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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Resumen

Respirometría de alta resolución permite la medición de consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas, células y tejidos. Las células beta juega un papel fundamental en el cuerpo por controlar niveles de glucosa en sangre a través de la secreción de insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa elevada. La secreción de insulina es controlada por la respiración mitocondrial y el metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, medir respiración intacta de la célula beta es esencial para poder mejorar la función de célula beta como tratamiento para la diabetes. Con intacto 832/13 INS-1 derivados de las células beta podemos medir el efecto de aumentar la concentración de glucosa en la respiración celular. Este protocolo nos permite medir la respiración de la célula beta en la presencia o ausencia de diferentes compuestos, que le permitirán determinar el efecto de dar compuestos sobre la respiración de la célula intacta. Aquí se demuestra el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta bajo la presencia de condiciones de alta glucosa (16,7 mM) o baja (2,5 mM). Esta técnica puede utilizarse para determinar el efecto de diversos compuestos sobre la respiración de la célula beta intacta en presencia de diferentes concentraciones de glucosa.

Introducción

El propósito principal de la célula beta pancreática es mantener sistema normoglycemia a través de la secreción de insulina estimulada por glucosa. Las células beta detecta cambios fisiológicos en la circulación de la glucosa en gran parte debido a la baja afinidad, transportador de glucosa de alta capacidad GLUT2 (glucosa transportador 2, Km 16,7 mM)1. Al aumentar los niveles de glucosa circulatoria, este transportador de baja afinidad alta capacidad facilita un aumento proporcional de la glucosa intracelular dentro de la célula beta. La glucosa se metaboliza a través de la glucólisis, el ciclo TCA (ciclo del ácido tricarboxílico) y respiración mitocondrial que resulta en elevados niveles celulares de ATP (trifosfato de adenosina). La concentración elevada de ATP bloquea los canales de ATP sensibles K+ , dando por resultado la despolarización de la membrana. Despolarización de la membrana provoca la apertura de canales de Ca2 + voltaje cerrada y posterior liberación de la vesícula obligado de gránulos de insulina2. Disfunción de célula beta es un sello de la Diabetes tipo 2 (T2D) y resulta en la secreción de insulina disminuida y mal controlada y en última instancia de la muerte de la célula beta3. Mecanismos que mantengan o mejoran la función de célula beta podrían ser utilizados como un tratamiento para T2D.

Los estudios han demostrado los efectos beneficiosos de origen natural compuestos a base de plantas en la célula beta pancreática4. Estos compuestos pueden tener su efecto a través de la creciente proliferación de la célula beta, la supervivencia o la secreción de insulina estimulada por glucosa. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que la antocianina monomérica aumenta la secreción de insulina estimulada por glucosa mediante el aumento de la respiración mitocondrial y aumento de ATP celular niveles5. Por lo tanto, entender cómo estos compuestos pueden aumentar la célula beta funcional masa es importante aprovechar estos compuestos como terapéutica potencial.

Respiración celular puede medirse a través de una serie de herramientas. Uso de un respirómetro alta resolución permite la titulación de moduladores químicos a una población celular permeabilized o intacto del6. Esta herramienta permite la adición de compuestos diversos, a diferentes concentraciones, dando así una amplia gama de información.

Dada la íntima conexión entre metabolismo de la glucosa y la función de células beta, las mediciones de la respiración celular son críticas. Las mediciones de la respiración celular se pueden hacer con que las células beta permeabilized o intactas, cada uno con su propio conjunto de ventajas y desventajas de7,8. Mientras que la permeabilización de las células beta permite medir diferentes aspectos de la cadena de transporte de electrones, lo hace sin respeto al mecanismo para inducir la respiración en la célula beta, la absorción de la glucosa y el metabolismo. Por lo tanto, el uso de la respiración de la célula beta unpermeabilized es una técnica muy útil para determinar la respuesta de las células beta a diversos niveles de la glucosa, utilizando el consumo de oxígeno como la lectura.

El propósito de esta técnica es medir consumo de oxígeno intactas INS-1 derivados de las células beta 832/13. Esta técnica nos permite determinar la respuesta de las células beta a las condiciones unstimulatory de la glucosa (glucosa 2,5 mM) así como de las condiciones estimulantes glucosa (16,7 mM de glucosa). Mientras que las células unpermeabilized no nos permiten probar individualmente complejo I, II o III del electrón transporte de cadena, la técnica de permitir mediciones con respiración de inhibición (Oligomycin A), desacoplada IV complejo (FCCP-carbonilo cianuro- 4- phenylhydrazone (de trifluoromethoxy)) y totalmente inhibida (Antimycin A) la respiración. Este estudio demuestra la eficacia de la medición de la respiración en intactas unpermeabilized las células beta pancreáticas, así como el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta.

Protocolo

1. cultivo celular

  1. Derivado de la cultura INS-1 832/13 beta células en RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina de 1%, 10 mM HEPES, 2 mM glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0.05 mM de 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.
  2. Eliminar las células 832/13 un frasco T75 utilizando 2 mL de tripsina 0.25%, incubar a 37 ° C por 10 minutos neutralizar tripsina mediante la adición de 8 mL de Medio RPMI 1640 completo.
  3. Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 1.2 en 900 μl de PBS.
  4. Las células de la placa 832/13 con una densidad de 2 x 106 células/mL en 6 plato bien.
  5. Células en cultivo durante 48 h en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 antes de comenzar los experimentos de respiración.

2. preparación de células de alta resolución respirometría

  1. Tratamiento de las células de 832/13 con monómero epicatequina derivados cacao.
    1. La cultura 832/13 células durante 24 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Cambiar medios de 24 h después de la galjanoplastia y tratar células 832/13 con control del vehículo (3 pozos) o monómero de nM cacao 100 (3 pozos), seguido por la cultura para un adicional 24 h (48 h en total) en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    3. Lavar las células 832/13 en 1 x baja glucosa secreción tampón de ensayo (SAB) para 5 minutos aspirado buffer e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.
      1. Hacer 10 x SAB con 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0.7 g de MgSO4 y H2O a un volumen final de 500 mL. Filtro estéril la solución final.
      2. Hacer 1 x glucosa baja SAB con 10 mL de 10 x SAB, 100 μl de glucosa 45%, 2 mL de HEPES, 1 mL de 1 M de 0.25M CaCl2, 0,57 mL de solución de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 y H2O a un volumen final de 100 mL. Filtro estéril la solución final.
  2. Tratamiento de células 832/13 con curcumina.
    1. La cultura 832/13 células durante 48 h después de la siembra en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Lavar las células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB para el tampón de aspirado de 5 minutos e incubar células 832/13 en 1 x glucosa baja SAB 3 h, cambio 1 x glucosa baja SAB cada hora.
    3. Después de 2,5 h de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, Aspire buffer e incubar las células en 1 x baja glucosa SAB con control del vehículo o 40 μm curcumina durante 30 minutos. Tras la incubación, aspirar el búfer.
  3. Recolección de células con tripsina de respirometría de alta resolución
    1. Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, extraer las células de la placa con 250 μl de tripsina 0.25% por pozo.
    2. Combinar las celdas de tripsina de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés con 4 mL de SAB en un tubo cónico de 15 mL.
    3. Contar las células usando un hemocitómetro y diluir 100 μl del volumen celular de paso 2.3.2 en 900 μl de PBS.
    4. Diluir el número apropiado de células en 1 x glucosa baja SAB hacer 3 mL en la concentración adecuada para cada cámara. Los datos demuestran que una concentración de 1 x 106 células/mL es el más eficaz.
  4. Recolección de células con disociación mecánica de respirometría de alta resolución
    1. Después de la 3 h de incubación en 1 x glucosa baja SAB, añadir 1 mL de 1 x baja glucosa SAB a cada bien y suavemente soplar las células de la placa con la disociación mecánica mediante pipeteo con una pipeta de 1000 μl.
    2. Combinar las celdas de 3 pozos tratados con control del vehículo o el compuesto de interés en un total de 3 mL SAB en un tubo cónico de 15 mL para la respiración.

3. alta resolución respirometría

  1. Preparación de la alta resolución respirómetro.
    1. Encienda el respirómetro de alta resolución y conectar al escritorio con el lanzamiento del programa de análisis del respirómetro.
    2. Aspire el etanol al 70% de ambas cámaras. Disfrutar de estas cámaras en etanol al 70% durante un mínimo de 45 minutos.
    3. Lavar las cámaras dos veces con etanol al 70%, aspirar después de cada paso.
    4. Lavar las cámaras tres veces con ddH2O, aspirando después de cada paso.
    5. Enjuague los émbolos de cámara en el ddH2O. Esto limpia de etanol residual de los émbolos y desde el puerto de titanio.
  2. Calibración de sensores de oxígeno polarográfico.
    1. Añadir a cada cámara oxygraph, revolviendo el búfer continuamente por medio de barras de agitación magnética en la cámara a 750 rpm y 37 ° C con un intervalo de registro de datos en 2.0 2,4 mL de 1 x buffer de baja glucosa SAB s pulsando la tecla F7 y abriendo la pestaña con la etiqueta "Sistemas". Empujar los émbolos en y luego retraerse a la posición de aireación de la llave. Deje que la máquina equilibrar por un mínimo de 1 hora hasta que se obtiene el flujo de oxígeno estable.
    2. Coloque la máquina a 37 ° C durante la duración del experimento. Ajustar la tensión de polarización a 800 mV, con una ganancia de 2 pulsando la tecla F7 y abriendo la ficha marcada "Oxígeno, O2". Equilibrar la concentración de oxígeno del búfer SAB durante al menos 30 minutos, mientras que el cambio en la concentración de oxígeno es estable (menos de 2 pmol/(s*mL)).
    3. Tras la estabilización de la concentración de oxígeno, seleccionar una región donde el cambio de concentración de oxígeno es estable para establecer la medida de fondo de cambio en la concentración de oxígeno.
      1. Seleccione una región pulsando la tecla shift, click izquierdo del mouse y arrastrando el ratón a través de la región seleccionada. Haga clic en la letra asociada con la región seleccionada y el cambio a "R1" para cada rastro, correspondiente con cada una de las dos cámaras.
      2. Haga doble clic en el cuadro "O2 calibración" en la parte inferior izquierda y esquinas de la pantalla a la derecha, haga clic en el botón "select marca" para la "calibración de aire" como R1 y luego seleccione "calibrar y copiar al portapapeles" para ambas cámaras.
  3. Evaluación de la respiración de las células beta 832/13 había elaborado en pasos 2.1.5 o 2.2.5.
    1. 2,4 mL de muestra en cada cámara (una cámara con control vehículo tratado las células, una cámara con células tratadas compuestas) de la carga en 1 x baja glucosa Sab Conservar 0,5 mL de muestra de células para la cuantificación de proteínas por ensayo BCA (ácido Bicinchoninic) si se utiliza el enfoque de disociación mecánica (congelación a-20 ° C para la medición más adelante).
      1. Empuje el émbolo y aspirar el volumen residual. Remover las células continuamente durante todo el experimento en 750 rpm y 37 ° C durante todos los pasos posteriores. Haga una marca haciendo clic en F4 y etiquetado como "células" cuando se cargan las muestras.
      2. Medir las muestras durante 30 minutos. Después de la estabilización de la señal, seleccione una región del cambio en la concentración de oxígeno correspondiente a las condiciones de baja glucosa (glucosa de 2.5 mM) como se describe en 3.2.3.
    2. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 12,5 μl de una solución de glucosa estéril 45% (concentración final de 16,7 mM) en cada compartimiento a través de titanio puerto utilizando una jeringa de carga. Hacer que una marca de medida "Glucosa", como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione la región del cambio en la concentración de oxígeno, como se describe en 3.2.3. Esta es la lectura de glucosa de 16,7 mM y corresponde con las condiciones de estimulación7.
    3. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de oligomycin 5mM (2,5 μm concentración final) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Hacer que una marca de medida "OligoA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. A Oligomycin inhibe la ATP Sintetasa y por lo tanto el único oxígeno flujo que ocurre es por pérdida de electrones y no de la fosforilación oxidativa7.
    4. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 mM FCCP en incrementos de 1 μl hasta que se establezca una tasa de respiración máxima. Esto representa máxima respiración desacoplada. Entre 3-4 μL FCCP es suficiente (1.5-2.0 μm concentración final) para inducir la respiración desacoplada máxima de células de INS-1 832/13. Haga una marca con la etiqueta "FCCP" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3. FCCP es un agente Desacoplador. Esto nos permite medir respiración desacoplada7.
    5. Después de alcanza la estabilización de la señal, añadir 1 μl de 5 mM antimicina A (concentración final de 2.5 μm) en cada compartimiento a través del puerto de carga. Haga una marca con la etiqueta "AntiA" como se describe en 3.3.1 cuando se agrega tratamiento. Señal que estabilizar y registrar respiración celular hasta que se logra un flujo de oxígeno estable. Seleccione esta área de la curva como se describe en 3.2.3.
      Nota: Antimycin A une citocromo C reductasa inhibe la oxidación de la ubiquinona y bloquea la respiración de todos. Esto nos permite parar completamente la respiración7.
  4. Medición de las células beta de 832/13 para la normalización de la proteína concentración y respiración.
    1. Usando 0.5ml de muestra retenida en el cargamento, muestra de proteína medida usando el método BCA13.
    2. Ejecute cada muestra por triplicado, sin dilución, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. 832/13 cálculos de respiración de la célula beta de células tripsinizaron.
    1. Introduzca el número de células por mL uso en el ensayo pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a células/mL, introducir la concentración celular y cambiar el medio Sab a
    2. Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.
    3. Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.
    4. Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.
    5. Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.
  6. 832/13 cálculos de respiración de la célula beta de disociaron mecánicamente las células.
    1. Entrar en los cálculos de proteína desde el ensayo BCA pulsando la tecla F3 del programa de análisis del respirómetro. Cambiar las unidades a mg, entrar en la concentración de BCA y cambiar el medio Sab a
    2. Seleccionar lecturas de fondo para normalizar los datos seleccionando y entrar en el O2 forma de calibración como se describe en 3.2.3.
    3. Hacer selecciones de lecturas de 2,5 mM glucosa, 16,7 mM de glucosa, A Oligomycin, FCCP y Antimycin A como se describe en 3.3.1.
    4. Dentro del programa de análisis del respirómetro, exportar las lecturas para cada cámara después de entrar en la concentración de proteína y seleccionando los valores medios apropiados para cada tratamiento durante la medición de la respiración. Esto se hace haciendo clic en F2 y luego empuja la "copia a la función de Portapapeles". Exporta los datos para su uso en otros programas de análisis. Utilice los valores "O2 cuesta neg." para los cálculos.
    5. Compilar datos para 3-5 funciona independiente del vehículo tratado controles y naturales compuestos de células tratadas para determinar el efecto sobre intacto respiración celular de las células beta INS-1 832/13.

Resultados

INS-1 832/13 beta células que son preparadas y cosecha como se describe en el protocolo de demostrará la modulación en el consumo de oxígeno, basado en las diversas intervenciones químicas (figura 1A). Se observó un aumento en la respiración cuando la concentración de glucosa se incrementa a 16,7 mM de glucosa (figura 1B). La respiración disminuye cuando se tratan de las células intactas Oligomycin A. Esta respiración se conoce como escape, que se def...

Discusión

El objetivo de este protocolo es utilizar respirometria de alta resolución para medir tasas respiratorias en intacto las células beta pancreáticas. Este método permite la medición de la respuesta de la célula beta a niveles creciente de la glucosa. El protocolo también permite el tratamiento previo con varios compuestos, como se demuestra en el presente Protocolo con el natural monómero epicatequina o curcumina4,5. Tratami...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a miembros de los laboratorios Tessem y Hancock para asistente y discusión científica. Los autores agradecen a Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para proporcionar la fracción de monómero epicatequina derivados cacao. Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de educación y la investigación acción Diabetes al JST.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
O2k Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 ProgramOroboros Instruments27141-01Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell lineDuke University Medical CenterNONEBeta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
CurcuminSigmaC7727Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomerVirginia Polytechnic Institute and State UniversityNONEPre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
TrypsinSigmaT4049For cell culture
RPMI-1640SigmaR8758832/13 beta cell media
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycinSigmaP4458832/13 beta cell media component
HEPESSigmaH3662832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
GlutamineCaissonGLL01832/13 beta cell media component
Sodium PyruvateSigmaS8636832/13 beta cell media component
2-MercaptoethanolSigmaM3148832/13 beta cell media component
NaClFisherS271Component of 10x SAB buffer
KClSigmaP9541Component of 10x SAB buffer
KH2PO4SigmaP5655Component of 10x SAB buffer
MgSO4SigmaM2643Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose SolutionSigmaG8769Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2SigmaC5670Component of 1x SAB buffer
35% BSA SolutionSigmaA7979Component of 1x SAB buffer
NaHCO3SigmaS5761Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanolSigma459844Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin ASigmaO4876Chemicals for respiration assay
FCCPSigmaC2920Chemicals for respiration assay
Anitmycin ASigmaA8674Chemicals for respiration assay
BCA Protein KitThermo Fisher23225For determining protein concentration

Referencias

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