Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.

Abstract

Respirometry ad alta risoluzione consente la misurazione del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, cellule e tessuti. Beta cellule svolgono un ruolo critico nell'organismo di controllo livelli di glucosio nel sangue attraverso la secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio elevato. La secrezione dell'insulina è controllata dal metabolismo del glucosio e la respirazione mitocondriale. Pertanto, respirazione cellulare beta intatto di misurazione è essenziale essere in grado di migliorare la funzione delle cellule beta come un trattamento per il diabete. Utilizzando intatto 832/13 INS-1 derivato beta cellule possiamo misurare l'effetto di aumentare la concentrazione di glucosio sulla respirazione cellulare. Questo protocollo permette di misurare la respirazione cellulare beta in presenza o assenza di vari composti, che permette di determinare l'effetto di composti del giorno respirazione cellulare intatta. Qui dimostriamo l'effetto di due composti naturali, epicatechina monomerica e curcumina, sulla respirazione delle cellule beta in presenza delle condizioni di alto glucosio (16,7 mM) o bassa (2,5 mM). Questa tecnica può essere utilizzata per determinare l'effetto di vari composti sulla respirazione intatto beta cellulare in presenza di diverse concentrazioni di glucosio.

Introduzione

Lo scopo primario della cellula beta pancreatica è di mantenere il sistema normoglycemia attraverso secrezione insulinica glucosio-mediata. Le cellule beta senso cambiamenti fisiologici circolanti di glucosio in gran parte dovuto la bassa affinità, trasportatore di capacità elevata del glucosio GLUT2 (glucosio Transporter 2, K_m 16,7 mM)¹. Come aumento del livello di glucosio circolatorio, questo trasportatore di bassa affinità ad alta capacità facilita un aumento proporzionale intracellulare del glucosio all'interno della cellula beta. Glucosio è metabolizzato attraverso la glicolisi, il ciclo del TCA (ciclo dell'acido tricarbossilico) e la respirazione mitocondriale conseguente elevati livelli cellulari di ATP (adenosina trifosfato). L'elevata concentrazione di ATP blocca i canali ATP sensibili di K⁺ , conseguente depolarizzazione della membrana. La depolarizzazione della membrana provoca l'apertura dei canali del Ca^{2 +} gated tensione e successiva liberazione della vescichetta associato insulina granuli². Disfunzione delle cellule beta è un marchio di garanzia del diabete di tipo 2 (T2D) e provoca la secrezione dell'insulina in diminuzione e scarsamente controllato e in definitiva di morte delle cellule beta³. Meccanismi che mantengono o migliorano la funzione delle cellule beta potrebbero essere usati come trattamento per T2D.

Gli studi hanno dimostrato gli effetti benefici di biofiltri composti basati a pianta sulla beta cellula pancreatica⁴. Questi composti possono avere il loro effetto attraverso la crescente proliferazione delle cellule beta, sopravvivenza o secrezione insulinica glucosio-mediata. Ad esempio, studi recenti hanno dimostrato che l'epicatechina monomerica migliora la secrezione insulinica glucosio-mediata attraverso l'aumento di respirazione mitocondriale e aumento di ATP cellulare livelli⁵. Di conseguenza, di comprendere come questi composti possono aumentare funzionale delle cellule beta massa è importante sfruttare questi composti come terapeutica potenziale.

Respirazione cellulare può essere misurata attraverso una serie di strumenti. Utilizzo di un respirometro ad alta risoluzione permette per la titolazione dei modulatori chimici per una popolazione di cellule permeabilized o intatto⁶. Questo strumento consente l'aggiunta di vari composti, alle concentrazioni differenti, dando così una vasta gamma di informazioni.

