JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول لقياس تأثير التغييرات الجلوكوز بوساطة للتنفس المتقدرية حضور المركبات الطبيعية في خلايا بيتا سليمة 832/13 باستخدام ريسبيروميتري ذات الدقة العالية.

Abstract

يسمح ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا المعزولة، والخلايا والأنسجة. خلايا بيتا تلعب دوراً حاسما في الجسم عن طريق ضبط مستويات السكر في الدم عن طريق إفراز الأنسولين استجابة لتركيزات مرتفعة من الجلوكوز. يتم التحكم في إفراز الأنسولين الجلوكوز الأيض والتنفس المتقدرية. ولذلك، قياس التنفس سليمة من خلايا بيتا ضروري لتكون قادرة على تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج لمرض السكري. استخدام وظائف سليمة 832/13-1 اشتقاق خلايا بيتا يمكن أن نقيس تأثير على زيادة تركيز الجلوكوز في التنفس الخلوي. هذا البروتوكول يسمح لنا بقياس التنفس خلية بيتا في وجود أو عدم وجود مركبات مختلفة، مما يسمح أحد تحديد الأثر نظراً للمركبات في التنفس خلية سليمة. هنا علينا أن نظهر تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلية بيتا تحت الوجود منخفض (2.5 مم) أو ظروف ارتفاع الجلوكوز (16.7 مم). يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد تأثير المركبات المختلفة على تنفس خلايا بيتا سليمة وجود تركيزات الجلوكوز متباينة.

Introduction

الغرض الأساسي لخلايا بيتا البنكرياس للحفاظ على نظام نورموجليسيميا عن طريق إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. خلايا بيتا بمعنى التغييرات الفسيولوجية في تعميم الجلوكوز إلى حد كبير نظراً لتقارب منخفضة، عالية السعة الجلوكوز الناقل GLUT2 (الجلوكوز الناقل 2، كم 16.7 ملم)1. مع ارتفاع مستويات السكر الدورة الدموية، يسهل هذا الناقل تقارب منخفضة السعة العالية زيادة تناسبية في الجلوكوز داخل الخلية داخل الخلية بيتا. يتم استقلاب الجلوكوز عن طريق تحلل، ودورة TCA (دورة حمض تريكاربوكسيليك) والتنفس المتقدرية أسفر عن ارتفاع مستويات ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) الخلوية. أن تركيز ATP مرتفعة كتل قنوات ك+ الحساسة ATP، أسفر عن غشاء ديبولاريزيشن. Depolarization الغشاء يسبب فتح بوابات الجهد Ca2 + قنوات والإصدار التالي من حويصلة منضم الأنسولين حبيبات2. الخلل في خلايا بيتا هي السمة مميزة لمرض السكري من النوع 2 (T2D)، ويؤدي إلى إفراز الأنسولين انخفاض وضعف الرقابة، وفي نهاية المطاف موت الخلية بيتا3. يمكن استخدام آليات للمحافظة على أو تحسين وظيفة خلايا بيتا كعلاج ل T2D.

وقد أثبتت الدراسات الآثار المفيدة لتحدث بشكل طبيعي المركبات النباتية في البنكرياس من خلايا بيتا4. قد تكون هذه المركبات تأثيرها من خلال تزايد انتشار الخلايا بيتا، والبقاء على قيد الحياة، أو إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز. على سبيل مثال، أظهرت الدراسات الأخيرة أن يبيكاتيشين أحادي يعزز إفراز الجلوكوز-وحفز الأنسولين من خلال زيادة التنفس المتقدرية وزيادة ATP الخلوية المستويات5. ولذلك، فهم كيف يمكن زيادة هذه المركبات الوظيفية بيتا خلية الإعلام مهم للاستفادة من هذه المركبات كالمداواة المحتملة.

