JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف العام لهذه المنهجية إعطاء أفضل الظروف التجريبية من إعداد نموذج للحصول على الصور، وإعادة الإعمار من أجل أداء 2D ثنائي اللون دستورم الصور ميكروتوبوليس وخيوط متوسطة في الخلايا الثابتة

Abstract

سيتوسكيليتون، تتألف من أكتين ميكروفيلامينتس، ميكروتوبوليس، وخيوط متوسطة (إذا كان)، دوراً رئيسيا في السيطرة على شكل الخلية والأقطاب وحركية. درس تنظيم شبكات أكتين وميكروتوبولي على نطاق واسع ولكن أن الاتحاد لا بعد تماما وتتميز. الاتحاد يكون متوسط قطرها 10 نانومتر وشكل شبكة تمتد في جميع أنحاء السيتوبلازم الخلية. أنها ترتبط فعلياً مع الأكتين وميكروتوبوليس من خلال المحركات الجزيئية و cytoskeletal linkers. هذه الرابطة ضيق يقع في صميم الآليات التنظيمية التي تكفل تنظيم الشبكات cytoskeletal الثلاث المطلوبة لمعظم وظائف الخلية المنسقة. ولذلك من الأهمية بمكان لتصور الاتحاد وحدها وأيضا جنبا إلى جنب مع كل من الشبكات الأخرى سيتوسكيليتال. إذا كانت شبكات غير كثيفة جداً في معظم أنواع الخلايا، لا سيما في الخلايا الدبقية، مما يجعل من الصعب جداً تحقيق مع الفحص المجهري fluorescence القياسية قرارها (الأفقي القرار ~ 250 nm). مباشرة "العشوائية بصري التعمير مجهرية" (دستورم) أسلوب يسمح مكسب في القرار الأفقي من حجم واحد. هنا، نحن تبين أن القرار دستورم الجانبي كافية لحل المنظمة كثافة الشبكات إذا، وعلى وجه الخصوص، إذا كانت حزم المحيطة microtubules. هذه الرابطة ضيق من المحتمل أن تشارك في تنظيم منسق لهذه الشبكات اثنين وأيار/مايو، وشرح كيف فيمنتين الاتحاد القالب واستقرار المنظمة microtubule فضلا عن يمكن أن تؤثر على الاتجار حويصلية التابعة ميكروتوبولي. وبصورة أعم، نعرض كيفية مراقبة عنصرين cytoskeletal مع تقنية دستورم المزدوج-لون يجلب ثاقبة جديدة من التفاعل المتبادل بينهما.

Introduction

هيولى خيوط متوسطة (IFs) هي هومو 10 نانومتر-قطر-أو هيتيروبوليميرس من نوع الخلية مجموعة فرعية معينة من البروتينات إذا. ويشارك الاتحاد في مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية مثل الخلية استجابات حركية وانتشارها والإجهاد. دورهم الرئيسي هو أبرز حقيقة أن أكثر من 90 من الأمراض البشرية هي الناجم مباشرة عن طفرات في البروتينات إذا؛ على سبيل المثال، التغييرات في تكوين إذا ترافق نمو الورم وينتشر1،،من23. تتزايد الأدلة التي تعمل بثلاثة أنظمة سيتوسكيليتون في التعاون لمراقبة الوظائف الخلوية مثل الخلية الاستقطاب، شعبة والهجرة2،3. إذ هناك اقتران ضيق بين الهيكل المكاني، والوظائف، من الأهمية بمكان للحصول على رؤى في الهيكل التنظيمي المتكامل مع خيوط أخرى وفهم أفضل سيتوسكيليتال للتحدث عبر. تنص هذه المادة على بروتوكول لأداء ثنائي اللون دستورم (المباشر العشوائية بصري التعمير مجهرية) تقنية فائقة القرار4 وكيف يتم استخدامه للتحقيق بالتفاعل بين إذا و microtubules في ثابت، ومثقف. الخلايا في 2 الأبعاد (2D).

وقد وضعت العديد من التقنيات فائقة القرار على مدى العقد، وهناك اكتشافات كانت في الأصل على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 20145. تقع بين جميع هذه التقنيات الأساليب المستندة إلى التعريب جزيء واحد مثل النخيل6 (فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية) الذي يستخدم البروتينات الفلورية فوتوسويتشابل، العاصفة7 مع أزواج من فلوروفوريس أو دستورم4 مع فلوروفوريس التقليدية. جميع هذه الأساليب تقوم على نفس المبدأ الذي يتألف من (ط) تبديل معظم الصحفيين الفلورية إلى حالة "إيقاف التشغيل" "(غير-فلوري)، (ثانيا) تفعيل العشوائية لمجموعة فرعية منها في فلوري الدولة من أجل ترجمة هذه الموقف المكاني بدقة نانومتر، و (iii) تكرار هذه العملية من أجل تفعيل العديد من مجموعات فرعية من فلوروفوريس قدر الإمكان. يتم إعادة إنشاء صورة نهائية باستخدام جميع تعريب من جزيئات المنشط، تقديم قرار جانبية وصولاً إلى ~ 20-40 نانومتر. عدة نظم الضوئية تجارياً يسمح بألم/العاصفة متاحة الآن لعلماء الأحياء لإجراء التجارب الروتينية. هنا، كان يستخدم واحد مثل هذا النظام لدراسة هيكلية رابطة microtubules والاتحاد. بين كل جزيء مفرد المستندة إلى تعريب الأساليب، اختير هذا الأسلوب المزدوج-لون دستورم، لأنها مناسبة تماما لمراقبة المناطق رقائقي رقيقة جداً (< 1 ميكرومتر) من الخلايا ملتصقة ويمكن أن توفر تحسنا كبيرا من دقة الصورة مع الحد الأدنى من استثمار الوقت والمال. وفي الواقع، دستورم هو تقنية مريحة للغاية وتنوعاً متوافق مع الأصباغ العضوية القياسية المستخدمة بشكل روتيني لتلطيخ الخلوية والفلوره.

بينما الصور دستورم لون واحد بسيطة نسبيا للحصول على استخدام فلوروفوري Alexa6478، يتطلب دستورم اللون المزدوج تحسين ظروف تجريبية بحيث يمكن وميض الأصباغ اثنين بشكل صحيح في المخزن المؤقت الذي تم اختياره، ولا سيما عندما يكون هناك محدودة طاقة الليزر. أوراق ممتازة متاحة بالفعل على أساليب لإعداد التصوير متعدد الألوان مع دستورم9،،من1011،،من1213، وهذه الورقات شرح بالتفصيل المصادر الممكنة من القطع الأثرية ودقة وضوح الصورة المتدهورة وكيفية التغلب عليها. في هذه المقالة، والظروف التجريبية الأمثل من حيث تثبيت الخلايا، إيمونوستينينج، وإعداد نموذج، اقتناء التصوير وإعادة بناء صورة موصوفة بغية الحصول على الصور من شبكات إذا هيولى كثيفة وميكروتوبوليس في الخلايا الدبقية مع دستورم اللون المزدوج. بإيجاز، الطريقة استخراج/التثبيت الموضحة في كازو et al12 تم تكييفها للخلايا الدبقية واستخدامها مع خطوة بعد انتهاء تثبيت، تركيز الأجسام المضادة الأمثل، مخزن مؤقت عاصفة مع 10 ملم وصف اتفاق بيئي متعدد الأطراف في ديمبسي9 et al. الذي كان وجد أن الأمثل لإعداد تجريبية ونوع العينة.

الخلايا الدبقية express أساسا ثلاثة أنواع من البروتينات إذا: فيمنتين، نيستين وتوصيني (الدبقية الحمضية البروتين فيبريلاري). وعرضت هذه البروتينات الثلاثة بلمرة يشترك في أستروسيتيس14. أظهرنا سابقا باستخدام فائقة القرار تنظيماً إضاءة مجهرية (SIM ريال) أن ويمكن الاطلاع على هذه البروتينات إذا كان ثلاثة في الشعيرة إذا واحد نفسه وأنها عرض التوزيع وديناميات مماثلة في الخلايا الدبقية 15. نظراً للتشابه بين البروتينات إذا ثلاثة، تلطيخ فيمنتين كمراسل لشبكة الاتصال إذا كان كله. باستخدام دستورم، تمكنا من حل كيف إذا شكل حزم على طول ميكروتوبوليس، التي لم يكن من الممكن مع حيود محدودة المجهري تقنيات15. قد تساعد هذه الملاحظات فهم كيف يمكن للاتحاد فيمنتين microtubules القالب وتنظم على مسار النمو، تعزيز الحفاظ على محور قطبية أثناء الهجرة الخلية16. صور فائقة الدقة قدمت معلومات أساسية عن التفاعل المتبادل بين نظامين فرعيين cytoskeletal، والتبصر في الربط بين الرابطة المكانية والوظيفة المحلية التي يمكن أن تكون من نوع خلية محددة17. وبصفة عامة، يمكن استخدام دستورم اللون المزدوج للدراسة الحديث المتبادل بين العناصر سيتوسكيليتال أو أنواع أخرى من العضيات، شريطة أن يتم التوصل إلى شروط إيمونوستينينج جيدة من حيث الكثافة وخصوصية. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأفضل وصف التغييرات cytoskeleton لاحظ أثناء أستروجليوسيس وفي جليوبلاستوما، والورم الأكثر شيوعاً والأكثر الخبيثة للنظام العصبي المركزي، حيث يتم التعبير عن البروتينات إذا غيرت 18 ،19،،من2021.

Protocol

1-كوفيرسليبس إعداد (اليوم 1، 30 دقيقة)

  1. ضع كوفيرسليبس الزجاج nº1.5H 18 ملم (ميكرومتر 170 +/-5µm) على رف بلاستيك.
  2. وضع على الرف في كوب 100 مل مليئة بالأسيتون ونقع لمدة 5 دقائق.
  3. نقل الحامل إلى 100 مل كوب مليئة الإيثانول المطلقة ونقع لمدة 5 دقائق.
  4. نقل الحامل إلى كوب 100 مل جديدة مليئة الإيثانول المطلقة ووضع في الكأس في جهاز الموجات فوق الصوتية أنظف (انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة. اضغط على "على" والانتظار لمدة 10 دقائق.
  5. وضع على الرف تحت غطاء الاندفاق الصفحي وترك كوفيرسليبس جاف أو جاف كوفيرسليبس مع تدفق الهواء التي تمت تصفيتها.
  6. وضع على الرف مع كوفيرسليبس في جهاز بلازما أنظف. التبديل على مضخة فراغ، أغلق الباب، انتظر 3 دقائق لجعل الفراغ والتبديل على البلازما لدقيقة 1 استخدام كوفيرسليبس وقت قصير بعد التنظيف. لا تقم بتخزين لهم.

2-خلية الطلاء (اليوم 1، 20 دقيقة)

  1. تنمو الخلية الدبقية خط U373 في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) مع 10% "مصل بقرى الجنين"، 1% البنسلين والستربتوميسين، و 1% من الأحماض الأمينية غير الضرورية في صحن بيتري البلاستيك قطرها من 10 سم.
  2. ضع كوفيرسليبس زجاج نظيفة في لوحات 12-البئر تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي وإضافة 1 مل متوسطة مسخن الخلية الواحدة وكذلك.
  3. تأخذ طبق يحتوي على خلايا من الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
  4. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني.
  5. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل 0.05% يدتا التربسين.
  6. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق.
  7. أضف 10 مل متوسط الحار يسخن عند 37 درجة مئوية في الطبق وريسوسبيند الخلايا.
  8. الخلايا عن كل 100000 البذور كل بئر (~ 150 ميليلتر من الخلايا) في لوحات 12-جيدا التي تحتوي كوفيرسليبس.
  9. انتظر على الأقل 6 ح (أو بين عشية وضحاها) للسماح بانتشار الخلايا.

3-خلية التثبيت (اليوم 2، ح 2)

  1. إعداد المخزن المؤقت سيتوسكيليتون مع أنابيب 80 مم، 7 مم مجكل2، 1 مم اجتا، 150 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 6.9.
  2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل كل بئر لاستخراج/تثبيت الحل بلطف (0.25 ٪ glutaraldehyde، 0.3% X-100 تريتون في المخزن المؤقت cytoskeleton) يسخن عند 37 درجة مئوية.
  4. احتضان 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة الحل وإضافة 1 مل كل من حل منهاج العمل (بارافورمالدهيد) مسخن والطازجة 4% المخفف في المخزن المؤقت سيتوسكيليتون جيدا برفق.
    تنبيه: استخدام قفازات وتعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  6. ضع لوحة 12-جيدا في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  7. إزالة منهاج عمل بيجين وأضف 3 مل من برنامج تلفزيوني في البئر.
    ملاحظة: تعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية مع القفازات ووضع منهاج العمل المعاد تدويرها في سلة محددة.
  8. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  9. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حل الطازجة 10 ملم نأبه4 المخفف في برنامج تلفزيوني من أجل إخماد أوتوفلوريسسينسي القادمة من جلوتارالديهيدي.
  10. احتضان لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. وضع نأبه المعاد تدويرها4 في سلة محددة.
  12. أغسل ثلاث مرات 5 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
  13. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة عرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني).
  14. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
    ملاحظة: ويمكن تخزين المخزن المؤقت سيتوسكيليتون في درجة حرارة الغرفة لمدة بضعة أشهر. منهاج عمل بيجين ونابه4 glutaraldehyde يجب أن تعالج الرعاية الخاصة (هود، والقفازات، وصناديق إعادة التدوير المحددة). وينبغي إضافة حلول وإزالتها بلطف من أجل الحفاظ على سلامة الخلايا. من المهم عدم السماح للخلايا الجافة.

4-إيمونوستينينج (اليوم 2، ح 5)

  1. إعداد الحل الأجسام الأولية باستخدام مكافحة فيمنتين tubulin لمكافحة مع إضعاف 1: 500 في عرقلة الحل.
  2. وضع 100 ميليلتر قطرات من الأجسام المضادة الأساسي المخفف على طبقة فيلم بارافين ومكان كوفيرسليبس فوقهم مع الخلايا التي تواجه إلى الأسفل.
  3. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية حاء 2 وضع ملء كوفيرسليبس مرة أخرى في صفيحة 12-جيدا مع برنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري.
  4. وفي الوقت نفسه، تعد الأجسام المضادة الثانوية الحل باستخدام الماوس لمكافحة Alexa647 و Alexa555 لمكافحة الفئران في إضعاف 000 1:1، في عرقلة الحل. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تمضي مثل 4.2. حماية الخلايا من الضوء.
  5. وضع ساترة مرة أخرى في صفيحة 12-بئر مليئة ببرنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مختلطة مع 1 ميليلتر من 0.1 ميكرون تيتراسبيك الخرز.
  6. وضع الآبار شاكر مداري ل 30 دقيقة شطف مع برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق مع حل منهاج عمل 4% في برنامج تلفزيوني. شطف ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: ويمكن تخزين الخلايا الثابتة لبضعة أسابيع في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. وينبغي أن يتم إيمونوستينينج في اللحظة الأخيرة.

5-نموذج إعداد (اليوم 3, 5 دقيقة)

  1. وضع مختبرين اتفاق بيئي متعدد الأطراف (pH سيستيميني، م 1، 8.3)، أوكسيديز الجلوكوز (100 x، 50 ملغم/مل)، كاتالاز (500 x، 20 ملغ/مل) في سلة جليد.
  2. إعداد 50 مل من كلوريد الصوديوم تريس المخزن المؤقت (50 مم تريس، 10 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 8) تستكمل مع 10% السكر (100 مغ/مل).
  3. إعداد 1.2 مل من التصوير المخزن المؤقت قبل التصوير مع 10 ملم اتفاق بيئي متعدد الأطراف، أوكسيديز الجلوكوز 0.5 ملغ/مل (75 U/mL)، 40 ميكروغرام/مل كاتالاز (80-200 U/mL) في المخزن المؤقت تريس-كلوريد الصوديوم مع السكر 10%.
  4. جبل ساترة التي تحتوي على الخلايا المسماة على صاحب العينة المغناطيسية (مثل غرفة تشامليدي) وإضافة المخزن المؤقت التصوير لملء تماما من الدائرة. وضع الغطاء على وتأكد من أنه لا يوجد أي فقاعة هواء بين المخزن المؤقت التصوير والغطاء.
  5. تنظيف الجزء السفلي من النموذج مع الإيثانول المطلقة والتحقق من أنه لا يوجد تسرب. استخدام الشحوم بختم صاحب العينة بشكل صحيح إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: إعداد المخزون 1 م حل اتفاق بيئي متعدد الأطراف (pH 8.3 ضبط استخدام HCl) وتقييم أوكسيديز الجلوكوز في 50 ملغ/مل والمخزون من كتالاز في 20 ملغ/مل في المياه، وجعل مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد لاتفاق بيئي متعدد الأطراف، وسنة للغلوكوز أوكسيديز والكاتالاز. عدم إعادة تجميد مختبرين. إعداد المخزن المؤقت تريس-كلوريد الصوديوم مسبقاً وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. قم بإضافة الجلوكوز في يوم التجربة (الخطوة 5، 3).

6-صورة اقتناء (يوم 3، ح ~ 1 كل خلية)

  1. قم بالتبديل في المجهر. التبديل على اقتناء البرمجيات واضغط على بدء تشغيل النظام.
  2. حدد توسيع علامة التبويب اقتناء أداة الإعداد التصوير في المجموعة الأداة "إدارة الإعداد". حدد وضع الليزر WF (حقل واسعة) لاقتناء. حدد هدف 100 س نا 1.46 . حدد وضع TIRF يو-إتش بي الذي يستخدم صيد تلسكوب للحد من مجال الرؤية ويجري مضيئة، وتركيز طاقة الليزر في منطقة صغيرة. تستخدم في أوبتوفار عدسة 1.6 x يعطي حجم بكسل 100nm.
  3. حدد أداة السلاسل الزمنية وإعداد الفاصل الزمني مع إطارات 50 000 و 0.0 مرض التصلب العصبي المتعدد بين الإطارات. توسيع الأداة القنوات في المجموعة أداة المعلمة اقتناء وحدد "إظهار الكل".
  4. تعيين المسار Alexa647: التحقق في 642 و 405 الليزر خطوط للإثارة وقبول لتشغيلها. حدد عامل التصفية "655 ليرة لبنانية" الانبعاثات في الإعداد التصوير. إعادة تسمية "647".
  5. انقر على '+' في الأداة القنوات لإضافة آخر تمرير الضوء وتحديد الوضع "المسار رمز التبديل كل: الإطار" في أداة إعداد التصوير . تحقق 561، 488 وخطوط الليزر 405 وقبول لتشغيلها. حدد "بي بي 570-650 + LP750" الانبعاثات التصفية واستخدام العدسة أوبتوفار 1.6 x. تحقق من أن يتم تحديد الوضع يارثلينك TIRF. قم بإعادة تسمية المسار "555".
  6. حدد أداة وضع الحصول على وتعيين حجم الإطار إلى 200 × 200 بكسل. حدد أداة استراتيجية وأجهزة التركيز وتعيين تركيز محدد للإطارات من 1000 (إذا لم يكن هناك نظام لقفل تركيز).
  7. وضع الزيت على الهدف ووضع العينة. حدد علامة التبويب تحديد موقع ، وفتح مصراع مصباح الأسفار. العثور على التركيز والبحث عن الخلية إلى صورة باستخدام العدسة. وضعه في مركز مجال الرؤية باستخدام الجويستيك.
  8. حدد علامة التبويب اقتناء للعودة إلى وضع اقتناء. حدد المسار "647"، تعيين السلطة 642-الليزر بنسبة 0.2 في المائة، تعيين قوة 405-ليزر إلى 0، تعيين وقت التعرض إلى 50 مللي ثانية والكسب من 50. اختر طريقة اكتساب مستمر لمراقبة الخلية على الشاشة. ضبط التركيز. تأكد من وجود واحد على الأقل تيتراسبيك حبة في مجال الرؤية، وزيادة التباين لرؤية لهم إذا لزم الأمر. استخدام وضع مقياس تلقائي للعرض. تأخذ صورة ابيفلوريسسينسي واسع المجال فيمنتين الشبكة بالنقر فوق المفاجئة وحفظه. للتحقق من الإضاءة TIRF، انقر فوق TIRF، وضبط زاوية الإضاءة و/أو صيد تلسكوب إذا اقتضى الأمر أن يكون حقل متجانس للإضاءة وحفظه.
    ملاحظة: من المهم أن الصور TIRF وابيفلوريسسينت بجودة عالية قبل البدء في الحصول على البيانات الخام. خيوط متقطع، غير موحد المسمى ستؤدي إلى سوء نوعية دستورم الصور.
  9. قم بإلغاء تحديد المسار "647" وحدد والتحقق من المسار "555". تأخذ صورة ابيفلوريسسينسي من شبكة ميكروتوبولي وحفظه. تأخذ صورة TIRF وحفظه أيضا.
  10. قم بإلغاء تحديد المسار "555"، حدد والتحقق من المسار "647"، ثم اضغط على استمرار. وضع الربح إلى 0 وتعيين وقت التعرض للسيدة 10 قوة الليزر 642-نانومتر إلى 100% من أجل ضخ أكثر من الأصباغ Alexa647 للدولة الظلام (~ 2 كيلو واط/سم2). بمجرد فلوروفوريس ابدأ وامض، وضع التعرض إلى 15 مللي ثانية، والحصول على 300. حدد وضع TIRF للإضاءة. استخدام وضع مؤشر مجموعة دون مقياس تلقائي للتحقق من أن إشارات جزيء واحد لا تشبع الكاميرا (المشار إليها باللون الأحمر). في هذه الحالة، تقليل الربح حتى يختفي الإشباع. وستظل الخرز تيتراسبيك المشبعة في بداية اقتناء. اضغط إيقاف لإيقاف المراقبة المستمرة للخلية.
  11. توسيع الأداة على الإنترنت تجهيز والتحقق عبر الإنترنت معالجة النخيل لتصور صورة العاصفة خلال اقتناء. استخدم المعلمات التالية: 9 لأقصى حجم قناع (قطرها 9 بكسل)، و 6 لشدة الذروة للضوضاء. وسوف تحدد المعلمات أطروحات الجزيئات التي تؤخذ في الاعتبار عند المعالجة (مشرق ما فيه الكفاية وعدم التداخل). في أداة PAL-الإحصاءات ، حدد نوع الأرض: الرسم البياني، و "المدرج التكراري المصدر": الدقة. اضغط على البدء في اقتناء.
  12. خلال اقتناء، إعادة تركيز إذا لزم الأمر (إذا لم يكن هناك أي جهاز قفل التركيز). ضبط المعلمات (التعرض، صلاحيات الليزر) والتبديل في نهاية المطاف على السطر 405 نانومتر الليزر (بدءاً من 0.001 ٪) للحفاظ على كثافة متوسطة من فلوروفوريس مع مسافة أدنى من 1 ميكرومتر بين جزيئات مفردة (100 بكسل > 9 نانومتر، وحجم قناع الذروة) ( الشكل 1A-ب). إذا كانت كثافة الجزيء قليلاً عالية جداً، استخدم وضع حلو (ورقة عالية يميل ومغلفة الضوئية) للإضاءة بدلاً من TIRF. وهذا سيزيد طاقة الليزر بنسبة 20%. تأكد من أن ذروة الدقة التعريب في الرسم البياني أدناه الصورة أعيد بناؤها ويتركز حول أو أقل من 10 نانومتر.
    ملاحظة: عادة إنقاص عدد الجزيئات مع مرور الوقت، وزيادة قوة 405 نانومتر الليزر ببطء تبعاً لذلك. والهدف تقليل دقة الترجمة (الرسم البياني المعروض أدناه صورة ذات دقة فائقة) قدر الإمكان مع ذروة أقل من 10 نانومتر (الشكل 1). زيادة تباين الصورة بألم إذا لزم الأمر، إذا كانت حبات مشرقة كثيرة جداً موجودة في الميدان.
  13. اضغط إيقاف لإيقاف الفيلم عندما تم التوصل إلى أكثر من 106 تعريب (عادة بعد الإطارات 40 000). وضع الليزر مرة أخرى إلى 0.2% (642 nm) و 0 (405 nm). حفظ البيانات الخام لاقتناء العاصفة بتنسيق.czi. قم بإلغاء تحديد المسار "647" في الأداة "قنوات"، وحدد والتحقق من المسار "555".
  14. تعيين وقت التعرض إلى 25 مللي ثانية وكسب إلى 0. اضغط على زر مستمر وتعيين الليزر 488 و 561 سواء عند 100% للأصباغ Alexa555 مضخة للدولة الظلام (~ 2 كيلو واط/سم2 كل). مرة واحدة فلوروفوريس بدء وامض، وضع المكسب 250، استخدم وضع الإضاءة حلو والتحقق من أن الجزيئات واحدة لا تشبع الكاميرا مع وضع مؤشر مجموعة. إذا كان هذا هو الحال، انخفاض الربح. اضغط على التوقف. إنقاص قوة 488-ليزر إلى 50%.
  15. اضغط على البدء في اقتناء. خلال اقتناء، تزيد تدريجيا الربح لتكون دائماً في حد التشبع. زيادة خطوة بخطوة قوة 405 نانومتر الليزر للحفاظ كثافة متوسطة من جزيء واحد في مجال الرؤية (انظر الخطوة 6.18). إنقاص قوة الليزر 488 إلى 20-30% عندما يكون الليزر 405 أعلى من 15%. ثم تنخفض تدريجيا 488 مع زيادة خط الليزر 405 بغية الحفاظ على تطرف الجزيئات في أسرع وقت ممكن. خط الليزر 488 مقترنة بالليزر الإثارة 561 في الشدة القصوى يزيد على حد سواء وإيقاف معدلات فلوروفوريس، بينما السطر 405 الليزر إلا يزيد معدل على.
  16. التوقف عن شراء عندما تم التوصل إلى تعريب أكثر من 500 000 (بعد حوالي 20 000 الإطارات) أو أكثر عندما يتم الوميض لا جزيئات أكثر. حفظ البيانات الخام لاقتناء العاصفة بتنسيق.czi.
    ملاحظة: تبدأ دائماً مع طول موجي أعلى لتجنب تبيض (أو تنشيط) للألوان الأخرى. إذ لا مختومة في دائرة تشامليدي، فمن الممكن لتغيير المخزن المؤقت التصوير بصورة منتظمة، مثلاً المخزن المؤقت لمختلف ظروف الاختبار. استخدام خط الليزر 488 إلى استنزاف الأصباغ 555 أليكسا ضروري فقط عند طاقة الليزر 561 محدودة (مع 100 ميغاواط ليزر).

7-صورة إعادة الإعمار (5 دقائق)

  1. في أداة PAL-الانجراف ، استخدم نوع التصحيح المستندة إلى النموذج مع شرائح تلقائي مع حجم الحد أقصى من 8. اضغط تطبيق عدة مرات في صف حتى يتم تصحيح الانحراف. ينطبق هذا التصحيح على أساس نموذج خوارزمية استناداً إلى التحليل عبر الارتباط الذي يقوم بتصحيح الانحراف.
  2. باستخدام أدوات تصفية PAL ، تحسين مظهر الصورة العاصفة بتحديد الجزيئات التي كانت أفضل المترجمة فقط. على سبيل المثال، الحد من دقة الترجمة إلى 30 نانومتر و PSF إلى 120-180 نانومتر.
  3. استخدام دقة بكسل من شمال البحر الأبيض المتوسط 5 أو 10 في أداة تجعل PAL ، فضلا عن وضع عرض ضبابي، مع عامل توسع 1 حدد تجعل PSF. السيارات دينامية مجموعة الموارد البشرية بقيمة 95% وتجعل السيارات الديناميكي فرنك سويسري بقيمة 90%. حدد جودة تقديم أفضل.
  4. حدد تحويل النخيل، النخيل القائمة من علامة التبويب معالجة (الوضع بعد المعالجة). اضغط على اختيار ومن ثم تطبيق. حفظ الصورة التي تم إنشاؤها باستخدام تنسيق. LSM (وليس.czi، هام جداً).
    ملاحظة: يمكن تنفيذ إعادة بناء الصورة مباشرة بعد اكتساب أو الأحدث استخدام طريقة معالجة الصور برنامج اقتناء. في السطر قبالة تجهيز الوضع، من الممكن ريناليزي المداخن مع قيم مختلفة للمعلمات (حجم قناع الذروة، ذروة شدتها إلى الضوضاء). دائماً اختيار "تجاهل تداخل جزيئات" وليس "متوسط قبل التعريب".

8-تقدير دقة الترجمة من صورة العاصفة (10 دقيقة)

  1. فتح البيانات الخام العاصفة واستخدام علامة التبويب تجهيز الصورة حدد الأسلوب النخيل وثم ألم مرة أخرى. اضغط على اختيار.
  2. اضغط تطبيق لبدء إعادة استخدام قناع ذروة حجم 9 وكثافة ذروة للضوضاء 6 (أو المعلمات التي تختارها للصورة).
  3. حدد أداة المستطيل الرسومات ورسم مستطيل في الصورة الخام حول جزيء واحد موجود على سطح الزجاج. عادة ما تكون هناك عدد قليل من الجزيئات واحدة هناك.
  4. وسيتم تحليل صحفي تطبيق مرة أخرى، وإلا الجزيئات الحالية داخل منطقة المستطيل.
  5. في أداة PAL-الإحصاءات ، حدد نوع الأرض: الرسم البياني، و "المدرج التكراري المصدر": X الموقف أو موقف Y، لتصور رسوم بيانية الموقف.
  6. حفظ الجدول بقائمة بتعريب على اليسار أسفل الصور.
  7. استخدام برمجيات لتحليل البيانات، وإنشاء رسوم بيانية X و Y المواقف (الشكل 1).
  8. تناسب التوزيعات قبل ضبابي وحفظ قيمY X و σ σ. ويقدر σ دقة الترجمةسملم (X *σ σY) ^ 0.5.
  9. كرر الخطوة 8.3 8.8 على جزيئات أكبر عدد ممكن ومتوسط σسملم

9-قناة التسجيل (5 دقائق)

  1. فتح صورة العاصفة من كل لون باستخدام البرمجيات فيجي (صورة ي).
  2. حدد أداة العصا لقياس مواقف كل حبات تيتراسبيك.
  3. حساب التحولات X و Y لكل حبة ومتوسط لهم.
  4. استخدم الأمر "ترجمة" ترجمة الصورة الثانية مع المحسوب تحولات X و Y.
  5. دمج الصورتين باستخدام الأمر دمج القنوات.

النتائج

مجهر مزودة بكاميرا 512 × 512، ألفا X Apo خطة 100 50 ميغاواط 405 نانومتر و 100 ميغاواط 488، 561 و 642 نانومتر ليزر الحالة الصلبة، امككد/1.46 الهدف والفرقة تمرير 570-650/طويلة تمرير 655 الانبعاثات مرشحات كان يستخدم للممثل النتائج الواردة أدناه.

يعطي ال...

Discussion

خطوات حاسمة في البروتوكول

نحن الحاضرين هنا بروتوكول الذي يقلل من القطع الأثرية في صور دستورم ميكروتوبوليس والاتحاد في الخلايا الدبقية. يمكن إنشاء القطع الأثرية في كل خطوة من إعداد العينة والتصوير: التثبيت، حجب، إيمونولابيلينج، الانجراف خلال اقتناء، غير أمثل الظ?...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونحن نشكر ليليك ميكائيل، فاكلاريس أوريستيس ونيكولا بورغ لمناقشة مثمرة، أندري اريستوف وايلينا رينسين للحصول على مساعدة تقنية فائقة القرار وسيتارامان شيلاجا للقراءة المتأنية للمخطوطة. ونعترف مع الامتنان ستيش أوتيتشس بيويماجينج الضوئية (إيماجوبولي) من معهد باستور (باريس، فرنسا)، فضلا عن شبكة البنية التحتية بيويماجينج فرنسا تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينسب-04؛ الاستثمارات في المستقبل)، والقارسة ضمور (برنامج Domaine د ' الاهتمام القاهرة-مالينف) لاستخدام المجهر اليرا. أيد هذا العمل مكافحة السرطان الرابطة والوكالة الفرنسية للبحوث الوطنية (ANR-16-CE13-0019).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Minimum Essential Media (MEM)Gibco41090-028cell culture
non essential amino acidGibco1140-050cell culture 1/100e
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122cell culture 1/100e
Fœtal Bovine SerumGibco10270-106cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)Gibco25300-054cell culture
PBS 10xfischer scientific11540486cell culture
coverslip 18 mm n°1,5HMarienfield/Dominic dutsher900556coverslips
paraformaldehyde (PFA) solutionSigmaF8775cell fixation
glutaraldehydeSigmaG5882cell fixation
triton X100SigmaT9284non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)Sigma452904-25MLcell fixation
BSASigmaA7906sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouseSigmaV6630primary antibodies
Rat anti alpha tubulinBioradMCA77Gprimary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555Fisher scientific10635923secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647Fisher scientific10226162secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark redFisher scientificT7279fluorescent beads
Chamlide magnetic chamberLive Cell InstrumentCM-B18-1magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)Sigma30070for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus nigerSigmaG0543for the blinking buffer
glucosesigmafor the blinking buffer
catalase from bovine liverSigmaC9322for the blinking buffer
Tris (trizma)SigmaT1503for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rackSigmaZ688568
ParafilmSigmaP7793-1EAparaffin film
ultrasonic cleanerFisher scientific15-335-6
plasma cleanerHarrick plasmaPDC-32G-2

References

  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved