.
11. Siguiendo el mapa, añadir 1 μl del producto PCR combinada a su designado bien.
12. Placa de cubierta con papel de aluminio
13. Vórtice de la placa utilizando el instrumento Vortex y adaptador a 2.000 rpm durante 1 minuto.
14. Girar hasta la posición de la muestra en la parte inferior del tubo, si hay burbujas spin hacia abajo otra vez.
15. Ejecute el software.
16. Cargar la cinta con puntas de carga de pantalla en el instrumento.
17. Cargar las muestras en el analizador de fragmento con un adaptador de 96 pocillos.
18. Establecer una gestión con el software de controlador.
19. Asegúrese de que seleccionar pares de pozos.
20. Escriba el ID de muestra.
21. Compruebe que todos los pozos de la cinta de la pantalla están resaltados en gris.
22. Asegúrese de que el analizador reconoce todas las puntas de pipetas.
23. Seleccione Inicio y especifique un nombre de archivo para guardar los resultados (nombre, número de muestra y fecha de estudio).
24. Consulte las instrucciones del fabricante para más detalles.
25. Una vez finalizado el plazo, deseche la punta, cinta de la pantalla y tubos.
26. Analizar los datos para 16S pico nM (entre 315-450 bp para V4). Este pico variará dependiendo de los iniciadores seleccionados.

5. Biblioteca cálculo, agrupación, limpieza y control de calidad

1. Después de determinar el tamaño del amplicón y molaridad de todas las muestras, las bibliotecas para conseguir el volumen final deseado y nM para la biblioteca combinada de la piscina (véase el cálculo de la muestra).
2. Protocolo de limpieza y concentrado la biblioteca combinada con una purificación basado en la membrana de silicona kit para productos PCR, según el fabricante (véase Tabla de materiales).
   1. Eluir el ADN con un volumen final de 50 μl.
3. Medida de la concentración de la biblioteca limpia inmediatamente mediante el uso de un doble había trenzado DNA kit de alta sensibilidad para un fluorómetro, según protocolo del fabricante.
   1. Diluir 2 μl de la biblioteca combinada y limpiada con 198 μl del tampón de dilución más tinte (dilución 1: 100).
   2. Anote el valor medido desde el dispositivo fluorométrico y convertirlo según el factor de dilución.
4. La concentración (ng/μL) de la lectura para la biblioteca agrupada, calcular la molaridad de la biblioteca en nM. Utilice la biblioteca sin diluir de 1 μL para medir la OD260/280 en un espectrofotómetro de microvolume.
   Nota: Un valor de 1.8-2.0 indica pureza adecuada de la biblioteca.
5. Almacenar la biblioteca final a-20 ° C hasta que esté listo para la siguiente secuencia de generación.

Resultados

El protocolo que presentamos incluye pasos importante control de calidad (QC) para asegurar que la reunión de datos generados puntos de referencia para el control de sensibilidad, especificidad y la contaminación de protocolo. Primer paso de control de calidad del protocolo sigue la amplificación por PCR de la región 16S de V4 (figura 2). Un μl del producto de PCR de cada muestra se analizó por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango d...

Discusión

Objetivo generación secuenciación de 16S rRNA es una técnica ampliamente utilizada, rápida para microbioma caracterización¹⁸. Sin embargo, muchos factores, incluyendo efectos de lote, contaminación ambiental, contaminación de la muestra, sensibilidad y reproducibilidad pueden adversamente afectar resultados experimentales y confundir su interpretación^{7,19 , 20}. para mejor facilitar el análisis de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit	Qiagen	80204	DNA/RNA extraction kit
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer	Fisher Scientific		temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus	Qiagen	1053393	guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads	MP Biomedicals	116914050	bead tube
QIAgen TissueLyzer	Qiagen	85300	automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column	Qiagen	79654
QIAgen RB tube			manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware	Qiagen	9001292	automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus	Applichem	A7089	non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer	Qiagen	19086	elution buffer
QIAgility and related plasticware	Qiagen	9001532	robotic liquid handler
PCR water	MO BIO	17000-
5PRIME HotMasterMix	Quantabio	2200400
Barcoded reverse primers	Eurofin	No Catalog #'s	designed and ordered
96 well PCR plate	USA scientific	1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware	Agilent	G2964AA	automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation	Agilent	5067-5585	Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit	Zymo Research	50444470	PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216
NanoDrop	Thermo Fisher		microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	No Catalog #'s	next generation sequencer