Data la stretta connessione tra il metabolismo del glucosio e la funzione delle cellule beta, misure della respirazione cellulare sono critiche. Misure della respirazione cellulare possono essere fatto utilizzando cellule beta o permeabilized che intatte, con ciascuno che ha una propria serie di vantaggi e svantaggi^7,8. Mentre permeabilizzazione delle cellule beta permette di misurare diversi aspetti della catena di trasporto degli elettroni, lo fa senza per quanto riguarda il meccanismo per l'induzione della respirazione nel beta cellulare, l'assorbimento del glucosio e del metabolismo. Pertanto, l'uso della respirazione unpermeabilized beta cellulare è una tecnica molto utile per determinare la risposta di beta cellule a vari livelli di glucosio, utilizzando il consumo di ossigeno come la lettura.

Lo scopo di questa tecnica è di misurare il consumo di ossigeno in intatto INS-1 832/13 beta cellule derivate. Questa tecnica permette di determinare la risposta delle cellule beta al stati unstimulatory del glucosio (glucosio 2,5 mM) così come le condizioni di stimolatori del glucosio (16,7 millimetri di glucosio). Mentre le cellule unpermeabilized non ci permettono di testare individualmente complesso I, II o III dell'elettrone catena di trasporto, la tecnica consentono misurazioni trattare con respirazione di inibizione (Oligomycin A), disgiunto complesso IV (FCCP-Carbonil cianuro- 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) e completamente inibita respirazione (Antimycin A). Questo studio dimostra l'efficacia di respirazione in beta cellule pancreatiche di unpermeabilized intatte, come pure l'effetto di due composti naturali, epicatechina monomerica e curcumina, sulla respirazione cellulare beta di misura.

Protocollo

1. coltura cellulare

1. Cultura INS-1 derivato 832/13 beta cellule in RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina, 10 mM HEPES, 2mm glutammina, 1 mM sodio piruvato e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo^{9,10,11 ,12,13}.
2. Rimuovere le cellule 832/13 da una boccetta di T75 con 2 mL di soluzione 0,25% tripsina, incubazione a 37 ° C per 10 min. neutralizzare tripsina aggiungendo 8 mL di RPMI 1640 completa per i media.
3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire 100 µ l del volume delle cellule da passo 1.2 a 900 µ l di PBS.
4. Cellule di piastra 832/13 ad una densità di 2 x 10⁶ cellule/mL in un 6 ben piatto.
5. Cellule di coltura per 48 h in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO₂ prima di iniziare gli esperimenti di respirazione.

2. preparazione delle cellule per Respirometry ad alta risoluzione

1. Trattando le cellule 832/13 con cacao epicatechina derivate monomero.
   1. Della coltura di cellule di 832/13 per 24 h dopo il placcaggio in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂.
   2. Cambiare supporto 24h dopo il placcaggio e trattare 832/13 celle con controllo del veicolo (3 pozzi) o 100 monomero nM cacao (3 pozzi), seguita dalla cultura per altre 24 h (48 h totale) in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂.
   3. Lavare le cellule 832/13 1 x basso glucosio secrezione Assay Buffer (SAB) per 5 min. aspirato buffer e incubare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 3 h, cambio 1 x glucosio basso SAB ogni ora.
      1. Fare 10 x SAB con 33,32 g di NaCl, 1,73 g di KCl, 0,82 g di KH₂PO₄, 0,7 g di MgSO₄ e aggiungere H₂O ad un volume finale di 500 mL. Filtro sterile la soluzione finale.
      2. Fare 1 x glucosio basso SAB con 10 mL di 10 x SAB, 100 µ l del glucosio di 45%, 2 mL di 1 M HEPES, 1 mL di 0,25 M CaCl₂, 0,57 mL di soluzione al 35% BSA, 0,21 g di NaHCO₃ e aggiungere H₂O ad un volume finale di 100 mL. Filtro sterile la soluzione finale.
2. Trattando le cellule 832/13 con curcumina.
   1. Della coltura di cellule di 832/13 per 48 h dopo il placcaggio in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂.
   2. Lavare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 5 min. aspirato buffer e incubare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 3 h, cambio 1 x glucosio basso SAB ogni ora.
   3. Dopo 2,5 h di incubazione 3H 1 x glucosio basso SAB, aspirare buffer e incubare le cellule in 1 x SAB glucosio basso con controllo del veicolo o 40 µM curcumina per 30 min. A seguito di incubazione, aspirare il buffer.
3. Raccolta delle cellule con tripsina per respirometry ad alta risoluzione
   1. Dopo l'incubazione di 3H 1 x glucosio basso SAB, rimuovere le celle dalla piastra con 250 µ l di 0,25% tripsina per pozzetto.
   2. Unire le celle in tripsina da 3 pozzi trattati con controllo del veicolo o composti di interesse con 4 mL di SAB in una provetta conica da 15 mL.
   3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire 100 µ l del volume delle cellule da passo 2.3.2 a 900 µ l di PBS.
   4. Diluire il numero appropriato di cellule in 1 x glucosio basso SAB per rendere 3 mL alla concentrazione per ogni camera. I dati dimostrano che una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL è il più efficace.
4. Raccolta delle cellule con dissociazione meccanica per respirometry ad alta risoluzione
   1. Dopo l'incubazione di 3 h in 1 x glucosio basso SAB, aggiungere 1 mL di 1x basso glucosio SAB a ciascun bene e delicatamente soffiare cellule fuori la piastra con dissociazione meccanica di pipettaggio con un puntale di 1000 µ l.
   2. Combinare le celle da 3 pozzi trattati con controllo del veicolo o composti di interesse per un totale di 3 mL SAB in una provetta conica da 15 mL per la respirazione.

3. ad alta risoluzione Respirometry

1. Preparazione del respirometro ad alta risoluzione.
   1. Accendere il respirometro ad alta risoluzione e connettersi al desktop lanciando il programma di analisi respirometro.
   2. Aspirare l'etanolo al 70% da entrambe le camere. Godetevi questi alloggiamenti in etanolo al 70% per un minimo di 45 min.
   3. Lavare le camere due volte con etanolo al 70%, ad aspirazione dopo ogni passaggio.
   4. Lavare le camere tre volte con ddH₂O, aspirando dopo ogni passaggio.
   5. Sciacquare i tuffatori di camera in ddH₂O. Questo pulisce fuori etanolo residuo i tuffatori e il porto di titanio.
2. Calibrazione di sensori di ossigeno polarografico.
   1. Aggiungere 2,4 mL di tampone basso glucosio SAB 1x ogni camera di oxygraph, mescolando il buffer continuamente utilizzando barre magnetiche nella camera a 750 giri/min e 37 ° C con un intervallo di dati-registrazione presso 2.0 s premendo il tasto F7 e aprendo la scheda con l'etichetta "Sistemi". Stantuffi di spingere tutto in e poi ritrattare l'impostazione di aerazione di chiave. Almeno per un minimo di 1 ora fino a quando si ottiene il flusso di ossigeno stabile, portare la macchina.
   2. Impostare la macchina a 37 ° C per tutta la durata dell'esperimento. Impostare la tensione di polarizzazione a 800 mV, con un guadagno di 2 premendo il tasto F7 e aprendo la scheda denominata "Ossigeno, O_2". Equilibrare la concentrazione di ossigeno del buffer SAB per almeno 30 min, mentre la variazione di concentrazione di ossigeno è stabile (meno di 2 pmol/(s*mL)).
   3. A seguito di stabilizzazione di concentrazione di ossigeno, è necessario selezionare una regione dove il cambiamento della concentrazione di ossigeno è stabile per stabilire la misura di sfondo del cambiamento nella concentrazione di ossigeno.
      1. Selezionare una regione spingendo il tasto MAIUSC, clic sinistro del mouse e trascinando il mouse in tutta la regione selezionata. Clicca sulla lettera associata alla regione selezionata e il cambiamento a "R1" per ogni traccia, corrispondente con ciascuna delle due camere.
      2. Fare doppio clic sulla casella "O₂ calibrazione" in basso a sinistra e destra angoli dello schermo, fare clic sul pulsante "Seleziona contrassegno" per la "taratura aria" come R1 e quindi selezionare "calibrare e copia negli Appunti" per entrambi gli alloggiamenti.
3. Valutazione della respirazione delle cellule beta 832/13 preparato nei passaggi 2.1.5 o 2.2.5.
   1. Caricare 2,4 mL di campione in ogni camera (una camera con le cellule di controllo veicolo trattato, una camera con cellule trattate composte) in 1x basso glucosio Sab Mantenere 0,5 mL di campione di cellule per la quantificazione della proteina dall'analisi di BCA (acido bicinconinico) se si utilizza l'approccio di dissociazione meccanica (congelare a-20 ° C per la misura più tardi).
      1. Spingere lo stantuffo completamente e aspirare il volume residuo. Mescolare le cellule continuamente durante l'esperimento a 750 giri/min e 37 ° C per tutti i passaggi successivi. Fare un segno facendo clic su F4 ed etichettare come "cellule", quando i campioni vengono caricati.
      2. Misurare i campioni per 30 min. Dopo il segnale di stabilizzazione, seleziona una regione del cambiamento nella concentrazione di ossigeno corrispondente alle condizioni di basso del glucosio (glucosio 2,5 mM), come descritto in 3.2.3.
   2. Una volta raggiunto il segnale di stabilizzazione, aggiungere 12,5 µ l di una soluzione di glucosio sterile 45% (concentrazione finale di 16,7 mM) in ogni camera attraverso il titanio carico porta utilizzando una siringa. Fare che un segno misurato "Glucosio" come descritto nella 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare questa regione del cambiamento nella concentrazione di ossigeno, come descritto in 3.2.3. Questa è la lettura di glucosio 16,7 mM e corrisponde con stimolatore condizioni⁷.
   3. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiungere 1 µ l di oligomycin 5mM (2,5 µM concentrazione finale) in ogni camera attraverso la porta di caricamento. Fare che un segno misurato "OligoA" come descritto nella 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3. Oligomycin A inibisce il trifosfato di adenosina synthase e così l'unico flusso ossigeno che accade avviene tramite perdita di elettroni e di fosforilazione ossidativa⁷non.
   4. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiunta 1 mM FCCP in incrementi di 1 µ l finché non viene stabilito un tasso respiratorio massimo. Questo rappresenta la massima respirazione disgiunto. Tra 3-4 µ l FCCP è sufficiente (1,5-2,0 µM concentrazione finale) per indurre la massima respirazione disgiunto di cellule INS-1 832/13. Fare un segno con l'etichetta "FCCP" come descritto in 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3. FCCP è un agente disgiungere. Questo permette di misurare respirazione disgiunto⁷.
   5. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiungere 1 µ l di 5mm Antimycin A (concentrazione finale di 2,5 µM) in ogni camera attraverso la porta di caricamento. Fare un segno con l'etichetta "AntiA" come descritto in 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3.
      Nota: Antimycin A associa citocromo C reduttasi, inibisce l'ossidazione dell'ubiquinone e blocca tutte le respirazione. Questo permette di arrestare completamente la respirazione⁷.
4. Cellule beta 832/13 per la normalizzazione di respirazione e concentrazione di proteina di misurazione.
   1. Utilizzando i 0,5 mL di campione conservato al caricamento, campione di misura della proteina usando il metodo BCA¹³.
   2. Eseguire ogni esempio in triplice copia, senza diluizione, seguendo le istruzioni del produttore.
5. calcoli di respirazione delle cellule beta 832/13 dalle cellule tripsinizzate.
   1. Immettere il numero di cellule per mL uso nell'analisi premendo il tasto F3 del programma Analisi respirometro. Cambiare le unità di cellule/mL, la concentrazione cellulare di entrare e sostituire il terreno a Sab
   2. Selezionare letture di sfondo per normalizzare i dati selezionando e stipulare O₂ modulo di calibrazione come descritto in 3.2.3.
   3. Effettuare le selezioni delle letture da 2,5 mM glucosio, 16,7 mM glucosio, Oligomycin A, FCCP e Antimycin A come descritto in 3.3.1.
   4. All'interno del programma di analisi del respirometro, esportare le letture per ogni camera dopo aver immesso la concentrazione nella proteina e selezionando i valori medio appropriati per ogni trattamento durante la misurazione della respirazione. Questo viene fatto facendo clic su F2 e poi spingendo la "copia per funzione Appunti". Consente di esportare i dati da utilizzare in altri programmi di analisi. Utilizzare i valori di "O₂ pendio neg." per i calcoli.
   5. Compilare i dati per 3-5 sedute di veicolo trattati controlli e composti naturali cellule trattate per determinare l'effetto sulla respirazione cellulare intatta di beta cellule INS-1 832/13.
6. calcoli di respirazione delle cellule beta 832/13 da dissociate meccanicamente le cellule.
   1. Immettere i calcoli di proteina del dosaggio di BCA premendo il tasto F3 del programma Analisi respirometro. Modificare le unità in mg, immettere la concentrazione di BCA e sostituire il terreno a Sab
   2. Selezionare letture di sfondo per normalizzare i dati selezionando e stipulare O₂ modulo di calibrazione come descritto in 3.2.3.
   3. Effettuare le selezioni delle letture da 2,5 mM glucosio, 16,7 mM glucosio, Oligomycin A, FCCP e Antimycin A come descritto in 3.3.1.
   4. All'interno del programma di analisi del respirometro, esportare le letture per ogni camera dopo aver immesso la concentrazione nella proteina e selezionando i valori medio appropriati per ogni trattamento durante la misurazione della respirazione. Questo viene fatto facendo clic su F2 e poi spingendo la "copia per funzione Appunti". Consente di esportare i dati da utilizzare in altri programmi di analisi. Utilizzare i valori di "O₂ pendio neg." per i calcoli.
   5. Compilare i dati per 3-5 sedute di veicolo trattati controlli e composti naturali cellule trattate per determinare l'effetto sulla respirazione cellulare intatta di beta cellule INS-1 832/13.

Risultati

INS-1 832/13 beta cellule che vengono preparate e raccolti, come descritto nel protocollo dimostrerà modulazione nel consumo di ossigeno basato su vari interventi chimici (Figura 1A). Si osserverà un aumento della respirazione quando la concentrazione di glucosio è aumentata a 16,7 mM glucosio (Figura 1B). Respirazione diminuisce quando le cellule intatte sono trattate con Oligomycin A. Questa respirazione è conosciuta come perdita, che è definito come lo s...

Discussione

L'obiettivo del presente protocollo è utilizzare manometrica ad alta risoluzione per misurare le frequenze respiratorie in cellule beta pancreatiche intatte. Questo metodo consente la misurazione della risposta delle cellule beta ai livelli aumentati del glucosio. Il protocollo consente anche il pretrattamento con vari composti, come dimostrato in questo protocollo con la naturale monomerico epicatechina o curcumina^4,5. Trattamen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
O2k Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program	Oroboros Instruments	27141-01	Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line	Duke University Medical Center	NONE	Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin	Sigma	C7727	Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer	Virginia Polytechnic Institute and State University	NONE	Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin	Sigma	T4049	For cell culture
RPMI-1640	Sigma	R8758	832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4458	832/13 beta cell media component
HEPES	Sigma	H3662	832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine	Caisson	GLL01	832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636	832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148	832/13 beta cell media component
NaCl	Fisher	S271	Component of 10x SAB buffer
KCl	Sigma	P9541	Component of 10x SAB buffer
KH2PO4	Sigma	P5655	Component of 10x SAB buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution	Sigma	G8769	Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2	Sigma	C5670	Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution	Sigma	A7979	Component of 1x SAB buffer
NaHCO3	Sigma	S5761	Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol	Sigma	459844	Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A	Sigma	O4876	Chemicals for respiration assay
FCCP	Sigma	C2920	Chemicals for respiration assay
Anitmycin A	Sigma	A8674	Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit	Thermo Fisher	23225	For determining protein concentration