ويمكن قياس التنفس الخلوي من خلال عدد من الأدوات. يسمح استخدام ريسبيروميتير عالية الدقة لمعايرة المغيرون الكيميائية إلى سكان خلية سليمة أو بيرميبيليزيد6. تسمح هذه الأداة إضافة المركبات المختلفة، بتركيزات مختلفة، وبالتالي إعطاء مجموعة واسعة من المعلومات.

ونظرا للعلاقة الحميمة بين الجلوكوز الأيض ووظيفة خلايا بيتا، قياسات التنفس الخلوي الحاسمة. يمكن أن يتم قياس التنفس الخلوي باستخدام خلايا بيتا أما بيرميبيليزيد أو سليمة، مع كل منها مجموعتها الخاصة من مزايا وعيوب7،8. بينما بيرميبيليزيشن خلايا بيتا يسمح أحد لقياس الجوانب المختلفة من سلسلة نقل الإلكترون، يفعل ذلك دون ما يخص إليه لحفز التنفس في الخلية بيتا وامتصاص السكر والايض. ولذلك، استخدام التنفس خلايا بيتا أونبيرميبيليزيد تقنية مفيدة جداً لتحديد استجابة خلايا بيتا لمختلف مستويات السكر، استخدام استهلاك الأوكسجين قراءات.

والغرض من هذا الأسلوب لقياس استهلاك الأوكسجين في وظائف سليمة-1 اشتقاق خلايا بيتا 832/13. هذا الأسلوب يسمح لنا بتحديد استجابة خلايا بيتا لظروف الجلوكوز أونستيمولاتوري (2.5 ملم الجلوكوز) فضلا عن ظروف الجلوكوز تنشيطية (الجلوكوز 16.7 مم). بينما الخلايا أونبيرميبيليزيد لا تسمح لنا لاختبار فردي المجمع الأول أو الثاني أو الثالث من الإلكترون النقل سلسلة، التقنية تسمح مقاييس التعامل مع التنفس تثبيط (أوليجوميسين A)، فصل الرابع معقدة (فككب-الكربونيل السيانيد- 4-فينيلهيدرازوني (تريفلوروميثوكسي))، وتعوق التنفس (أنتيميسين A) تماما. وتوضح هذه الدراسة الكفاءة لقياس التنفس في خلايا بيتا البنكرياس أونبيرميبيليزيد سليمة، فضلا عن تأثير المركبين طبيعيا وأحادي يبيكاتيشين الكركمين، على التنفس خلايا بيتا.

Protocol

1-خلية ثقافة

  1. تستمد الثقافة وظائف-1 832/13 خلايا بيتا في 1640 RPMI تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين-ستربتوميسين، 10 مم هيبيس، 2 مم الجلوتامين 1 مم "بيروفات صوديوم" و 0.05 ملم 2-mercaptoethanol9،10،11 ،،من1213.
  2. إزالة خلايا 832/13 من قارورة T75 استخدام 2 مل من 0.25% التربسين، تفرخ في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تحييد التربسين بإضافة 8 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 كاملة.
  3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع 100 ميليلتر من حجم الخلية من الخطوة 1، 2 في 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  4. كذلك طبق خلايا لوحة 832/13 في كثافة 2 × 106 خلايا/مل في 6.
  5. ثقافة الخلايا ح 48 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية و 5% CO2 قبل بدء تجارب التنفس.

2-إعداد الخلايا ريسبيروميتري عالية الدقة

  1. علاج الخلايا 832/13 مع مونومر يبيكاتيشين المشتقة الكاكاو.
    1. ثقافة الخلايا 832/13 عن 24 ساعة بعد الطلاء في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
    2. تغيير الوسائط ح 24 بعد الطلاء، وعلاج الخلايا 832/13 مع التحكم بالسيارة (3 الآبار) أو 100 نانومتر الكاكاو مونومر (3 الآبار)، تليها الثقافة لإضافية ح 24 (المجموع 48 ح) في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
    3. يغسل خلايا 832/13 في 1 × منخفضة الجلوكوز إفراز الإنزيم المخزن المؤقت (SAB) للمخزن المؤقت أسبيراتي 5 كحد أدنى، واحتضان خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب ح 3، تغيير 1 × الجلوكوز منخفضة صاب كل ساعة.
      1. جعل 10 x SAB مع 33.32 ز من كلوريد الصوديوم، ز 1.73 من بوكل، 0.82 ز خ2ص4، ز 0.7 مجسو4 وإضافة وحدة تخزين نهائي من 500 مل ح2س. تصفية العقيمة بالحل النهائي.
      2. جعل 1 × الجلوكوز منخفضة صاب مع 10 مل 10 × صاب، 100 ميليلتر من السكر بنسبة 45%، 2 مل 1 م حبيس، 1 مل من 0.25 م كاكل2، مل 0.57 من 35% حل جيش صرب البوسنة، ز 0.21 ناكو3 وإضافة ح2س إلى وحدة تخزين نهائي من 100 مل. تصفية العقيمة بالحل النهائي.
  2. علاج الخلايا 832/13 مع الكركمين.
    1. ثقافة الخلايا 832/13 عن 48 ساعة بعد الطلاء في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
    2. يغسل خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب المخزن المؤقت أسبيراتي 5 كحد أدنى، واحتضان خلايا 832/13 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب ح 3، تغيير 1 × الجلوكوز منخفضة صاب كل ساعة.
    3. بعد 2.5 ح الاحتضان ح 3 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب، نضح المخزن المؤقت واحتضان خلايا في 1 x "صاب الجلوكوز منخفضة" مع التحكم بالسيارة أو 40 ميكرومتر الكركمين لمدة 30 دقيقة. وبعد الحضانة، نضح المخزن المؤقت.
  3. حصاد الخلايا مع التربسين ريسبيروميتري عالية الدقة
    1. وبعد تفريخ ح 3 في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب، إزالة الخلايا من اللوحة مع 250 ميليلتر من التربسين 0.25% من كل بئر.
    2. دمج الخلايا في التربسين من 3 آبار تعامل مع التحكم بالسيارة أو مجمع للفائدة مع 4 مل الديوان في أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع 100 ميليلتر من حجم الخلية من الخطوة 2.3.2 في 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
    4. إضعاف العدد المناسب من الخلايا في 1 × الجلوكوز منخفضة صاب جعل 3 مل بتركيز مناسب لكل دائرة. البيانات يوضح أن بتركيز 1 × 106 خلايا/مل هو الأكثر فعالية.
  4. حصاد الخلايا مع تفكك ميكانيكية ريسبيروميتري عالية الدقة
    1. بعد الاحتضان ح 3 في 1 x إضافة الجلوكوز منخفضة الديوان، 1 مل من 1 x "صاب الجلوكوز منخفضة" لكل جيدا لطف ضربة الخلايا خارج اللوحة مع تفكك الميكانيكية التي بيبيتينج مع تلميح ماصة 1000 ميليلتر.
    2. دمج الخلايا من 3 آبار تعامل مع التحكم بالسيارة أو المركبة من اهتمام بما مجموعة 3 مل صاب في أنبوب مخروطي 15 مل للتنفس.

