Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Özet

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için vermektir

Özet

Aktin microfilaments, mikrotübüller ve ara filamentler (Eğer), oluşan sitoiskeleti hücre şekil, polarizasyon ve motilite kontrol önemli bir rol oynar. Aktin ve Mikrotubul ağları organizasyonu kapsamlı eğitim gördü ama bu IFS değil henüz tam olarak karakterize edilir. IFS hücre sitoplazma uzanan bir ağda bir ortalama çapı 10 nm ve formu vardır. Onlar fiziksel olarak aktin ve mikrotübüller moleküler motorlar ve hücre iskeleti halkalı ile ilişkilidir. Bu sıkı ilişki çoğu hücre fonksiyonları için gerekli üç hücre iskeleti ağ koordine Yönetmeliği sağlamak düzenleyici mekanizmaları kalbinde olduğunu. Bu nedenle IFS yalnız ve aynı zamanda ağların her biri diğer hücre iskeleti ile birlikte görselleştirmek önemlidir. Ancak, eğer ağlar, birçok hücre türü, özellikle gliyal hücreler, içinde son derece yoğun çözünürlüğü standart floresan mikroskobu ile ulaşmak çok zor kılan (lateral Görüntü çözünürlüğünün ~ 250 nm). Doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (dSTORM) bir kazanç bir büyüklük yanal çözünürlük sağlayan bir tekniktir. İşte, lateral dSTORM çözünürlüğü yoğun organizasyon Eğer ağlar ve özellikle, eğer demetleri mikrotübüller çevreleyen gidermek için yeterli olduğunu göstermektedir. Böyle sıkı dernek bu iki ağ ve Mayıs koordine yönetmelikte katılmak, açıklamak olasıdır nasıl vimentin IFS şablon Mikrotubul organizasyon stabilize ve Mikrotubul bağımlı veziküler kaçakçılığı etkileyebilir. Daha genel olarak, biz nasıl iki hücre iskeleti bileşeni çift renkli dSTORM tekniği ile gözlenmesi karşılıklı etkileşimlerini içine yeni bir bakış açısı getiriyor gösterir.

Giriş

Sitoplazmik ara filamentler (IFS) 10 nm-çapı homo - ya da eğer proteinlerin hücre türü belirli alt heteropolymers vardır. IFS çok sayıda hücre hareketliliği, yayılmasını önleme ve stres yanıt gibi hücresel işlevler katılmak. Onların önemli rol ile 90'dan fazla insan hastalıkları doğrudan Eğer proteinlerde mutasyonlar neden aslında vurgulanır; Örneğin, eğer bileşiminde değişiklikler tümör büyüme ve^1,2,3yayılan eşlik eder. İşbirliği-e doğru kontrol hücresel fonksiyonları hücre polarizasyon, bölünme ve geçiş^2,3gibi üç sitoiskeleti sistemi çalışmalarında kanıt orada büyüyor. Kayma mimarisi ve işlevler arasında sıkı bir bağlantı olduğundan, bu anlayışı ile diğer filamentler Eğer yapısal organizasyonu içine alın ve hücre iskeleti çapraz-hadis daha iyi anlamak çok önemlidir. Bu makalede süper çözünürlük tekniği çift renkli dSTORM (doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu)⁴ ve arasındaki etkileşimi araştırmak için nasıl kullanıldığına ve mikrotübüller gerçekleştirmek için bir protokol sağlar sabit, kültürlü hücreler 2 boyutlu (2D).

Geçtiğimiz birkaç süper çözümleme teknikleri geliştirilmiştir on yıl ve orada keşifler Nobel Kimya Ödülü kökeni 2014⁵idi. Tüm bu tekniklerin arasında tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri kullanan photoswitchable floresan proteinler, PALM gibi⁶ (Photo-Activated yerelleştirme mikroskobu) fırtına⁷ fluorophores veya dSTORM^{4 çift ile yatıyor} geleneksel fluorophores ile. Tüm bu yöntemler (i) anahtarı floresan gazetecilere çoğunun "kapalı" bir duruma oluşan aynı ilkeye dayanır"(non-floresan), (II) bir alt kümesini bir floresan içine Stokastik aktivasyonu devlet yerelleştirmek için onların uzamsal konumu nanometre doğruluk ve (III) fluorophores mümkün olduğunca çok sayıda alt kümeleri etkinleştirmek için bu işlem tekrarı. Son görüntü etkin moleküllerin ~ 20-40 yanal çözünürlük sağlayan tüm yerelleştirmeler kullanarak yeniden düzenlenir nm. Birkaç ticari optik sistemleri PALM/fırtına izin şimdi biyologlar rutin deneyler için kullanılabilir. Burada, böyle bir sistem mikrotübüller ve IFS yapısal Derneği Eğitim için kullanıldı. Çok ince lamel bölgeleri gözlemlemek için de uygundur çünkü tüm tek molekül yerelleştirme tabanlı yöntemleri arasında çift renkli dSTORM tekniği, seçildi (< 1 µm) yapisan hücre ve görüntü çözünürlüğü ile önemli gelişme sağlayabilir en az zaman ve para yatırım. Gerçekten de, dSTORM hücresel boyama ve ayirt için rutin olarak kullanılan standart organik Boyar maddeler ile uyumlu bir çok uygun ve çok yönlü bir tekniktir.

Bir renk dSTORM görüntüleri fluorophore Alexa647⁸kullanarak elde etmek nispeten basit olmakla birlikte, özellikle ne zaman var sınırlı iki boya düzgün seçilmiş arabellekte yanıp böylece deneysel koşullar optimize etmek için çift renk dSTORM gerektirir lazer güç. Mükemmel kağıtları zaten yöntemlerde çok renkli görüntüleme dSTORM^{9,10,11,12,13}ile ayarlamak için kullanılabilir ve bu belgeleri açıklamak içinde ayrıntı olası kaynakları eser ve bozulmuş görüntü çözünürlüğü yanı sıra nasıl bunların üstesinden. Bu makalede, en iyi deneysel koşullar açısından hücreleri fiksasyon, immunostaining, numune hazırlama, görüntüleme edinme ve görüntü yeniden yapılanma yoğun sitoplazmik Eğer ağlar ve mikrotübüller içinde görüntüleri elde etmek için açıklanmıştır Çift renkli dSTORM gliyal hücrelerle. Kısaca, Chazeau ve ark¹² ' açıklanan çıkarma/fiksasyon yöntemi gliyal hücreler için adapte oldu ve sonrası fiksasyon adım ile en iyi duruma getirilmiş antikorlar konsantrasyon kullanılan, 10 mM ile bir fırtına tampon MEA Dempsey⁹ oldu vd. tarif örnek türü ve deneysel kurmak için en uygun bulunmuştur.

Gliyal hücreler esas olarak hızlı Eğer proteinlerin üç türü: vimentin, testin ve GFAP'nin (gliyal asidik fibrillary protein). Bu üç proteinler astrocytes¹⁴' te ortak polimerize gösterilmiştir. Biz daha önce yapılandırılmış süper çözünürlük aydınlatma mikroskobu (SR SIM) bu üç Eğer proteinler aynı tek Eğer filaman içinde bulunabilir ve bunlar gliyal hücreler ¹⁵dakika içinde benzer dağıtım ve dinamik görüntüler gösterdi. Üç Eğer proteinler arasındaki benzerlikleri nedeniyle vimentin boyama tüm Eğer ağ için muhabir olarak kullanıldı. DSTORM kullanarak, biz nasıl eğer form demetleri kırınım ile mümkün değildi mikrotübüller boyunca mikroskobu teknikleri¹⁵sınırlı gidermek başardı. Bu gözlemler vimentin IFS şablon mikrotübüller nasıl anlayabilirim ve hücre göç¹⁶sırasında bir polarizasyon ekseni bakım teşvik onların büyüme yörünge düzenleyen yardımcı olabilir. Süper çözünürlük fotoğraf anahtar bilgileri iki hücre iskeleti alt sistemlerin karşılıklı etkileşimi üzerinde sağlanan ve kayma Derneği ve hücre tipi belirli¹⁷olabilir yerel işlev arasındaki bağlantıyı bir anlayış getirdi. Genel olarak, iyi immunostaining koşulları yoğunluğu ve özgüllük açısından ulaşmış olması koşuluyla çift renkli dSTORM hücre iskeleti elemanları veya organelleri, diğer türleri arasında çapraz karışma eğitim için kullanılabilir. Bu teknik daha iyi astrogliosis sırasında ve glioblastoma sitoiskeleti değişiklikleri tanımlamak yararlı olacak, burada eğer proteinlerin deyimidir merkez sinir sisteminin en yaygın ve en kötü huylu tümör ^{18 değişmiş ,19,20,21}.

Protokol

1. Coverslips hazırlık (gün 1, 30 dk)

1. 18-mm nº1.5H (+/-5µm 170 µm) cam coverslips plastik bir rafa yerleştirin.
2. Aseton ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL ölçek rafa koymak.
3. Raf mutlak etanol ve 5 min için emmek dolu bir 100 mL kabı aktarın.
4. Ultrasonik temizleyici cihazda kabı yerleştirin ve raf mutlak etanol ile dolu yeni bir 100 mL kabı transfer (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında. "Tarih" basın ve 10 min için bekleyin.
5. Laminar akış başlık altında rafa koymak ve kuru veya filtre uygulanmış hava akımı ile coverslips kuru coverslips yapalım.
6. Coverslips ile raf bir plazma temizleyici cihazı yerleştirdim. Vakum pompası üzerinde geçiş, kapıyı kapat, vakum yapmak ve kısa bir süre sonra temizlendikten sonra plazma 1 dk. kullanım coverslips geçiş için 3 dakika bekleyin. Onları saklamak değil.

2. hücre kaplama (gün 1, 20 dk)

1. Gliyal hücre kültürünü U373 içinde en az gerekli orta (MEM) % 10 Fetal sığır Serum, %1 penisilin-streptomisin ve % 1 gerekli olmayan amino asit ile 10 cm Çap plastik kabında büyümek.
2. 12-şey plakaları laminar akış başlık altında temiz cam coverslips yerleştirin ve Önceden ısıtılmış cep orta iyi başına 1 mL ekleyin.
3. Hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO₂) hücreleri içeren bir tabak al.
4. Orta kaldırın ve 10 mL PBS ekleyin.
5. PBS kaldırın ve 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA.
6. Kuluçka makinesi 2-3 dakika içinde geri çanak yerleştirin.
7. Yemek olarak 37 ° C'de ısıtılmış sıcak orta 10 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.
8. Coverslips içeren 12-şey tabak (hücre ~ 150 µL) kuyuya başına tohum yaklaşık 100 000 hücre.
9. En az 6 h (ya da bir gecede) hücre yayılmasını sağlamak bekleyin.

3. hücre fiksasyon (2 gün, 2 saat)

1. 80 mM borular, 7 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, sitoiskeleti önbellekle hazırlamak ve pH 6,9 için ayarlayın.
2. Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
3. PBS kaldır ve yavaşça çıkarma/fiksasyon çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin (%0.25 oxazolidin, % 0.3 Triton X-100 sitoiskeleti arabelleği) 37 ° C'de ısıtılmış
4. 60 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında.
5. Çözümü kaldır ve yavaşça sitoiskeleti arabellekte seyreltilmiş Önceden ısıtılmış ve taze hazırlanmış %4 PFA (paraformaldehyde) çözüm kuyu başına 1 mL ekleyin.
   Uyarı: Kimyasal başlık altında iş ve eldiven kullanabilirsiniz.
6. 12-şey plaka da kuluçka 37 ° C'de 10 dakika geri koyun.
7. PFA kaldırın ve PBS 3 mL iyi başına ekleyin.
   Not: Eldiven ile kimyasal başlık altında iş ve geri dönüşümlü PFA belirli bir depo gözünde koymak.
8. İki kez PBS ile yıkayın.
9. PBS kaldırın ve oxazolidin gelen autofluorescence gidermek için PBS içinde seyreltilmiş taze hazırlanmış 10 mM NaBH₄ çözüm ekleyin.
10. Oda sıcaklığında 7 min için kuluçkaya.
11. Geri dönüşümlü NaBH₄ belirli bir depo gözünde koymak.
12. Üç kez 5 dk PBS ile yıkayın.
13. PBS kaldırın ve engelleme çözüm (PBS içinde %5 BSA çözelti) ekleyin.
14. Oda sıcaklığında (veya gecede 4 ° C'de) 1 h için kuluçkaya.
    Not: Sitoiskeleti arabellek oda sıcaklığında birkaç ay depolanabilir. İngiltere'de yılın, NaBH₄ ve oxazolidin özel bakım (başlık, eldiven ve belirli geri dönüşüm kutuları) ile ele alınmalıdır. Çözümler eklenir ve yavaşça hücrelerin bütünlüğünü korumak için kaldırıldı. Kuru hücreleri izin önemlidir.

4. Immunostaining (gün 2, 5h)

1. Birincil antikorlar anti-vimentin ve anti-tübülin 1:500 seyreltme engelleme çözümde bulunan kullanılarak çözüm hazırlamak.
2. Seyreltilmiş birincil antikorlar 100 µL damla parafin film tabakası üzerinde koymak ve onları üstüne coverslips hücrelerle aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
3. 2 h. PBS ile coverslips geri bir 12-şey tabak içinde dolu koymak için birincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez.
4. Bu arada, ikincil antikorlar çözüm engelleme çözümde bir 1:1, 000 seyreltme adlı Anti-fare Alexa647 ve anti-sıçan Alexa555 kullanarak hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikorlar içeren hücreleri kuluçkaya. 4.2 gibi devam edin. hücrelerin ışıktan korunması.
5. Coverslip geri PBS ile dolu bir 12-şey plaka koymak. Durulama 5 min her zaman PBS üzerinde bir orbital Çalkalayıcı oda sıcaklığında için üç kez. PBS kaldırmak ve 0.5 mL 0,1 µm tetraspeck boncuk 1 µL ile karışık PBS ekleyin.
6. Wells bir orbital Çalkalayıcı 30 dk. durulama PBS ile koymak. PBS kaldırmak ve hücreleri bir % 4 İngiltere'de yılın çözümde PBS ile 5 min için kuluçkaya. Üç kez PBS durulayın.
   Not: Birkaç hafta içinde PBS 4 ° C'de sabit hücreleri saklanabilir Immunostaining son anda yapılmalıdır.

5. numune hazırlama (gün 3, 5 dk)

1. Aliquots MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glikoz oksidaz (100 x, 50 mg/mL), katalaz (500 x, 20 mg/mL) bir buz sepete koy.
2. Tris-NaCl arabelleği 50 mL hazırlamak (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) glikoz (100 mg/mL) % 10'u ile desteklenmiştir.
3. Arabellek hemen önce 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glikoz oksidaz, 40 µg/mL katalaz (80-200 U/mL) ile görüntülemede görüntüleme 1.2 mL % 10 glikoz Tris-NaCl önbellekle hazırlayın.
4. Manyetik örnek kutusunda (örneğin chamlide odası) etiketli hücreleri içeren coverslip dağ ve tamamen odası doldurmak için görüntüleme tampon ekleyin. Kapak koyun ve hiçbir hava kabarcığı görüntüleme arabellek ve kapak arasında olduğundan emin olun.
5. Mutlak etanol ile örnek alt temiz ve sızıntı olmadığını doğrulayın. Düzgün gerekirse örnek sahibi imzalamaya yağ kullanın.
   Not: MEA çözüm (HCl kullanarak ayarlanır pH 8.3), glikoz oksidaz 50 mg/mL, hisse senedi ve katalaz, 20 mg/mL su stokunun 1 M stok hazırlamak, aliquots yapmak ve bana ve glikoz oksidaz ve katalaz için bir yıl için bir ay için-20 ° C'de depolayabilirsiniz. Aliquots refreeze değil. Tris-NaCl arabellek önceden hazırlamak ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın. Glikoz deney (Adım 5.3) günü ekleyin.

6. resim alma (3. gün, ~ 1h hücre başına)

1. Mikroskobunun geçin. Satın alma yazılımı geçin ve sistem Starttuşuna basın.
2. Satın alma sekmesini genişletme Imaging kurulum aracı Kur Yöneticisi aracını grubunda seçin. Satın alma lazer WF (geniş alan) modunu seçin. 100 X NA 1.46 hedefi seçin. Aydınlatılmış görüş alanı azaltmak için bir kolimatör kullandığı TIRF u-HP modunu seçin ve lazer enerji daha küçük bir alanına konsantre. 100nm piksel boyutunu verir optovar 1.6 x objektif kullanın.
3. Saat serisi aracını seçin ve zaman atlamalı 50 000 çerçeveler ve çerçeveler arasında 0.0 ms ayarlayın. Kanalları aracını edinme parametre araç grubunda genişletin ve "Tümünü göster" seçin.
4. Alexa647 parça ayarla: 642 ve 405 lazer uyarma hatlarında ve bunları açmak için kabul kontrol edin. "655 LP" emisyon filtre Görüntüleme kurulumuseçin. "647" yeniden adlandırın.
5. Tıklayın '+' kanalları aracı başka bir ışık geçişi eklemek ve modu seçin "makas her: çerçeve" Imaging kurulum aracında. 561, 488 ve 405 lazer satırları kontrol edin ve bunları açmak için kabul edin. Seçin "BP 570-650 + LP750" emisyon filtre ve kullanma optovar lens 1.6 x. TIRF-uHP modu işaretli olup olmadığını denetleyin. Parça "555" yeniden adlandırın.
6. Toplama modu aracını seçin ve çerçeve boyutu 200 x 200 piksel olarak ayarlayın. Odak aygıtlar ve strateji aracını seçin ve (Eğer bir odak kilidi sistemi) 1.000 kişi karelere kesin odağı ayarlayın.
7. Petrol hedefte ve örnek koydu. Yerleştirme sekmesini seçin ve floresan lamba çekim açın. Odağı bulmak ve hücrenin mercek kullanarak görüntüye bakın. Joystick kullanarak görüş alanı ortasına koymak.
8. Geri alma moduna gitmek için satın alma sekmesini seçin. "647" dersi seçin, 642-lazer güç %0,2 olarak ayarlarsanız, 405-lazer güç 0 olarak ayarlayın, pozlama süresi 50 ms ve 50 kazanç için ayarla. Hücrenin üstünde belgili tanımlık perde gözlemlemek için sürekli Alım modunu seçin. Odağı ayarlayın. Görüş alanı içinde en az bir tetraspeck boncuk olduğundan emin olun, gerekirse görmek için kontrastı arttırmak. Bir Otomatik ölçek modu için kullanın. Snap tıklatarak vimentin ağ geniş alanlı epifluorescence görüntüsünü almak ve kaydedin. TIRF aydınlatma kontrol etmek için TIRF üzerinde tıklatın, aydınlatma ve/veya Kolimatör açısını aydınlatma homojen bir alanınız ve kaydetmek ayarlayın.
   Not: TIRF ve epifluorescent görüntüleri raw veri toplama başlamadan önce kaliteli olmalarını önemlidir. İş öğelerinin sürekli olmayan, non-birörnek etiketli filamentler neden kalitesiz dSTORM resimlere olmaktadır.
9. "647" parça işaretini kaldırın ve seçin ve "555" parça. Mikrotubul ağ epifluorescence görüntüsünü alın ve kaydedin. TIRF görüntü çekmek ve çok kaydedin.
10. "555" parça işaretini kaldırın, seçin ve "647" parça kontrol ardından süreklibasın. Kazanç 0 olarak koymak ve pozlama süresi 10 Bayan için 642-nm lazer güç Alexa647 boyalar en karanlık durum (~ 2 kW/cm²) pompa için % 100'e ayarlayın. Yanıp sönen fluorophores başladıktan sonra 15 ms maruz koymak ve 300 için kazanç. Aydınlatma TIRF modunu seçin. Olmadan otomatik ölçek aralığı gösterge modu tek molekül sinyalleri (kırmızı renkle gösterilir) kamera emdirmek değil doğrulamak için kullanın. Bu durumda, doygunluk kaybolana kadar kazanç azaltın. Tetraspeck boncuk satın başında doymuş kalacaktır. Hücre sürekli gözlem durdurmak için Dur tuşuna basın.
11. Online işleme Aracı'nı genişletin ve fırtına görüntü alma sırasında görselleştirmek için PALM işleme Online kontrol edin. Aşağıdaki parametreleri kullanın: 9 için en yüksek maskesi boyutu (9 piksel çapı) ve en yüksek yoğunluk gürültü için 6. Tezler parametreleri (örtüşen yeterince parlak ve değil) işleme dikkate alınıp molekülleri tanımlayabilirsiniz. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafikve çubuk grafik kaynak: hassas. Satın alma Başlattuşuna basın.
12. Satın alma sırasında gerekirse (hiçbir odak kilidi aygıt varsa) yönlendirmesi. (Pozlama, lazer gücü) parametrelerini ayarlamak ve sonunda (%0,001 fluorophores bir Orta yoğunluk 1 µm tek molekül arasında en az bir mesafe ile tutmaya başlayan) 405 nm lazer çizgi geçiş (> 9 piksel 100 nm, tepe maskesi boy) ( Şekil 1A-B). Molekül yoğunluğu biraz çok yüksek ise, TIRF yerine aydınlatma HILO (son derece eğimli ve lamine optik levha) modunu kullanın. Bu lazer güç % 20 oranında artacak. Yeniden oluşturulan resmi aşağıda histogramı yerelleştirme hassas zirvesine çevresinde veya altında 10 ortalanır emin olun nm.
    Not: Genellikle zamanla molekülleri sayısını azaltır ve 405 nm lazer gücü yavaş yavaş buna göre artar. Yerelleştirme duyarlık (süper çözümleme görüntüsünün altında görüntülenen çubuk grafik) altında 10 bir tepe ile mümkün olduğu kadar azaltmak için hedeftir nm (şekil 1 c). Gerekirse, çok fazla parlak boncuk alanında varsa PALM resmin zıtlığını artırın.
13. 10'dan fazla⁶ yerelleştirmeler (genellikle 40 000 kare sonra) ulaştığında film durdurmak için Dur tuşuna basın. Lazerler %0,2 geri koymak (642 nm) ve 0 (405 nm). Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin. Parça "647" kanalları aracında, işaretini kaldırın ve seçin ve parça "555".
14. Pozlama süresi için 25 ms ayarlayın ve 0'a kazanç. Sürekli düğmesine basın ve pompa Alexa555 boyalar karanlık durumuna (~ 2 kW/cm² her) için % 100 488 ve 561 lazerler ayarla. Yanıp sönen, kazanç 250 için koymak fluorophores başladıktan sonra HILO aydınlatma modu kullanın ve tek molekülleri kameranın ölçüm göstergesi modu ile emdirmek değil olduğunu kontrol edin. Bu durumda, kazanç azaltın. Durtuşuna basın. 488-lazer gücü % 50 azaltmak.
15. Satın alma Başlattuşuna basın. Satın alma sırasında giderek her zaman doygunluk limitte olmak kazanç artırın. Adım adım tek molekül bir Orta yoğunluk görüş alanı içinde (bkz: adım 6,18) tutmak için 405 nm lazer gücünü arttırın. 405 lazer 15 daha yüksek olduğunda % 20-30 488 lazer gücü azaltın. Sonra yavaş yavaş 488 molekülleri mümkün olduğunca hızlı yanıp sönen tutmak için 405 lazer çizgi artırırken azaltın. 405 lazer çizgi sadece üzerinde oranını artırır, ancak maksimum yoğunluk, 561 uyarma lazer ile birleştiğinde 488 lazer çizgi hem açık hem de kapalı fluorophores oranda artırır.
16. Yok daha fazla molekül yanıp fazla 500 000 yerelleştirmeler (yaklaşık 20 000 kare sonra) ulaştığında satın alma ya da daha fazla durdurur. Fırtına Alım ham veri .czi biçimiyle kaydedin.
    Not: Her zaman diğer renkler (veya etkinleştirme) ağartma önlemek için daha yüksek dalga boyu ile başlar. Chamlide odası kapalı değil beri görüntüleme arabelleğin düzenli olarak, örneğin değiştirmek mümkündür farklı tampon koşullarda test etmek için. Alexa 555 boyalar tüketmek için 488 lazer çizgi kullanarak yalnızca 561 lazer güç (100 mW lazer ile) sınırlı olduğunda gereklidir.

7. resim yeniden yapılanma (5 dk)

1. PAL-Drift Aracı'nda, 8 en fazla olacak boyutunu ile otomatik parçalarla modeli tabanlı düzeltme türünü kullanın. Drift düzeltilene kadar Uygula birkaç kez üst üste basın. Bu modeli tabanlı düzeltme drift düzeltir çapraz korelasyon analizi üzerinde alan bir algoritma uygular.
2. PAL-filtresi araçlarını kullanarak, fırtına görüntünün görünümünü hangi en iyi lokalize molekülleri seçerek geliştirin. Örneğin, 30 Yerelleştirme kesinlik sınırı nm ve 120-180 nm için PSF.
3. Piksel çözünürlüğe sahip 5 veya 10 nm PAL-render aracın yanı sıra bir Gauss görüntüleme modu, bir genişleme faktörü 1 seçin PSF Render auto dinamik alan HR %95 değeri ve Render auto dinamik alan SWF %90 değeri ile kullanın. Render en iyi Kalite'yi seçtiğinizde.
4. PALM dönüştürmek, işleme sekmesi (son işlem modu) PALM menüsünden seçin. Seçin ve ardından Uygulatuşuna basın. Oluşturulan görüntü ile bir biçimde kaydedin. LSM (ve değil .czi, çok önemli).
   Not: Görüntü yeniden hemen satın alma veya sonraki satın alma yazılımı görüntü işleme modunu kullanarak sonra gerçekleştirilebilir. İşlem modu sonrası kapalı hattında yığınlar parametreleri (en yüksek maskesi boyutu, gürültü en yüksek yoğunluk) farklı değerlerle yeniden Çözümle mümkündür. Her zaman "örtüşen molekülleri atmak" ve "yerelleştirme önce ortalama değil" seçin.

8. bir fırtına görüntü (10 dakika) yerelleştirme duyarlığını tahmini

1. Fırtına ham veri açın ve görüntü işleme sekmesini PALM yöntem ve sonra PALM tekrar kullanın. Seçtuşuna basın.
2. 9 ve 6 (veya görüntü için seçtiğiniz parametreleri) gürültü için en yüksek yoğunluk en yüksek maskesi boyutunu kullanarak yeniden başlatmak için Uygula tuşuna basın.
3. Dikdörtgen grafik aracını seçin ve raw görüntü tek bir molekül cam yüzeyinde mevcut çevresinde bir dikdörtgen çizin. Genellikle bir kaç tek molekülleri orada vardır.
4. Basın Uygula tekrar ve yalnızca dikdörtgen bölgesini içine mevcut molekülleri incelenecek.
5. PAL-istatistik Aracı'nda, çizim türünü seçin: çubuk grafik ve çubuk grafik kaynak: X pozisyon ya da pozisyon histogramlar görselleştirmek için Y konumu.
6. Görüntüleri aşağıda solda yerelleştirmeler listesi ile tabloyu kaydedin.
7. Veri analizi, bir yazılım kullanarak oluşturmak histogramlar x ve Y konumları (şekil 1 d).
8. Dağıtımları bir Gauss tarafından uygun ve σ_X ve σ_Y değerlerini kaydedin. Yerelleştirme hassas σ_SMLM (σ_{X *}σ tarafından_Y) tahmini ^ 0,5.
9. Mümkün olduğunca çok sayıda molekülleri üzerinde 8.3-8.8 adımı yineleyin ve σ_SMLM ortalama

9. kanal kayıt (5 dk)

1. Fiji (görüntü J) yazılımını kullanarak her renkte fırtına görüntüyü açın.
2. Her tetraspeck boncuk konumlarını ölçmek için Değnek aracını seçin.
3. Her boncuk X ve Y tıklatınÇağrı hesaplamak ve onları ortalama.
4. İkinci görüntü ile hesaplanan çevirmek için "Tercüme" komutunu kullanın X ve Y vardiya.
5. Kanalları Birleştir komutunu kullanarak iki resim birleştirme.

Sonuçlar

Mikroskop 512 x 512 kamera, bir alfa planı Apo 100 X 50 mW 405 nm ve 100 mW 488, 561 ve 642 nm katı hal lazerleri, bir EMCCD ile donatılmış / 1,46 objektif ve grubu 570-650 Pass / uzun 655 emisyon filtreler geçiş temsilcisi sonuçları aşağıda sunulan için kullanıldı.

Şekil 1A raw resim alma sırasında kullanılması gereken gürültü oranı sinyal ve molekül yoğunluğu bir örnek ...

Tartışmalar

İletişim kuralı kritik adımlar

Burada hangi mikrotübüller dSTORM görüntülerini eserleri ve IFS gliyal hücreler içinde en aza indirgemek bir iletişim kuralı mevcut. Eserler numune hazırlama ve görüntüleme her adımda oluşturulan: engelleme, fiksasyon, immunolabeling, drift satın alma sırasında uygun olmayan yanıp sönen koşulları²³. Biz en kritik adımları listelenmektedir.

Coverslips temizlik fluoroph...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2