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Resumo

O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.

Resumo

Respirometria de alta resolução permite a medição do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas, células e tecidos. As células beta desempenham um papel fundamental no corpo por controlar níveis de glicose no sangue através da secreção de insulina em resposta a concentrações elevadas de glicose. A secreção de insulina é controlada pelo metabolismo da glicose e respiração mitocondrial. Portanto, medir a respiração celular intacta de beta é essencial para ser capaz de melhorar a função da célula beta como um tratamento para o diabetes. Usar intacta 832/13 INS-1 derivado de células beta, podemos medir o efeito do aumento da concentração de glicose na respiração celular. Este protocolo permite-nos medir a respiração celular beta na presença ou ausência de vários compostos, permitindo que se determine o efeito de dado compostos na respiração celular intacta. Aqui vamos demonstrar o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na célula beta respiração sob a presença de condições de glicose elevada (16,7 mM) ou baixo (2,5 mM). Esta técnica pode ser usada para determinar o efeito de vários compostos na respiração celular intacta de beta na presença de diferentes concentrações de glicose.

Introdução

O objetivo principal da célula beta pancreática é manter o sistema normoglycemia, através da secreção de insulina glicose-estimulado. As células beta sentir mudanças fisiológicas em circulação glicose em grande parte devido a baixa afinidade, transportador de glicose alta capacidade GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Como aumento dos níveis de glicose circulatório, este transporte de baixa afinidade de alta capacidade facilita um aumento proporcional de glicose intracelular dentro da célula beta. Glicose é metabolizada através da glicólise, o ciclo de TCA (ciclo do ácido cítrico) e respiração mitocondrial, resultando em elevados níveis celulares de ATP (adenosina trifosfato). A elevada concentração de ATP bloqueia os canais de K+ sensíveis ATP, resultando em despolarização da membrana. Despolarização da membrana provoca a abertura de canais de tensão Ca2 + e subsequente liberação de vesículas limite de grânulos de insulina2. Disfunção da célula beta é uma marca registrada de Diabetes tipo 2 (T2D) e resulta na secreção de insulina diminuída e mal controlado e, finalmente, a morte de células beta3. Mecanismos que mantêm ou melhorar a função da célula beta podem ser usados como um tratamento para T2D.

Estudos têm demonstrado os efeitos benéficos de ocorrência natural compostos à base de plantas em células pancreáticas do beta4. Estes compostos podem ter seu efeito através da crescente proliferação de células beta, sobrevivência ou a secreção de insulina glicose-estimulada. Por exemplo, estudos recentes têm demonstrado que epicatequina monomérica aumenta a secreção de insulina glicose-estimulada, aumentando a respiração mitocondrial e ATP celular a aumentar os níveis de5. Portanto, compreender como esses compostos podem aumentar funcional de células beta em massa é importante para alavancar estes compostos como terapêutica potencial.

Respiração celular pode ser medida através de um número de ferramentas. Uso de um respirometer de alta resolução permite a titulação de moduladores químicos para uma população de célula intacta ou permeabilized6. Esta ferramenta permite a adição de vários compostos, em diferentes concentrações, dando assim uma grande variedade de informações.

Dada a conexão íntima entre o metabolismo da glicose e função da célula beta, medições de respiração celular são críticas. Medições da respiração celular podem ser feitas usando permeabilized ou intactas as células beta, com cada um que tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens de7,8. Enquanto permeabilização de células beta permite medir diferentes aspectos da cadeia de transporte de elétrons, fá-lo sem cumprimentos para o mecanismo de indução de respiração na célula beta, absorção de glicose e metabolismo. Portanto, o uso da respiração celular de beta unpermeabilized é uma técnica muito útil para determinar a resposta de células beta para vários níveis de glicose, usando o consumo de oxigênio como a leitura.

O objetivo desta técnica é medir o consumo de oxigênio em intacta INS-1 derivado de células beta de 832/13. Esta técnica nos permite determinar a resposta das células beta às condições unstimulatory glicose (glicose 2,5 mM) bem como condições estimulatórios glicose (glicose 16,7 mM). Enquanto as células unpermeabilized não nos permitem testar individualmente complexo I, II ou III do elétron da cadeia de transporte, a técnica que permite medições lidando com respiração de inibição (A oligomicina), desacoplada complexa IV (FCCP-carbonila cianeto- 4- phenylhydrazone (trifluorometoxi)) e completamente inibida a respiração (A Antimycin). Este estudo demonstra a eficácia da respiração em intactas unpermeabilized células-beta do pâncreas, bem como o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na respiração celular beta de medição.

Protocolo

1. cultura de pilha

  1. Cultura INS-1 derivado 832/13 células beta em RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 10 mM HEPES, glutamina de 2 mM, 1 mM piruvato de sódio e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol9,10,11 ,12,13.
  2. Remova células 832/13 de um frasco de T75 usando 2 mL de tripsina 0,25%, incubar a 37 ° C por 10 min. neutralizar tripsina adicionando 8 mL de mídia completa de RPMI 1640.
  3. Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 1.2 em 900 µ l de PBS.
  4. Células de placa 832/13 em uma densidade de 2 x 106 células/mL em um 6 bem o prato.
  5. Cultura de células para 48 h numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% CO2 antes de iniciar os experimentos de respiração.

2. preparação de células para respirometria de alta resolução

  1. Tratamento de 832/13 células com monômero de cacau epicatequina derivada.
    1. Cultura de células 832/13 para 24 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Mudar de mídia 24 h após o chapeamento e tratar as células 832/13 com o controle do veículo (3 poços) ou 100 monômero de cacau nM (3 poços), seguido de cultura para um adicional 24h (total de 48 h) em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2.
    3. Lavam-se células de 832/13 em 1 x baixa glicose secreção ensaio Buffer (SAB) para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB cada hora.
      1. Fazer 10 x SAB com 33,32 g de NaCl, 1,73 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4, 0,7 g de MgSO4 e adicione H2O, até um volume final de 500 mL. Filtro estéril a solução final.
      2. Faça 1 x baixa glicose SAB com 10 mL de 10 x SAB, 100 µ l de 45% de glicose, 2 mL de 1m HEPES, 1ml de 0,25 M CaCl2, 0,57 mL de solução de BSA de 35%, 0,21 g de NaHCO3 e adicione H2O para um volume final de 100 mL. Filtro estéril a solução final.
  2. Tratamento de 832/13 células com curcumina.
    1. Cultura 832/13 células para 48 h após chapeamento numa incubadora umidificado a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Lavar as células 832/13 1 x baixa glicose SAB para o buffer de aspirado de 5 min. e incube 832/13 células em 1x baixa glicose SAB para 3h, mudando 1 x baixa glicose SAB a cada hora.
    3. Após 2,5 h de incubação h 3 em 1 x baixa glicose SAB, Aspire o tampão e incubar as células em 1 x baixa glicose SAB com o controle do veículo ou 40 µM curcumina por 30 min. Após incubação, Aspire o buffer.
  3. Colheita de células com tripsina para respirometria de alta resolução
    1. Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, remova as células da placa com 250 µ l de tripsina 0,25% por poço.
    2. Combine as células em tripsina de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse com 4 mL de SAB em um tubo cônico de 15 mL.
    3. Contar as células usando um hemocytometer e diluir 100 µ l do volume de célula de etapa 2.3.2 em 900 µ l de PBS.
    4. Dilua o número adequado de células em 1 x baixa glicose SAB fazer 3 mL na concentração adequada para cada câmara. Os dados demonstram que uma concentração de 1 x 106 células/mL é o mais eficaz.
  4. Colheita de células com dissociação mecânica para respirometria de alta resolução
    1. Após a incubação de 3h em 1 x baixa glicose SAB, adicione 1 mL de 1x baixa glicose SAB a cada bem e delicadamente explodir células no prato com dissociação mecânica pipetando com uma ponta de pipeta 1000 µ l.
    2. Combine as células de 3 poços tratados com o controle do veículo ou compostos de interesse em um total de 3 mL SAB em um tubo cônico de 15 mL para a respiração.

3. High-Resolution respirometria

  1. Preparação da respirometer de alta resolução.
    1. Ligue o respirometer de alta resolução e conectar para a área de trabalho com o lançamento do programa de análise de respirometer.
    2. Aspire o etanol a 70% de ambas as câmaras. Aproveite estas câmaras em etanol a 70% por um período mínimo de 45 min.
    3. Lave as câmaras duas vezes com etanol 70%, por aspiração após cada etapa.
    4. Lave as câmaras três vezes com o ddH2O, por aspiração após cada etapa.
    5. Lave os êmbolos de câmara no ddH2O. Isto limpa fora etanol residual dos êmbolos e para o porto de titânio.
  2. Calibração de sensores de oxigênio polarographic.
    1. Adicionar a 2,4 mL de tampão de baixa glicose SAB 1x a cada câmara oxygraph, agitando o buffer continuamente usando barras magnéticas celeuma na câmara a 750 rpm e 37 ° C, com um intervalo de gravação de dados no 2.0 s apertando a tecla F7 e abrindo a guia rotulada "Sistemas". Empurre os pistões em todo o caminho e então retorne à configuração da chave de aeração. Deixe a máquina equilibrar durante um período mínimo de 1 hora até à obtenção de fluxo de oxigênio estável.
    2. Defina a máquina a 37 ° C para a duração do experimento. Definir a tensão de polarização de 800 mV, com um ganho de 2 apertando a tecla F7 e abrindo na guia rotulada "Oxigênio, O2". Equilibrar a concentração de oxigênio do buffer SAB pelo menos 30 min, enquanto a mudança na concentração de oxigênio é estável (menos de 2 pmol/(s*mL)).
    3. Após a estabilização da concentração de oxigênio, selecione uma região onde a alteração da concentração de oxigênio é estável para estabelecer a medida do fundo da mudança na concentração de oxigênio.
      1. Selecione uma região por pressionando a tecla shift, o botão esquerdo do mouse e arrastar o mouse na região selecionada. Clique sobre a letra associada a região selecionada e mude para "R1" para cada traço, correspondente com cada uma das duas câmaras.
      2. Clique duas vezes na caixa "O2 calibração" no canto inferior esquerdo e direito cantos da tela, clique no botão "selecionar marca" para a "calibração de ar" como R1 e selecione "calibrar e copiar para o clipboard" para ambas as câmaras.
  3. Avaliação da respiração das células beta de 832/13 preparado em etapas 2.1.5 ou 2.2.5.
    1. Carga de 2,4 mL da amostra em cada câmara (uma câmara com controle veículo Tratado células, uma câmara com células tratadas compostas) em 1 x baixa glicose sab Mantêm a 0,5 mL de amostra de células para quantificação da proteína, ensaio BCA (ácido Bicinchoninic) se usando a abordagem de dissociação mecânica (congelar a-20 ° C para medição mais tarde).
      1. Empurre o êmbolo todo o caminho e aspire o volume residual. Misture as células continuamente ao longo do experimento a 750 rpm e 37 ° C, durante todas as etapas subsequentes. Faça uma marca clicando em F4 e rotular como "células", quando as amostras são carregadas.
      2. Medir as amostras por 30 min. Após a estabilização do sinal, selecione uma região da mudança na concentração de oxigênio correspondente às condições de baixos de glicose (glicose 2,5 mM), conforme descrito em 3.2.3.
    2. Após estabilização do sinal é atingida, adicione 12,5 µ l de uma solução de glicose estéril de 45% (concentração final de 16,7 mM) em cada câmara através do titânio Porto utilizando uma seringa de carregamento. Faça que uma marca medido "Glicose", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta região da mudança na concentração de oxigênio, conforme descrito em 3.2.3. Esta é a leitura de glicose 16,7 mM e corresponde com condições estimulatórios7.
    3. Após estabilização do sinal é atingida, adicione 1 µ l de oligomicina 5mM (2,5 µM concentracao final) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça que uma marca medido "OligoA", como descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Oligomycin A inibe a ATP sintase e, portanto, a única ocorrendo fluxo do oxigênio é através de vazamento de elétrons e não a fosforilação oxidativa7.
    4. Após estabilização do sinal é atingida mais 1 mM Compararia em incrementos de 1 µ l até uma taxa de respiração máxima é estabelecida. Isso representa a respiração desacoplada máxima. Entre 3-4 µ l Compararia é suficiente (1,5-2,0 µM concentração final) para induzir a respiração desacoplada máxima das células INS-1 832/13. Faça uma marca rotulada "FCCP", conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3. Compararia é um agente de desacoplamento. Isso nos permite medir a respiração desacopladas7.
    5. Após estabilização do sinal é atingida adicione 1 µ l de 5mm Antimycin A (concentração final de 2,5 µM) em cada câmara através do porto de carregamento. Faça uma marca rotulada "AntiA" conforme descrito em 3.3.1, quando o tratamento é adicionado. Deixe sinal estabilizar e gravar a respiração celular, até que um fluxo de oxigênio estável seja alcançado. Selecione esta área da curva, conforme descrito em 3.2.3.
      Nota: Antimycin A vincula citocromo C redutase, inibe a oxidação de ubiquinona e bloqueia a respiração de todos. Isso nos permite parar completamente a respiração7.
  4. 832/13 células beta para normalização de concentração e respiração de proteína de medição.
    1. Usando a 0,5 mL da amostra retida no carregamento, amostra de proteína de medida usando o BCA método13.
    2. Execute cada amostra em triplicata, sem diluição, seguindo as instruções do fabricante.
  5. 832/13 célula beta cálculos de respiração das células trypsinized.
    1. Digite o número de células por mL uso no ensaio empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de células/mL, insira a concentração celular e alterar médio para sab.
    2. Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.
    3. Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.
    4. Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.
    5. Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.
  6. cálculos de respiração de célula beta de 832/13 de dissociado mecanicamente as células.
    1. Inserir os cálculos de proteína de ensaio BCA empurrando a tecla F3 do programa de análise de respirometer. Alterar as unidades de mg, inserir a concentração do BCA e alterar médio para sab.
    2. Selecione leituras de fundo para normalizar os dados selecionando e entrando O2 forma de calibração conforme descrito em 3.2.3.
    3. Faça seleções de leituras de 2,5 mM de glicose, 16,7 mM de glicose, Oligomycin A, FCCP e A Antimycin conforme descrito em 3.3.1.
    4. Dentro do programa de análise de respirometer, exporte as leituras para cada câmara após entrar a concentração de proteína e selecionando valores médios apropriados para cada tratamento durante a medição da respiração. Isto é feito clicando em F2 e, em seguida, empurrando o "copiar para a função de transferência". Isso exporta os dados para uso em outros programas de análise. Use os valores de "Declive negativo2" para cálculos.
    5. Compilação de dados para 3-5 é executado independente do veículo tratados controles e naturais compostos de células tratadas para determinar o efeito na intacta respiração celular de células beta de INS-1 832/13.

Resultados

As células beta INS-1 832/13 que são preparadas e colhidas conforme descrito no protocolo irá demonstrar a modulação no consumo de oxigênio baseado em várias intervenções químicas (figura 1A). Será observado um aumento na respiração quando a concentração de glicose é aumentada para 16,7 mM de glicose (figura 1B). Respiração diminuirá quando as células intactas são tratadas com o Oligomycin A. Esta respiração é conhecida como vazamento, qu...

Discussão

O objectivo do presente protocolo é usar respirometria de alta resolução para medir as taxas respiratórias em células-beta do pâncreas intactas. Este método permite a medição da resposta célula beta à glicose aumento níveis. O protocolo também permite o tratamento prévio com vários compostos, como demonstrado no presente protocolo com o natural monomérico epicatequina ou curcumina4,5. Tratamento com vários outros ...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer os membros dos laboratórios Tessem e Hancock para assistente e discussão científica. Os autores agradecer Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para fornecer a fração de monômero de cacau epicatequina derivada. Este estudo foi suportado por uma concessão da Fundação de educação e pesquisa-ação Diabetes de JST.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
O2k Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 ProgramOroboros Instruments27141-01Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell lineDuke University Medical CenterNONEBeta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
CurcuminSigmaC7727Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomerVirginia Polytechnic Institute and State UniversityNONEPre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
TrypsinSigmaT4049For cell culture
RPMI-1640SigmaR8758832/13 beta cell media
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycinSigmaP4458832/13 beta cell media component
HEPESSigmaH3662832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
GlutamineCaissonGLL01832/13 beta cell media component
Sodium PyruvateSigmaS8636832/13 beta cell media component
2-MercaptoethanolSigmaM3148832/13 beta cell media component
NaClFisherS271Component of 10x SAB buffer
KClSigmaP9541Component of 10x SAB buffer
KH2PO4SigmaP5655Component of 10x SAB buffer
MgSO4SigmaM2643Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose SolutionSigmaG8769Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2SigmaC5670Component of 1x SAB buffer
35% BSA SolutionSigmaA7979Component of 1x SAB buffer
NaHCO3SigmaS5761Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanolSigma459844Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin ASigmaO4876Chemicals for respiration assay
FCCPSigmaC2920Chemicals for respiration assay
Anitmycin ASigmaA8674Chemicals for respiration assay
BCA Protein KitThermo Fisher23225For determining protein concentration

Referências

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