3-عالية الدقة ريسبيروميتري

  1. إعداد ريسبيروميتير عالية الدقة.
    1. قم بتشغيل ريسبيروميتير عالية الدقة، والاتصال بسطح المكتب بإطلاق برنامج التحليل ريسبيروميتير.
    2. نضح الإيثانول 70% من كلا المجلسين. امتصاص هذه الدوائر في الإيثانول 70% على الأقل من 45 دقيقة.
    3. أغسل دوائر المحكمة مرتين مع الإيثانول 70 ٪، يسفط بعد كل خطوة.
    4. أغسل دوائر ثلاث مرات مع ddH2س، يسفط بعد كل خطوة.
    5. أشطف بلونجيرس الدائرة في ddH2o. وهذا ينظف قبالة الإيثانول المتبقي من بلونجيرس ومن ميناء التيتانيوم.
  2. معايرة أجهزة الاستشعار الأوكسجين بولاروجرافيك.
    1. إضافة 2.4 مل 1 × العازلة "صاب الجلوكوز منخفضة" لكل دائرة أوكسيجراف، إثارة المخزن المؤقت بشكل مستمر باستخدام أشرطة مغناطيسية ضجة في قاعة في 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية مع فاصل زمني لتسجيل البيانات في 2.0 s من خلال الضغط على الزر F7 وفتح علامة التبويب المسمى "نظم". دفع بلونجيرس في كل وسيلة، وثم سحب إلى الإعداد تهوية وجع. السماح للجهاز حجته للحد أدنى من 1 ساعة حتى يتم الحصول على تدفق الأكسجين مستقرة.
    2. تعيين الجهاز في 37 درجة مئوية لمدة التجربة. تعيين الجهد الاستقطاب إلى 800 mV، مع ربح 2 بالضغط على الزر F7 وفتح علامة التبويب المسمى "الأكسجين، O2". حجته أن تركيز الأكسجين صاب المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة على الأقل، بينما التغيير في تركيز الأكسجين مستقر (أقل من 2 pmol/(s*mL)).
    3. وبعد استقرار تركيز الأكسجين، حدد منطقة مستقرة إنشاء خلفية قياس التغيير في تركيز الأكسجين فيه تغيير تركيز الأكسجين.
      1. تحديد منطقة التي تضغط على المفتاح shift، وغادر النقر على الماوس وسحب الماوس عبر المنطقة المحددة. انقر فوق الرسالة المرتبطة بالمنطقة المحددة والتغيير إلى "R1" لتتبع كل، تقابل مع كل من المجلسين.
      2. انقر نقراً مزدوجاً فوق مربع "س2 المعايرة" في أسفل اليسار واليمين زوايا الشاشة، انقر فوق الزر "تحديد علامة" "معايرة الهواء" ك R1 وثم حدد "نسخ إلى الحافظة ومعايرة" لكلا المجلسين.
  3. إعداد تقييم تنفس خلايا بيتا 832/13 في الخطوات 2.1.5 أو 2.2.5.
    1. تحميل 2.4 مل عينة في كل غرفة (غرفة واحدة مع مراقبة المركبات تعامل الخلايا، غرفة واحدة مع الخلايا المعالجة المركبة) في الديوان الجلوكوز منخفضة 1 x تحتفظ 0.5 مل عينة خلية للبروتين كوانتيتيشن بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي (حمض بيسينتشونينيك) في حالة استخدام نهج الانفصال الميكانيكية (التجميد في-20 درجة مئوية للقياس في وقت لاحق).
      1. دفع المكبس بكل وسيلة ونضح حجم المتبقية. تحريك الخلايا باستمرار خلال التجربة في 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لكل الخطوات اللاحقة. جعل علامة بالنقر فوق F4 ووصفت بأنها "خلايا" عندما يتم تحميل عينات.
      2. قياس عينات لمدة 30 دقيقة. بعد استقرار إشارة، حدد منطقة التغيير في تركيز الأكسجين المقابلة لظروف الجلوكوز منخفضة (الجلوكوز 2.5 ملم) كما هو موضح في 3.2.3.
    2. بعد التوصل إلى استقرار إشارة، إضافة ميليلتر 12.5 حل 45% جلوكوز معقمة (16.7 مم تركيز النهائية) في كل دائرة من خلال التيتانيوم تحميل المنفذ باستخدام المحاقن. جعل علامة قياس "الجلوكوز" كما وصفت في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. حدد هذه المنطقة من التغيير في تركيز الأكسجين، كما هو موضح في 3.2.3. هذا هو قراءة جلوكوز 16.7 ملم، ويتوافق مع شروط محفزة7.
    3. بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 ميليلتر من أوليجوميسين 5 مم (2.5 ميكرون نهائي تركيز) في كل دائرة من خلال ميناء التحميل. جعل علامة قياس "أولجا" كما وصفت في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3. A أوليجوميسين يمنع ATP synthase وبالتالي حدوث تدفق الأوكسجين فقط عبر تسرب الإلكترونات وليس الفسفرة7.
    4. بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 مم فككب بزيادات 1 ميليلتر حتى يثبت بمعدل تنفس كحد أقصى. ويمثل هذا التنفس أونكوبليد القصوى. بين 3-4 ميليلتر فككب كافية (1.5-2.0 ميكرون النهائي تركيز) للحث على التنفس أونكوبليد القصوى للخلايا الإضافية-1 832/13. جعل علامة المسمى "فككب" كما هو موضح في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3. فككب عامل يفصل. وهذا يسمح لنا لقياس التنفس أونكوبليد7.
    5. بعد أن يتم التوصل إلى استقرار إشارة إضافة 1 ميليلتر من 5 مم أنتيميسين A (تركيز النهائي 2.5 ميكرومتر) في كل دائرة من خلال ميناء التحميل. جعل علامة المسمى "AntiA" كما هو موضح في 3.3.1 عند إضافة العلاج. إشارة السماح تثبيت وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق الأوكسجين مستقرة. تحديد مجال هذا المنحنى كما هو موضح في 3.2.3.
      ملاحظة: A أنتيميسين يربط ريدكتيز السيتوكروم ج، ويحول دون أكسدة ubiquinone وكتل تنفس جميع. وهذا يسمح لنا التوقف تماما عن التنفس7.
  4. قياس خلايا بيتا 832/13 لتطبيع البروتين التركيز والتنفس.
    1. استخدام 0.5 مل من الإبقاء على تحميل، قياس البروتين العينة باستخدام أسلوب اتفاق التعاون الأساسي13عينة.
    2. قم بتشغيل كل عينة في ثلاث نسخ، دون تمييع، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  5. 832/13 حسابات تنفس خلايا بيتا من الخلايا تريبسينيزيد.
    1. أدخل عدد الخلايا كل استخدام مل في الفحص بالضغط على زر F3 لبرنامج التحليل ريسبيروميتير. تغيير الوحدات لخلايا/مل وأدخل تركيز الخلوية، وتغيير المتوسطة للديوان
    2. حدد خلفية قراءات تطبيع البيانات عن طريق تحديد وإدخال في س2 معايرة النموذج كما هو موضح في 3.2.3.
    3. إجراء تحديدات قراءات من 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، أوليجوميسين، فككب وأنتيميسين كما هو موضح في 3.3.1.
    4. ضمن برنامج التحليل ريسبيروميتير، تصدير قراءات لكل دائرة بعد إدخال تركيز البروتين وتحديد متوسط القيم المناسبة لكل معاملة أثناء قياس التنفس. يتم ذلك عن طريق النقر فوق F2 ومن ثم دفع "نسخ إلى الحافظة وظيفة". يعمل هذا على تصدير البيانات لاستخدامها في برامج التحليل الأخرى. استخدام قيم "س2 المنحدر neg." لإجراء العمليات الحسابية.
    5. تجميع البيانات لتشغيل مستقلة 3-5 من المركبات معاملة الضوابط والمركبات الطبيعية الخلايا المعالجة لتحديد أثر على التنفس الخلوي سليمة من خلايا بيتا 1 وظائف 832/13.
  6. 832/13 حسابات تنفس خلايا بيتا من ميكانيكيا تنفصل الخلايا.
    1. أدخل حسابات البروتين من مقايسة اتفاق التعاون الأساسي بالضغط على زر F3 لبرنامج التحليل ريسبيروميتير. تغيير الوحدات بملغ وأدخل تركيز اتفاق التعاون الأساسي وتغيير المتوسطة للديوان
    2. حدد خلفية قراءات تطبيع البيانات عن طريق تحديد وإدخال في س2 معايرة النموذج كما هو موضح في 3.2.3.
    3. إجراء تحديدات قراءات من 2.5 ملم الجلوكوز، 16.7 مم الجلوكوز، أوليجوميسين، فككب وأنتيميسين كما هو موضح في 3.3.1.
    4. ضمن برنامج التحليل ريسبيروميتير، تصدير قراءات لكل دائرة بعد إدخال تركيز البروتين وتحديد متوسط القيم المناسبة لكل معاملة أثناء قياس التنفس. يتم ذلك عن طريق النقر فوق F2 ومن ثم دفع "نسخ إلى الحافظة وظيفة". يعمل هذا على تصدير البيانات لاستخدامها في برامج التحليل الأخرى. استخدام قيم "س2 المنحدر neg." لإجراء العمليات الحسابية.
    5. تجميع البيانات لتشغيل مستقلة 3-5 من المركبات معاملة الضوابط والمركبات الطبيعية الخلايا المعالجة لتحديد أثر على التنفس الخلوي سليمة من خلايا بيتا 1 وظائف 832/13.

النتائج

خلايا بيتا 1 وظائف 832/13 التي أعدت وتحصد كما هو موضح في البروتوكول سوف تثبت التحوير في استهلاك الأكسجين استناداً إلى مختلف التدخلات الكيميائية (الشكل 1A). سوف يلاحظ زيادة في التنفس عندما يتم زيادة تركيز الجلوكوز إلى 16.7 مم الجلوكوز (الشكل 1B). تنفس ستنخفض عندما تع...

Discussion

والهدف من هذا البروتوكول استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس معدلات الالتهاب الرئوي في خلايا بيتا البنكرياس سليمة. هذا الأسلوب يسمح بقياس استجابة خلايا بيتا لمستويات السكر زيادة. كما يسمح البروتوكول للمعالجة بالمركبات المختلفة، كما هو موضح في هذا البروتوكول بتحدث ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر أعضاء مختبرات تسم وهانكوك لمساعد والمناقشة العلمية. يشكر المؤلفون أندرو نيلسون، دكتوراه (جامعة فرجينيا للتكنولوجيا) لتوفير جزء مركب يبيكاتيشين المشتقة الكاكاو. وأيد هذه الدراسة منحة من مؤسسة التعليم والسكري إجراء البحوث إلى JST.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
O2k Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 ProgramOroboros Instruments27141-01Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell lineDuke University Medical CenterNONEBeta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
CurcuminSigmaC7727Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomerVirginia Polytechnic Institute and State UniversityNONEPre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
TrypsinSigmaT4049For cell culture
RPMI-1640SigmaR8758832/13 beta cell media
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycinSigmaP4458832/13 beta cell media component
HEPESSigmaH3662832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
GlutamineCaissonGLL01832/13 beta cell media component
Sodium PyruvateSigmaS8636832/13 beta cell media component
2-MercaptoethanolSigmaM3148832/13 beta cell media component
NaClFisherS271Component of 10x SAB buffer
KClSigmaP9541Component of 10x SAB buffer
KH2PO4SigmaP5655Component of 10x SAB buffer
MgSO4SigmaM2643Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose SolutionSigmaG8769Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2SigmaC5670Component of 1x SAB buffer
35% BSA SolutionSigmaA7979Component of 1x SAB buffer
NaHCO3SigmaS5761Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanolSigma459844Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin ASigmaO4876Chemicals for respiration assay
FCCPSigmaC2920Chemicals for respiration assay
Anitmycin ASigmaA8674Chemicals for respiration assay
BCA Protein KitThermo Fisher23225For determining protein concentration

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved