고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

요약

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

초록

고해상도 respirometry 고립 된 미토 콘 드리 아, 세포와 조직에의 산소 소비량의 측정에 대 한 수 있습니다. 베타 세포는 높은 포도 당 농도에 대 한 응답에서 인슐린 분 비를 통해 통제 혈액 포도 당 수준에 의해 신체에 중요 한 역할을 한다. 인슐린 분 비는 포도 당 대사 및 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 제어 됩니다. 따라서, 본래 베타 세포 호흡 측정 당뇨병을 위한 치료로 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있을 필수적 이다. 그대로 832/13 기능-1을 사용 하 여 우리 세포 호흡에 포도 당 농도 증가의 효과 측정할 수 있는 베타 세포 파생. 이 프로토콜의 효과 결정 하는 하나를 수 있도록 다양 한 화합물의 유무에서 베타 세포 호흡 측정 수 있습니다 화합물 그대로 세포 호흡에 주어진. 여기 우리가 (2.5 m m) 낮은 또는 높은 혈당 (16.7 m m) 존재에서 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 보여줍니다. 이 기술은 다른 포도 당 농도 면 전에 서 그대로 베타 세포 호흡에 다양 한 화합물의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서문

췌 장 베타 세포의 주된 목적은 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 시스템 normoglycemia를 유지 하는 것입니다. 베타 세포 느낄 회람 포도 당 크게 낮은 선호도, 고용량 포도 당 운송업 자 GLUT2 때문에 생리 적 변화 (포도 당 운송업 자 2, K_m 16.7 m m)¹. 순환 포도 당 수준을 증가,이 높은-용량 낮은 선호도 전송 셀 내에 베타 세포내 포도 당에 있는 비례 증가 촉진 합니다. 포도 당 분해, TCA 사이클 (tricarboxylic 산 주기) 및 높은 세포질 ATP (아데노신 3 인산 염) 수준에서 발생 하는 미토 콘 드리 아 호흡 대사입니다. 높은 ATP 농도 ATP 민감한 K⁺ 채널, 막 도발은 결과 차단 합니다. 막 도발은 전압 Ca^{2 +} 채널 개방 원인과 기의 후속 릴리스 바인딩된 인슐린과 립². 베타 세포 기능 장애 제 2 형 당뇨병 (T2D), 각 인 이며, 감소 하 고 가난 하 게 통제 하는 인슐린 분 비 및 궁극적으로 베타 세포 죽음³. 유지 하거나 베타 세포 기능을 개선 하는 메커니즘 T2D에 대 한 치료로 사용 될 수 있습니다.

학문은 자연스럽 게 발생의 유익한 효과 설명 했다 췌 장 beta 세포⁴공장 기반 화합물. 이 화합물은 증가 베타 세포 증식, 생존, 또는 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 그들의 효과 할 수 있습니다. 예를 들어, 최근 연구는 단위체 epicatechin 미토 콘 드리 아 호흡 증가 통해 포도 당 자극 인슐린 분 비를 강화 하 고⁵레벨 셀룰러 ATP를 증가 증명 하고있다. 따라서, 이러한 화합물 기능 베타 셀을 어떻게 증가할 수 있는지 이해 질량 잠재적인 치료로 이러한 화합물을 활용 하는 것이 중요 하다.

세포 호흡은 여러 가지 도구를 통해 측정할 수 있습니다. 고해상도 respirometer의 사용 permeabilized 또는 그대로 셀 인구⁶화학 변조기의 적정에 대 한 수 있습니다. 이 도구에 따라서 다양 한 정보를 제공 하는 다양 한 농도, 다양 한 화합물의 추가 허용 합니다.

포도 당 대사 및 베타 세포 기능 사이 친밀 한 연결을 감안할 때, 세포 호흡의 측정은 중요 합니다. 세포 호흡의 측정을 수행할 수 있습니다 갖는 각 고유한 장점과 단점^7,8permeabilized 또는 그대로 베타 세포를 사용 하 여. 베타 세포의 permeabilization 전자 전송 체인의 다양 한 측면을 측정 한 수, 하는 동안 그것은 beta 세포 포도 당 통풍 관, 신진 대사 호흡을 유도 하는 메커니즘에 관계 없이 이렇게 한다. 따라서, unpermeabilized 베타 세포 호흡의 사용 다양 한 포도 당 수준, 판독으로 산소 소비를 사용 하 여 베타 세포 응답을 결정 하는 매우 유용한 기술입니다.

이 기법의 목적은 그대로 기능-1에서 산소 소비량을 측정 하 832/13 베타 세포 파생입니다. 이 기술은 수 있습니다 unstimulatory 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 대 한 베타 세포의 응답 결정 물질로 포도 당 조건 (16.7 m m 포도 당) 뿐만 아니라. Unpermeabilized 셀 개별적으로 복잡 한 테스트를 허용 하지 않는 하는 동안 I, II 또는 III의 전자 수송 체인, 기술을 다루는 복잡 한 IV 억제 (Oligomycin A) 상태로 호흡 (FCCP 카보닐기 시안-측정 허용 않는다 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), 호흡 (Antimycin A) 완전히 저해. 이 연구에서는 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 뿐 아니라 그대로 unpermeabilized 췌 장 베타 세포, 호흡 측정의 효능을 보여 줍니다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 문화 기능-1 파생 832/13 베타 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스, 10 mM HEPES, 2mm 글루타민, 1 mM 나트륨 Pyruvate, 0.05 m m 2-mercaptoethanol^{9,10,11 보충 RPMI 1640 ,,1213}.
2. 완전 한 RPMI 1640 미디어의 8 mL을 추가 하 여 10 분 중화 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하는 0.25 %trypsin 2 개 mL를 사용 하 여 T75 플라스 크에서 832/13 셀을 제거 합니다.
3. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 1.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.
4. 2 x 10⁶ 6에서 셀/mL의 조밀도에 접시 832/13 셀 잘 요리.
5. 호흡 실험을 시작 하기 전에 셀에서 37 ° C, 5% CO₂ 습도 인큐베이터에서 48 h에 대 한 문화.

2입니다. 고해상도 Respirometry에 대 한 셀의 준비

1. 코코아 파생된 epicatechin 단위체와 832/13 세포 치료.
   1. 37 ° C, 5% CO₂습도 인큐베이터에서 도금 후 24 h에 대 한 832/13 셀 문화.
   2. 도금, 후 미디어 24 h 변경 하 고 차량 통제 (3 정) 또는 100 nM 코코아 단위체 (3 정), 37 ° C, 5% CO₂습도 인큐베이터에는 추가적인 24 h (총 48 h)에 대 한 문화 뒤 832/13 세포 치료.
   3. 낮은 포도 당 분 비 분석 결과 버퍼 (SAB) 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 x 1에 832/13 세포를 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.
      1. 게 10 x SAB 33.32 g의 NaCl, KCl, KH₂포₄, MgSO₄ 의 0.7 g의 0.82 g 1.73 g H₂O 500 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.
      2. 만들기 1 낮은 포도 SAB SAB, 100 µ L의 45% 포도 당, 1 M HEPES, 1 mL의 2 mL x 10의 10 mL와 함께 x 0.25 M CaCl₂, 35 %BSA 솔루션, NaHCO₃ 의 0.21 g의 0.57 mL의 H₂O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.
2. Curcumin와 832/13 세포 치료.
   1. 37 ° C, 5% CO₂습도 인큐베이터에서 도금 후 48 h에 대 한 832/13 셀 문화.
   2. 832/13 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 있는 셀을 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.
   3. 낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 외피의 2.5 h, 후 버퍼를 발음 하 고 낮은 포도 당 SAB 차량 제어 또는 30 분 동안 40 µ M curcumin x 1에 있는 셀을 품 어. 부 화, 다음 버퍼 발음.
3. 수확 하는 고해상도 respirometry에 대 한 트립 신 셀
   1. 낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 부 화 후 잘 당 0.25 %trypsin 250 µ L로 접시에서 셀을 제거 합니다.
   2. 차량 제어 또는 15 mL 원뿔 튜브에 SAB의 4 mL와의 복합 치료 3 우물에서 트립 신에 셀 결합.
   3. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 2.3.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.
   4. 낮은 포도 SAB 각 챔버에 대 한 적절 한 농도에서 3 mL을 x 1에 있는 셀의 적절 한 수를 희석. 데이터 1 x 10⁶ 셀/mL의 농도 가장 효과적인 방법을 보여 줍니다.
4. 고해상도 respirometry에 대 한 기계적 분리 된 세포를 수확
   1. 1 x에서 3 h 부 화 후 낮은 포도 SAB, 1 x 각 낮은 포도 당 SAB 잘하고 부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 기계적 분리와 접시에서 셀 타격의 1 mL를 추가 합니다.
   2. 차량 통제로 또는 호흡에 대 한 15 mL 원뿔 튜브 3 mL SAB의 총에 대 한 관심의 복합 치료 3 우물에서 세포를 결합 한다.

3. 고해상도 Respirometry

1. 고해상도 respirometer의 준비입니다.
   1. 켜고 고해상도 respirometer respirometer 분석 프로그램을 실행 하 여 바탕 화면에 연결.
   2. 두 약 실 전부에서 70% 에탄올 발음 이 약 실은 45 분의 최소 70% 에탄올에 담근 다.
   3. 각 단계 후 발음 70% 에탄올으로 두 번 챔버 세척.
   4. DdH₂O, 각 단계 후 발음과 세 번 챔버 세척.
   5. DdH₂오 챔버 plungers 린스 이 plungers와 티타늄 포트에서 잔여 에탄올을 정리합니다.
2. Polarographic 산소 센서의 구경 측정입니다.
   1. 지속적으로 사용 하 여 자기 볶음 바 데이터 기록 간격 750 rpm 고 37 ° C에서 약 실에 있는 2.0에서 버퍼를 교 반 각 oxygraph 챔버에 낮은 포도 당 SAB 버퍼 x 1의 2.4 mL을 추가 F7 버튼을 탭 열기 s 분류 "시스템". Plungers를 밀어 모든 방법에서 후 렌치 폭 설정에 철회 하 고. 안정적인 산소 유량을 얻을 때까지 1 시간 최소 equilibrate 기계를 하자.
   2. 37 ° C에 실험의 기간에 대 한 기계를 설정 합니다. 800 분극 전압 설정 F7 버튼을 "산소, O_2"탭을 열고 2의 이득을 mV. 산소 농도 변화는 안정 되어 있는 하는 동안 적어도 30 분 동안 SAB 버퍼의 산소 농도 equilibrate (2 pmol/(s*mL)).
   3. 산소 농도 안정화에 따라 산소 농도의 변화는 안정 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정 하는 영역을 선택 합니다.
      1. Shift 키를 누른 다, 왼쪽 마우스를 클릭 하 고 선택된 영역에서 마우스를 드래그 하 여 영역을 선택 합니다. 두 챔버의 각각에 해당 하는 각 추적에 대 한 선택한 지역 및 변경 "r1"와 관련 된 문자를 클릭 하십시오.
      2. 왼쪽 하단에 있는 "O₂ 교정" 상자를 두 번 클릭 하 고 스크린의 모서리를 마우스 오른쪽, r 1으로 "공기 교정"에 대 한 "선택 표시" 버튼을 클릭 고 두 약 실 전부에 대 한 "보정 하 고 클립보드에 복사"를 선택 합니다.
3. 2.1.5 또는 2.2.5 832/13 베타 세포의 호흡의 평가 단계에서 준비.
   1. 1 x 낮은 포도 당 SAB.에 각 약 실 (한 실 제어 차량 취급 셀, 복합 치료 세포 한 챔버)에 샘플의 2.4 mL 로드 기계적 분리 방식 (-20 ° C에서 측정 후 동결)를 사용 하 여 경우 BCA (Bicinchoninic 산) 분석 결과 의해 단백질 정량에 대 한 셀 샘플의 0.5 mL를 유지 합니다.
      1. 모든 방법으로 플런저를 밀어 하 고 잔류 볼륨 발음. 750 rpm 및 모든 후속 단계에 대 한 37 ° C에서 실험을 통해 지속적으로 세포를 저 어. F 4를 클릭 하 여 샘플 로드 되 면 "세포"로 라벨 표시를 확인 합니다.
      2. 30 분에 대 한 샘플을 측정 합니다. 신호 안정화 후 3.2.3에 설명 된 대로 낮은 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 해당 하는 산소 농도 변화의 영역을 선택 합니다.
   2. 신호 안정화에 도달 하면 주사기를 사용 하 여 포트 로드 티타늄 통해 각 챔버에 45% 살 균 포도 당 솔루션 (16.7 m m 최종 농도)의 12.5 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 치료 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "포도". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 산소 농도 변화는이 영역을 선택 합니다. 이것은 16.7 m m 포도 당 독서 하 고 물질로 조건⁷해당 합니다.
   3. 신호 안정화에 도달 하면 5mm oligomycin (2.5 최종 농도) 각 챔버로 로딩 포트를 통해의 1 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "OligoA". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. Oligomycin A 억제 ATP synthase 이며 따라서 발생 하는 유일한 산소 유량 전자와 아닌 산화 인 산화⁷의 누설을 통해.
   4. 신호 안정화에 도달 하면 최대 호흡 율 설정 될 때까지 1 µ L 단위로 1mm FCCP 추가 합니다. 이 최대한 uncoupled 호흡을 나타냅니다. 3-4 µ L 사이 FCCP 충분 한 (1.5-2.0 µ M 최종 농도) 기능-1 832/13 셀의 최대 uncoupled 호흡을 유도 하는 것 이다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "FCCP" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. FCCP 연결을 푸는 에이전트입니다. 이 uncoupled 호흡⁷을 측정할 수 있습니다.
   5. 신호 안정화에 도달 하면 로드 포트를 통해 각 실에 1 µ L 5mm Antimycin A (2.5 최종 농도)를 추가 합니다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "AntiA" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다.
      참고: Antimycin A 시 토 크롬 C 환 원 효소, ubiquinone 산화를 억제 한다 모든 호흡을 차단. 호흡⁷을 완전히 막을 수 있습니다.
4. 832/13 베타 세포 단백질 농도 호흡 정규화에 대 한 측정.
   1. 샘플 측정 단백질 샘플¹³BCA 메서드 사용 하 여 로드 시 유지의 0.5 mL를 사용 하 여.
   2. 제조업체의 지침에 따라 희석 하지 않고 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.
5. trypsinized 셀에서 832/13 베타 세포 호흡 계산.
   1. Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 분석 결과에 mL 사용 당 셀의 수를 입력 합니다. 단위 셀/mL를 변경 세포 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경
   2. 선택 하 고 O₂ 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.
   3. 2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.
   4. Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O₂ 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.
   5. 자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.
6. 832/13 베타 세포 호흡 계산에서 기계적으로 해리 셀.
   1. Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 BCA 분석 결과에서 단백질 계산을 입력 합니다. 밀리 그램 단위 변경, BCA 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경
   2. 선택 하 고 O₂ 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.
   3. 2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.
   4. Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O₂ 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.
   5. 자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.

결과

기능 1 832/13 베타 세포 준비 프로토콜에 설명 된 대로 수확을 다양 한 화학 개입 (그림 1A)에 따라 산소 소비에 변조를 시연할 예정 이다. 호흡 증가 16.7 mM 포도 (그림 1B)에 포도 당 농도 증가 때 관찰 됩니다. 호흡은 그대로 셀 Oligomycin a 치료는 줄어 이 호흡은 기저, nonphosphorylating 호흡기 상태로 정의 되는 누설으로 알려져 있다. 최대한 호흡 때 베타 세포 ...

토론

이 프로토콜의 목적은 그대로 췌 장 베타 세포에서 호흡 속도 측정에 고해상도 respirometry를 사용 하는 것입니다. 이 메서드는 증가 된 포도 당 수준으로 베타 세포 반응의 측정을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연스럽 게 발생 단위체 epicatechin 또는 curcumin^4,5에서 같이 프로토콜 또한 다양 한 화합물과 전처리에 대 한 수 있습니다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
O2k Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program	Oroboros Instruments	27141-01	Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line	Duke University Medical Center	NONE	Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin	Sigma	C7727	Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer	Virginia Polytechnic Institute and State University	NONE	Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin	Sigma	T4049	For cell culture
RPMI-1640	Sigma	R8758	832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4458	832/13 beta cell media component
HEPES	Sigma	H3662	832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine	Caisson	GLL01	832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636	832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148	832/13 beta cell media component
NaCl	Fisher	S271	Component of 10x SAB buffer
KCl	Sigma	P9541	Component of 10x SAB buffer
KH2PO4	Sigma	P5655	Component of 10x SAB buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution	Sigma	G8769	Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2	Sigma	C5670	Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution	Sigma	A7979	Component of 1x SAB buffer
NaHCO3	Sigma	S5761	Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol	Sigma	459844	Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A	Sigma	O4876	Chemicals for respiration assay
FCCP	Sigma	C2920	Chemicals for respiration assay
Anitmycin A	Sigma	A8674	Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit	Thermo Fisher	23225	For determining protein concentration