在天然化合物存在下测定完整β细胞线粒体功能的高分辨率呼吸

摘要

该协议的目的是测量葡萄糖介导的变化对线粒体呼吸的影响, 在天然化合物的存在, 在完整的832/13 β细胞使用高分辨率呼吸。

摘要

高分辨率呼吸允许测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过控制血糖水平, 通过胰岛素分泌来调节血糖浓度, 从而在体内发挥关键作用。胰岛素分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的控制。因此, 测量完整的β细胞呼吸是必不可少的, 以提高β细胞功能作为治疗糖尿病。使用完整的 832/13 INS-1 衍生的β细胞, 我们可以测量增加葡萄糖浓度对细胞呼吸的影响。这个协议允许我们测量β细胞呼吸在存在或没有各种各样的化合物, 允许一个确定特定化合物的作用在原封细胞呼吸。在这里, 我们展示了两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素, 对β细胞呼吸在低 (2.5 毫米) 或高糖 (16.7 毫米) 条件下的作用。这种技术可以用来确定不同的化合物对完整的β细胞呼吸在不同的葡萄糖浓度存在的影响。

引言

胰β细胞的主要目的是维持系统血糖通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌。β细胞感觉循环葡萄糖的生理变化主要归结于低亲和力, 高容量葡萄糖转运器 GLUT2 (葡萄糖运输者 2, K_m 16.7 毫米)¹。随着循环葡萄糖水平的升高, 这种高容量低亲和力转运体促进了β细胞内葡萄糖的比例增加。葡萄糖通过糖酵解、TCA 循环 (三酸循环) 和线粒体呼吸导致细胞 ATP (三磷酸腺苷) 水平的升高而代谢。atp 浓度升高会阻止 atp 敏感的 K⁺通道, 从而导致膜去极化。膜去极化导致电压门控 Ca 的开放^{2 +}通道和随后释放囊泡胰岛素颗粒²。β细胞功能障碍是2型糖尿病 (T2D) 的标志, 其结果是减少和控制不良的胰岛素分泌和最终的β细胞死亡³。维持或改善β细胞功能的机制可用于治疗 T2D。

研究已经证明了自然发生的植物基化合物对胰腺β细胞⁴的有益作用。这些化合物可能通过增加β细胞增殖、存活或葡萄糖刺激的胰岛素分泌而产生作用。例如, 最近的研究表明, 单体儿茶通过增加线粒体呼吸和增加细胞 ATP 水平来增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌⁵。因此, 了解这些化合物如何能增加功能性β细胞质量, 是很重要的利用这些化合物作为潜在的疗法。

细胞呼吸可以通过一些工具来测量。使用高分辨率呼吸允许滴定化学调节剂到化或完整的细胞数量⁶。该工具允许在不同浓度下添加各种化合物, 从而提供广泛的信息。

鉴于葡萄糖代谢和β细胞功能之间的密切联系, 细胞呼吸的测量是至关重要的。细胞呼吸的测量可以使用化或完整的β细胞进行, 每一个都有自己的优缺点^7,8。虽然β细胞的性允许人们测量电子传输链的不同方面, 但它不考虑在β细胞、葡萄糖摄取和新陈代谢中诱导呼吸的机制。因此, 使用 unpermeabilized β细胞呼吸是一种非常有用的技术来确定β细胞对各种葡萄糖水平的反应, 使用氧气消耗量作为读数。

该技术的目的是测量完整的 INS-1 832/13 β细胞的耗氧量。这项技术使我们能够确定β细胞对 unstimulatory 葡萄糖 (2.5 mm 葡萄糖) 的反应以及刺激葡萄糖条件 (16.7 毫米葡萄糖)。虽然 unpermeabilized 细胞不允许我们单独测试电子传输链的复杂 I、II 或 III, 但该技术允许测量复杂的 IV 抑制 (寡 A), 不耦合呼吸 (FCCP-羰基氰化物-4-三氟甲氧基腙), 完全抑制呼吸 (Antimycin A)。这项研究证明了测量呼吸在完整的 unpermeabilized 胰腺β细胞的功效, 以及两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素对β细胞呼吸的影响。

研究方案

1. 细胞培养

1. 培养 INS-1 获得832/13 β细胞在 RPMI 1640 补充与10% 胎牛血清 (FBS), 1% 青霉素-链霉素, 10 毫米 HEPES, 2 毫米谷氨酰胺, 1 毫米钠丙酮酸盐, 和0.05 毫米 2-基^{9,10,11 ,12,13}。
2. 用2毫升0.25% 的胰蛋白酶从 T75 烧瓶中取出832/13 细胞, 在37° c 下孵育10分钟, 加入8毫升的完整 RPMI 1640 介质。
3. 计算细胞使用例和稀释100µL 的细胞体积从步骤1.2 在900µL 的 PBS。
4. 在6井盘中, 在密度为 2 x 10⁶细胞/mL 的情况下, 将832/13 细胞板。
5. 在开始呼吸实验之前, 在37° c 和 5% CO₂的湿恒温箱中培养细胞为 48 h。

2. 高分辨率呼吸细胞的制备

1. 用可可儿茶单体处理832/13 细胞。
   1. 在37° c 和 5% CO₂的湿恒温箱中电镀后培养832/13 细胞24小时。
   2. 改变媒体24小时后电镀, 并处理832/13 细胞与车辆控制 (3 口井) 或100纳米可可单体 (3 口井), 其次是文化的一个额外的 24 h (48 h 共计) 在湿化孵化器在37° c 和 5% CO₂。
   3. 在1x 低葡萄糖分泌物检测缓冲液中洗涤832/13 细胞, 在1x 低血糖的5分钟内孵育832/13 细胞, 每小时改变1x 低血糖浓度。
      1. 用33.32 克氯化钠, 1.73 克氯化钾, 0.82 克₂PO₄, 0.7 克 MgSO₄ , 并将 H₂O 添加到最终的500毫升。无菌过滤器的最终解决方案。
      2. 用10毫升10x 的低血糖的 1x, 100 µL 45% 葡萄糖, 2 毫升的1米 HEPES, 1 毫升的 0.25M CaCl₂, 0.57 毫升的 35% BSA 溶液, 0.21 g 的 NaHCO₃ , 并添加 H₂O 到最后的体积100毫升。无菌过滤器的最终解决方案。
2. 用姜黄素治疗832/13 细胞。
   1. 在37° c 和 5% CO₂的湿恒温箱中电镀后培养832/13 细胞48小时。
   2. 在1x 低血糖的5分钟内冲洗832/13 细胞, 在1x 的低血糖浓度下孵育832/13 细胞, 每小时更换1x 低血糖。
   3. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后 2.5 h, 吸气缓冲和孵育细胞在1x 低血糖审计与车辆控制或40µM 姜黄素30分钟。继孵育后, 吸气缓冲液。
3. 高分辨率呼吸的胰蛋白酶捕获细胞
   1. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后, 从板上取出细胞, 每井250µL 0.25% 胰蛋白酶。
   2. 在15毫升锥形管中, 将胰酶中的细胞与汽车控制或复利的4毫升的3口井结合起来。
   3. 使用例的计数细胞和稀释100µL 的细胞体积从步骤2.3.2 在900µL PBS。
   4. 稀释1x 低血糖局的适当数量的细胞, 使每个腔室的适当浓度为3毫升。数据显示 1 x 10⁶单元/mL 的浓度是最有效的。
4. 高分辨率呼吸的机械离解收获细胞
   1. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后, 增加1毫升的1x 低血糖, 每井, 轻轻地吹离板的细胞与机械离解移与1000µL 吸管尖端。
   2. 将3口井中的细胞与车辆控制或复利结合在一起, 在15毫升的锥形管中进行呼吸, 共3毫升。

3. 高分辨率呼吸

1. 高分辨率呼吸的制备。
   1. 打开高分辨率呼吸并通过启动呼吸分析程序连接到桌面。
   2. 从两个腔中抽出70% 乙醇。在70% 乙醇中浸泡这些腔至少45分钟。
   3. 用70% 乙醇洗两次腔, 每步吸气。
   4. 洗涤室三次与 ddH₂O, 吸气后, 每一步。
   5. 冲洗活塞在 ddH₂O 中的腔室。这将清除活塞和钛港残留的乙醇。
2. 极谱氧传感器的校准。
   1. 在每个 oxygraph 室中加入2.4 毫升的1x 低葡萄糖浓度的缓冲液, 在 750 rpm 和37° c 的情况下, 用磁搅拌棒连续搅动缓冲液, 在2.0 秒内通过推 F7 按钮并打开标签为 "系统" 的选项卡来记录数据间隔。推活塞所有的方式, 然后收回到扳手曝气设置。让机器平衡至少1小时, 直到获得稳定的氧气流量。
   2. 在实验期间, 将机器设置在37° c。将极化电压设置为 800 mV, 通过推 F7 按钮, 并打开标签为 "氧气, O₂" 的标签, 增益为2。平衡至少30分钟的氧浓度, 而氧浓度的变化是稳定的 (少于 2 pmol/毫升)。
   3. 在氧浓度稳定后, 选择氧浓度变化稳定的区域, 建立氧浓度变化的背景测量。
      1. 通过推送 shift 键选择一个区域, 单击鼠标左键并在选定区域中拖动鼠标。单击与所选区域关联的字母, 并更改为每个跟踪的 "R1", 对应于两个分庭。
      2. 双击屏幕左下方和右下角的 "O₂校准" 框, 单击 "选择标记" 按钮以将 "空气校准" 作为 R1, 然后为两个腔室选择 "校准并复制到剪贴板"。
3. 2.1.5 或2.2.5 步骤制备的832/13 种β细胞的呼吸评价。
   1. 在每个腔室中加载2.4 毫升的样品 (一个室与控制车辆处理的细胞, 一个室与复合处理的细胞) 在1x 低血糖审计。如果使用机械离解法 (在-20 ° c 下冻结测量), 将0.5 毫升的细胞样本用于蛋白质定量测定 (二辛可宁酸)。
      1. 推动柱塞的所有方式, 并吸取残余量。在所有后续步骤中, 在 750 rpm 和37° c 的整个实验中连续搅拌细胞。在加载示例时, 单击 F4 并将其标记为 "单元格" 以进行标记。
      2. 测量样品30分钟。在信号稳定后, 选择一个区域的氧浓度变化对应的低葡萄糖条件 (2.5 毫米葡萄糖) 描述的3.2.3。
   2. 在信号稳定达到后, 添加12.5 µL 45% 无菌葡萄糖溶液 (16.7 毫米最终浓度) 进入每个房间通过钛装货港使用注射器。在添加治疗时, 用3.3.1 描述的 "葡萄糖" 作标记。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择这个区域的氧气浓度的变化, 如3.2.3 所述。这是 16.7 mM 葡萄糖读数, 并与刺激条件⁷对应。
   3. 在信号稳定以后被到达增加1µL 5mM 寡 A (2.5 µM 最后的集中) 入每个房间通过装货口岸。在添加治疗时, 用3.3.1 描述的 "OligoA" 作标记。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。寡抑制 ATP 合成酶, 因此唯一的氧气通量发生是通过电子泄漏和不氧化磷酸化⁷。
   4. 在信号稳定被到达之后增加1毫米 FCCP 在1µL 增量直到最大呼吸率建立。这代表最大的不耦合呼吸作用。3-4 µL FCCP 是足够的 (1.5-2.0 µM 最终浓度), 以诱导最大的非耦合呼吸 INS-1 832/13 细胞。在添加治疗时, 将标记标记为 "FCCP", 如3.3.1 所述。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。FCCP 是一个解耦代理。这使我们可以测量不耦合呼吸⁷。
   5. 在信号稳定以后被到达增加1µL 5 毫米 Antimycin A (2.5 µM 最后的集中) 入每个房间通过装货口岸。在添加治疗时, 将标记标记为 "AntiA", 如3.3.1 所述。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。
      注: Antimycin A 结合细胞色素 C 还原酶, 抑制泛氧化, 并阻断所有呼吸。这使我们能够完全停止呼吸⁷。
4. 测量832/13 β细胞的蛋白质浓度和呼吸正常化。
   1. 使用0.5 毫升样本保留在装货, 测量蛋白质样本使用的评估方法¹³。
   2. 按照制造商的指示, 在不稀释的情况下, 每三份样品运行一次。
5. 832/13 β细胞呼吸计算从 trypsinized 细胞。
   1. 通过推呼吸分析程序的 F3 按钮, 在检测中输入每毫升使用的细胞数。将单位改为细胞/毫升, 进入细胞浓度, 并改变介质到审计。
   2. 选择背景读数以使数据正常化, 方法是选择并输入 O₂校准表单, 如3.2.3 中所述。
   3. 从2.5 毫米葡萄糖, 16.7 毫米葡萄糖, 寡 a, FCCP 和 Antimycin a 的读数进行选择, 如3.3.1 所述。
   4. 在呼吸分析程序中, 在进入蛋白质浓度后, 为每个腔室输出读数, 并在呼吸测量期间选择适当的平均值。这是通过单击 F2, 然后推动 "复制到剪贴板功能" 完成的。这将导出要在其他分析程序中使用的数据。使用 "O₂斜率为负值" 进行计算。
   5. 为3-5 独立运行的车辆处理控制和天然化合物处理细胞的数据, 以确定对 INS-1 832/13 β细胞的完整细胞呼吸的影响。
6. 832/13 β细胞呼吸计算从机械上离解的细胞。
   1. 通过推呼吸分析程序的 F3 按钮, 从该方法中输入蛋白质计算。将单位改为 mg, 进入其浓度, 并将培养基转变为审计组。
   2. 选择背景读数以使数据正常化, 方法是选择并输入 O₂校准表单, 如3.2.3 中所述。
   3. 从2.5 毫米葡萄糖, 16.7 毫米葡萄糖, 寡 a, FCCP 和 Antimycin a 的读数进行选择, 如3.3.1 所述。
   4. 在呼吸分析程序中, 在进入蛋白质浓度后, 为每个腔室输出读数, 并在呼吸测量期间选择适当的平均值。这是通过单击 F2, 然后推动 "复制到剪贴板功能" 完成的。这将导出要在其他分析程序中使用的数据。使用 "O₂斜率为负值" 进行计算。
   5. 为3-5 独立运行的车辆处理控制和天然化合物处理细胞的数据, 以确定对 INS-1 832/13 β细胞的完整细胞呼吸的影响。

结果

INS-1 832/13 β细胞的准备和收获的协议中所描述的, 将显示在氧气消耗的基础上的各种化学干预 (图 1A)。当葡萄糖浓度增加到16.7 毫米葡萄糖 (图 1B) 时, 将观察到呼吸的增加。当完整的细胞被寡处理后, 呼吸会减少。这种呼吸称为渗漏, 它被定义为基底, nonphosphorylating 呼吸状态。当β细胞被解偶联剂 FCCP, 即 ETS 呼吸或电子传输系统呼吸时, 将达到最大呼吸。?...

讨论

本议定书的目的是使用高分辨率呼吸测量完整的胰β细胞的呼吸速率。这种方法允许测量β细胞的反应, 以增加葡萄糖水平。该协议还允许对各种化合物进行预处理, 如本协议所示, 与自然发生的单体儿茶或姜黄素^4,5。与其他各种化合物的治疗可以用于本议定书, 与预处理 (如此处所示), 或通过对基本协议的最小修改在呼吸室内治疗...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
O2k Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program	Oroboros Instruments	27141-01	Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line	Duke University Medical Center	NONE	Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin	Sigma	C7727	Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer	Virginia Polytechnic Institute and State University	NONE	Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin	Sigma	T4049	For cell culture
RPMI-1640	Sigma	R8758	832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4458	832/13 beta cell media component
HEPES	Sigma	H3662	832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine	Caisson	GLL01	832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636	832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148	832/13 beta cell media component
NaCl	Fisher	S271	Component of 10x SAB buffer
KCl	Sigma	P9541	Component of 10x SAB buffer
KH2PO4	Sigma	P5655	Component of 10x SAB buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution	Sigma	G8769	Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2	Sigma	C5670	Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution	Sigma	A7979	Component of 1x SAB buffer
NaHCO3	Sigma	S5761	Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol	Sigma	459844	Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A	Sigma	O4876	Chemicals for respiration assay
FCCP	Sigma	C2920	Chemicals for respiration assay
Anitmycin A	Sigma	A8674	Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit	Thermo Fisher	23225	For determining protein concentration