Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

Résumé

L’objectif global de cette méthodologie est de donner les conditions expérimentales optimales de préparation des échantillons pour l’acquisition d’images et de la reconstruction afin d’effectuer des images dSTORM 2D bicolore des microtubules et des filaments intermédiaires dans les cellules fixes

Résumé

Le cytosquelette, composé de microfilaments d’actine et les microtubules filaments intermédiaires (si), joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la polarité et la motilité. L’Organisation des réseaux actine et les microtubules a été particulièrement étudiée, mais celui d’IFs n’est pas encore pleinement caractérisée. IFs ont un diamètre moyen de 10 nm et forme un réseau s’étendant dans tout le cytoplasme de la cellule. Ils sont physiquement associés d’actine et les microtubules grâce à des moteurs moléculaires et linkers du cytosquelette. Cette association étroite est au cœur des mécanismes de réglementation qui assurent la régulation coordonnée des trois réseaux du cytosquelette requis pour la plupart des fonctions cellulaires. Il est donc indispensable de visualiser IFs seuls et aussi avec chacun des autres réseaux du cytosquelette. Cependant, les réseaux de IF sont extrêmement denses dans la plupart des types de cellules, en particulier dans les cellules gliales, qui rend sa résolution très difficile à réaliser avec la microscopie en fluorescence standard (latéral résolution de ~ 250 nm). Microscopie de Reconstruction stochastique optique directe (dSTORM) est une technique qui permet un gain en résolution latérale d’un ordre de grandeur. Ici, nous montrons que la résolution latérale dSTORM est suffisante pour résoudre l’organisation dense des réseaux IF et, en particulier, des faisceaux de IF entourant les microtubules. Serré de ces associations sont susceptible de participer à la régulation coordonnée de ces deux réseaux et mai, expliquer comment modèle IFs vimentine et stabiliser l’Organisation des microtubules ainsi que pourraient influencer microtubule dépendant du trafic vésiculaire. Plus généralement, nous montrons comment l’observation des deux composants du cytosquelette avec bicolores dSTORM technique apporte nouvel aperçu de leur interaction mutuelle.

Introduction

Les filaments intermédiaires cytoplasmiques (IFs) sont 10 nm de diamètre homo - ou hétéropolymères d’un sous-ensemble spécifique de type cellulaire des protéines de l’IF. IFs participent dans une large gamme de fonctions cellulaires telles que les réponses de stress, la prolifération et la motilité cellulaire. Leur rôle essentiel est souligné par le fait que plus de 90 maladies humaines sont directement causées par des mutations dans les protéines de l’IF ; par exemple, les changements dans la composition de l’IF accompagne la croissance tumorale et la diffusion de^1,2,3. Il est plus en plus évident que les trois systèmes de cytosquelette travaillent en collaboration pour contrôler les fonctions cellulaires tels que la polarisation de la cellule, division et migration^2,3. Étant donné qu’un couplage étroit entre l’architecture spatiale et fonctions, il est crucial d’obtenir des aperçus de la structure de l’organisation de la fi avec les autres filaments et mieux comprendre la diaphonie du cytosquelette. Cet article fournit un protocole pour effectuer la Super-résolution technique dSTORM bicolores (stochastique optique Reconstruction examen microscopique direct)⁴ et comment il est utilisé pour étudier l’interaction entre le si et les microtubules en fixe, cultivés cellules en 2 dimensions (2D).

Plusieurs techniques de Super-résolution ont été développées au cours de la dernière décennie et là-bas découvertes furent à l’origine du prix Nobel de chimie en 2014⁵. Parmi toutes ces techniques se trouve les seule molécule axées sur la localisation des méthodes comme PALM⁶ (microscopie de localisation Photo-Activated) qui utilise des protéines fluorescentes ayant, tempête de⁷ paires de fluorophores ou dSTORM⁴ avec des fluorophores classiques. Toutes ces méthodes sont basées sur le même principe qui consiste en (i) l’interrupteur de la plupart des journalistes fluorescentes dans un état « off » » l’état de (non fluorescent), (ii) l’activation stochastique d’une partie d'entre eux dans un fluorescent afin de localiser leurs position spatiale avec précision nanométrique et (iii) la répétition de ce processus afin d’activer autant de sous-ensembles de fluorophores que possible. Une image finale est reconstruite à l’aide de toutes les localisations des molécules activées, offrant une résolution latérale vers le bas pour ~ 20 à 40 nm. Plusieurs systèmes optiques commercialisés permettant PALM/STORM sont maintenant disponibles pour les biologistes pour expériences de routine. Ici, un tel système a été utilisé pour étudier l’association structurelle des microtubules et IFs. Parmi toutes les molécules simples axées sur la localisation méthodes, la technique de double-couleur dSTORM a été choisie, parce qu’il est bien adapté pour l’observation des régions lamellaires très minces (< 1 µm) des cellules adhérentes et peut apporter une amélioration significative de la résolution de l’image avec investissement minimal de temps et d’argent. En effet, dSTORM est une technique très pratique et polyvalente qui est compatible avec les colorants organiques standards couramment utilisées pour la coloration cellulaire et immunofluorescence.

Alors qu’une seule couleur dSTORM images sont relativement simples à obtenir en utilisant le fluorophore Alexa647⁸, dSTORM bicolore nécessite d’optimiser les conditions expérimentales afin que deux colorants peuvent clignoter correctement dans le tampon choisi, surtout si il est limité puissance du laser. Excellentes communications sont déjà disponibles sur les méthodes à mettre en place l’imagerie multicolore avec dSTORM^{9,10,11,12,13}, et ces documents expliquent en détail les sources possibles de artefacts et la résolution de l’image dégradée ainsi que la façon de les surmonter. Dans cet article, les conditions expérimentales optimales en ce qui concerne la fixation des cellules, immunomarquage, préparation des échantillons, acquisition d’imagerie et la reconstruction de l’image sont décrits afin d’acquérir des images des réseaux denses de IF cytoplasmiques et microtubules dans cellules gliales avec dSTORM bicolores. En bref, la méthode d’extraction/fixation décrite à Chazeau et al.¹² a été adaptée aux cellules gliales et utilisé avec une étape après fixation, concentration d’anticorps optimisée, un tampon de tempête avec 10 mM MEA décrit dans Dempsey⁹ et coll., qui a été jugées optimales pour l’expérimental mis en place et le type d’échantillon.

Les cellules gliales expriment principalement trois types de protéines IF : vimentine, nestin et GFAP (glial protéine fibrillaire acide). Ces trois protéines ont été montrés à polymériser conjointement dans les astrocytes¹⁴. Nous avons montré précédemment à l’aide de la microscopie d’illumination de Super-résolution structurée (SR SIM) que ces trois protéines IF se trouve dans le même filament unique de IF et qu’ils affichent semblables de distribution et de la dynamique dans les cellules gliales ¹⁵. En raison des similitudes entre les trois protéines IF, vimentine coloration a été utilisée comme reporter pour l’ensemble du réseau IF. À l’aide de dSTORM, nous avons réussi à résoudre Comment former des faisceaux IF le long des microtubules, qui n’était pas possible avec la diffraction limitée des techniques de microscopie¹⁵. Ces observations peuvent aider à comprendre comment la vimentine IFs peuvent microtubules modèle et réglementer leur trajectoire de croissance, favorisant le maintien d’un axe de polarité au cours de la migration de cellules¹⁶. Images de Super-résolution fourni des informations clées sur l’interaction mutuelle des deux sous-systèmes du cytosquelette et amené à mieux comprendre le lien entre l’association spatiale et la fonction locale qui pourrait être de type cellulaire spécifique¹⁷. En général, bicolores dSTORM peut servir à étudier la diaphonie entre les éléments du cytosquelette ou autres types d’organites, pourvu que l’immunomarquage bonnes conditions sont atteintes en termes de densité et de la spécificité. Cette technique sera utile pour mieux caractériser les cytosquelette des changements observés au cours de l’astrogliosis et dans le glioblastome, la tumeur plus malins et les plus courants du système nerveux central, où l’expression des protéines de l’IF est modifié ^{18 ,19,20,21}.

Protocole

1. couvre-objet en préparation (1 jour, 30 min)

1. Placez les lamelles de verre de 18 mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) sur une grille en plastique.
2. Mettre le panier dans un bécher de 100 mL rempli d’acétone et laisser tremper pendant 5 min.
3. Transférer la crémaillère dans un bécher de 100 mL rempli d’éthanol absolu et laisser tremper pendant 5 min.
4. Transférer la crémaillère dans un bécher de 100 mL nouveau rempli avec de l’éthanol absolu et placer le bécher dans un dispositif de nettoyeur à ultrasons (voir Table des matières) à température ambiante. Appuyez sur « on » et attendez pendant 10 min.
5. Le panier sous une hotte à flux laminaire et laisser les lamelles sécher ou séchez les lamelles couvre-objet avec flux d’air filtré.
6. Mettre le panier avec les lamelles dans un dispositif plus propre au plasma. Mettre en marche la pompe à vide, fermez la porte, attendez 3 min faire le vide et allumez le plasma pendant 1 min. utilisation du couvre-objet en peu de temps après le nettoyage. Ne pas les entreposer.

2. cellule électrodéposition (1 jour, 20 min)

1. Cultiver la lignée de cellules gliales U373 dans le moyen essentiel Minimum (MEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % la pénicilline-streptomycine et 1 % non essentiels acides aminés en Pétri en plastique de 10 cm de diamètre.
2. Placez les lamelles de verre propre en plaques de 12 puits sous la hotte à flux laminaire et ajouter 1 mL de milieu préchauffé cellules par puits.
3. Prendre un plat contenant des cellules de l’incubateur de cellules (37 ° C, 5 % de CO₂).
4. Enlever le milieu et ajouter 10 mL de PBS.
5. Retirez le PBS et ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA.
6. Remettre le plat dans l’incubateur pendant 2-3 min.
7. Ajouter 10 mL de milieu chaud préalablement chauffé à 37 ° C sur le plat et remettre les cellules en suspension.
8. Semences environ 100 000 cellules / puits (~ 150 µL de cellules) dans les plaques de 12 puits contenant les lamelles couvre-objet.
9. Attendre au moins 6 h (ou toute une nuit) permettre la propagation de la cellule.

3. fixation cellules (jour 2, 2h)

1. Préparer le tampon du cytosquelette avec tuyaux de 80 mM, 7 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl et ajuster le pH à 6,9.
2. Laver les cellules une fois avec du PBS.
3. Retirez le PBS et doucement ajouter 1 mL par puits de solution d’extraction/fixation (glutaraldéhyde à 0,25 %, 0,3 % Triton X-100 dans le tampon du cytosquelette) préalablement chauffé à 37 ° C.
4. Incuber pendant 60 s à température ambiante.
5. Enlever la solution et ajouter doucement 1 mL par puits de préchauffé et fraîchement préparée 4 % solution PFA (paraformaldéhyde) diluée dans le tampon du cytosquelette.
   Mise en garde : Utilisez des gants et travailler sous la hotte chimique.
6. Replacez la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37° C pendant 10 min.
7. Retirez la PFA et ajouter 3 mL de PBS / puits.
   Remarque : Travailler sous la hotte chimique avec des gants et mettre la PFA recyclé dans un bac spécifique.
8. Laver deux fois avec du PBS.
9. Supprimez les PBS et solution fraîchement préparée de 10 mM NaBH₄ diluée dans du PBS pour étancher l’autofluorescence venant de glutaraldéhyde.
10. Incuber pendant 7 min à température ambiante.
11. Mettre le recyclé NaBH₄ dans un bac spécifique.
12. Laver trois fois 5 min avec du PBS.
13. Retirer le PBS et ajouter la solution de saturation (solution à 5 % de BSA dans du PBS).
14. Incuber pendant 1 heure à température ambiante (ou toute la nuit à 4 ° C).
    Remarque : Le tampon du cytosquelette peut être stocké à température ambiante pendant quelques mois. PFA, NaBH₄ et glutaraldéhyde doivent être manipulés avec soin (cagoule, des gants et des bacs de recyclage spécifiques). Des solutions doivent être ajoutées et supprimées doucement afin de préserver l’intégrité des cellules. Il est important de ne pas laisser les cellules sèches.

4. Immunostaining (jour 2, 5h)

1. Préparer la solution d’anticorps primaires avec une dilution de 1/500 dans la solution de blocage anti-vimentine et anti-tubuline.
2. Mettez 100 gouttes µL d’anticorps primaires dilués sur une couche de film de paraffine et placez les lamelles au-dessus d’eux avec des cellules vers le bas.
3. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant 2 h. Mettez les lamelles dans une assiette de 12 puits remplis avec du PBS. Rincer trois fois pendant 5 min chaque fois dans du PBS à température ambiante dans un agitateur orbital.
4. Pendant ce temps, préparer la solution d’anticorps secondaires à l’aide de anti-souris Alexa647 et anti-rat Alexa555 à une dilution d’un 1:1, 000 dans la solution de blocage. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Procéder comme 4.2. protéger les cellules contre la lumière.
5. Remettre le couvre-objet dans une plaque de 12 puits remplie de PBS. Rincer trois fois pendant 5 min chaque fois dans du PBS à température ambiante dans un agitateur orbital. Retirer le PBS et ajouter 0,5 mL de PBS mélangés avec 1 µL de 0,1 µm tetraspeck perles.
6. Mettre les puits dans un agitateur orbital pendant 30 min. rincer avec du PBS. Retirez le PBS et incuber les cellules pendant 5 min avec une solution PFA de 4 % dans du PBS. Rincer trois fois dans du PBS.
   Remarque : Les cellules fixes peuvent être conservés pendant quelques semaines dans du PBS à 4° C. Immunomarquage doit être effectué à la dernière minute.

5. préparation (jour 3, 5 min)

1. Mettre des parties aliquotes de MEA (cystéamine, 1 M, pH 8.3), la glucose oxydase (100 x, 50 mg/mL), catalase (500 x, 20 mg/mL) dans un panier de glace.
2. Préparer 50 mL de tampon Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) additionné de 10 % de glucose (100 mg/mL).
3. Préparer 1,2 mL d’imagerie tampon juste avant l’imagerie avec 10 mM MEA, glucose oxydase de 0,5 mg/mL (75 U/mL), 40 catalase µg/mL (80-200 U/mL) dans du tampon Tris-NaCl avec 10 % de glucose.
4. Monter la lamelle contenant les cellules marquées sur le porte-échantillon magnétique (par exemple chamlide chambre) et ajouter le tampon d’imagerie pour remplir entièrement la chambre. Mettre le couvercle et assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air entre le tampon de l’imagerie et le couvercle.
5. Nettoyer le fond de l’échantillon avec de l’éthanol absolu et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite. Utiliser de graisse pour sceller le porte-échantillon correctement si nécessaire.
   Remarque : Préparation 1 M stock de solution MEA (pH 8,3 ajusté à l’aide de HCl), stock de glucose oxydase à 50 mg/mL et stock de catalase à 20 mg/mL dans l’eau, faire aliquotes et stockez-les à-20 ° C pour environ un mois pour MEA et un an pour la glucose-oxydase et catalase. Ne recongelez pas les parties aliquotes. Préparer le tampon Tris-NaCl à l’avance et les conserver à température ambiante pendant plusieurs mois. Ajouter le glucose sur le jour de l’expérience (étape 5.3).

6. l’acquisition (jour 3, ~ 1h par cellule)

1. Allumez le microscope. Mettre en marche le logiciel d’acquisition et appuyez sur Start système.
2. Sélectionnez l’Acquisition Tab. Expand l’outil d’Installation d’imagerie dans le groupe d’outils de gestion d’installation. Sélectionnez le mode laser WF (grand champ) d’acquisition. Sélectionner l’objectif 100 X NA 1,46 . Sélectionner le mode de La FRBR u-HP qui utilise un collimateur pour réduire le champ de vision étant illuminé et concentrer l’énergie du laser dans une zone plus petite. Utilisez l’optovar objectif 1.6 × qui donne une taille de pixel de 100nm.
3. Sélectionnez l’outil de séries temporelles et mis en place le laps de temps de 50 000 cadres et 0.0 ms entre les cadres. Développez l’outil de canaux dans le groupe d’outils Acquisition paramètre et sélectionnez « Afficher tout ».
4. La voie Alexa647 : Vérifiez le 642 et 405 lignes pour excitation au laser et accepter de les allumer. Sélectionnez le filtre d’émission « 655 LP » dans le Setup d’imagerie. Renommez « 647 ».
5. Cliquez sur « + » dans l’outil de canaux pour ajouter une autre lumière passe, puis choisissez le mode « commutateur piste chaque : cadre » dans l’outil D’installation d’imagerie . Vérifiez 561, 488 et lignes laser 405 et accepter de les allumer. Sélectionnez le « BP 570-650 + LP750 » émission filtrer et utiliser optovar lentille 1,6 x. Vérifiez que le mode de la FRBR-uHP est sélectionné. Renommez la piste « 555 ».
6. Sélectionnez l’outil mode d’Acquisition et la taille de l’image de 200 x 200 pixels. Sélectionnez l’outil de stratégie et dispositifs de mise au point , puis affectez-lui la mise au point définitive de 1 000 images (s’il y a un système de verrouillage de la mise).
7. Mettre l’huile sur l’objectif et mettre l’échantillon sur. Sélectionnez l’onglet Rechercher et ouvrir l’obturateur de la lampe à fluorescence. Recherchez la mise au point et la cellule d’image à l’aide de l’oculaire. Mettez-le dans le centre du champ de vision à l’aide de la manette.
8. Sélectionnez l’onglet Acquisition pour revenir au mode d’acquisition. Sélectionner la piste « 647 », sélectionner la puissance de 642-laser à 0,2 %, régler la puissance de 405-laser à 0, définissez la durée d’exposition à 50 ms et le gain de 50. Choisissez le mode d’acquisition continue d’observer la cellule sur l’écran. Ajuster la mise au point. Assurez-vous qu’il y a au moins une bille de tetraspeck dans le champ de vision, augmenter le contraste pour voir si nécessaire. Utiliser un mode d’échelle automatique pour l’affichage. Prendre une image grand champ épifluorescence du réseau vimentine en cliquant sur Aligner , puis enregistrez-le. Pour vérifier l’éclairement de la FRBR, cliquez sur FRBR, régler l’angle d’éclairage et/ou de collimateur si nécessaire d’avoir un champ homogène de l’éclairement et enregistrez-le.
   Remarque : Il est important que les images de la FRBR et épifluorescente sont de haute qualité avant de commencer l’acquisition de données brutes. Filaments discontinus et non uniformément marqués donnera lieu aux images de qualité médiocre dSTORM.
9. Décochez la piste « 647 » et sélectionnez Vérifier la piste « 555 ». Prendre une image de fluorescence incidente du réseau de microtubules et enregistrez-le. Prendre une image de la FRBR et enregistrez-le trop.
10. Décochez la piste « 555 », sélectionnez et vérifier la piste « 647 », puis appuyez sur continu. Mettre le gain à 0 et durée d’exposition à Mme 10 régler la puissance de laser 642 nm à 100 % pour la plupart des colorants Alexa647 de pompe à l’État foncé (~ 2 kW/cm²). Une fois les fluorophores commence à clignoter, Enfilez l’exposition à 15 ms et gagner à 300. Sélectionnez le mode de la FRBR d’illumination. Utilisez le mode indicateur de gamme sans échelle automatique afin de vérifier que les signaux seule molécule ne pas saturent la caméra (indiquée par la couleur rouge). Dans ce cas, diminuer le gain jusqu'à ce que disparaisse la saturation. Tetraspeck perles resteront saturées au début de l’acquisition. Appuyez sur arrêter pour arrêter l’observation continue de la cellule.
11. Développer l’outil en ligne de traitement et vérifier en ligne traitement PALM pour visualiser l’image de tempête au cours de l’acquisition. Utilisez les paramètres suivants : 9 pour la taille de masque Peak (diamètre de 9 pixels) et 6 pour le pic d’intensité au bruit. Paramètres de thèses définira les molécules qui sont pris en compte dans le traitement (assez lumineux et non superposition). Dans l’outil PAL-statistiques , sélectionnez le type de tracé : histogrammeet histogramme Source : précision. Appuyez sur Start acquisition.
12. Lors de l’acquisition, recentrer si nécessaire (si il n’y a aucun dispositif de verrouillage de la mise). Ajuster les paramètres (exposition, puissances de laser) et finalement passer la ligne 405 nm laser (commençant à 0,001 %) maintenir une densité moyenne de fluorophores avec une distance minimale de 1 µm entre molécules simples (> 9 pixels de 100 nm, la taille du masque Peak) ( Figure 1 a-B). Si la densité de la molécule est un peu trop élevée, utilisez le mode de HILO (feuille très incliné et stratifié optique) d’illumination au lieu de la FRBR. Cela augmentera la puissance de laser de 20 %. S’assurer que la pointe de la précision de localisation sur l’histogramme ci-dessous l’image reconstituée est centrée autour ou inférieure à 10 nm.
    Remarque : Le nombre de molécules diminue habituellement avec le temps, et la puissance de 405 nm laser est augmentée lentement en conséquence. Le but est de diminuer la précision de localisation (histogramme affichée sous l’image de Super-résolution) autant que possible avec un pic inférieur à 10 nm (Figure 1). Augmenter le contraste de l’image PALM, le cas échéant, si trop de perles brillantes sont présentes sur le terrain.
13. Appuyez sur arrêter pour arrêter le film lorsque plus de 10⁶ localisations ont été atteints (généralement après de 40 000 images). Mettre les lasers à 0,2 % (642 nm) et 0 (405 nm). Enregistrer les données brutes de l’acquisition de tempête avec le format .czi. Décochez la case piste « 647 » dans l’outil de canaux et sélectionnez Vérifier la piste « 555 ».
14. Définir la durée d’exposition à 25 ms et gagner à 0. Appuyez sur le bouton continue et régler les lasers 488 et 561 à 100 % aux colorants Alexa555 pompe à l’État foncé (~ 2 kW/cm² chacun). Une fois les fluorophores commence à clignoter, mettre le gain à 250, utilisez le mode d’éclairage de HILO et vérifiez que les molécules simples ne pas saturent la caméra avec le mode indicateur de portée. Si tel est le cas, diminuer le gain. Appuyez sur arrêter. Diminuer la puissance de 488-laser à 50 %.
15. Appuyez sur Start acquisition. Lors de l’acquisition, augmenter progressivement le gain pour toujours être à la limite de saturation. Augmenter progressivement la puissance du laser de 405 nm pour garder une densité moyenne de la molécule unique dans le champ de vision (Voir l’étape 6.18). Diminuer la puissance de 488 laser à 20-30 % quand le laser 405 est supérieure à 15 %. Puis diminuer progressivement les 488 tout en augmentant la ligne 405 laser afin de garder le clignotement des molécules aussi vite que possible. La ligne 488 laser couplée avec le laser de 561 excitation à intensité maximale augmente la sur piste et sur les tarifs des fluorophores, alors que la ligne 405 laser ne fait qu’accroître le taux sur.
16. Arrêter l’acquisition lorsque plus de 500 000 localisations ont été atteints (après environ 20 000 cadres) ou plus lorsque aucun plus de molécules ne clignotent. Enregistrer les données brutes de l’acquisition de tempête avec le format .czi.
    Remarque : Commencez toujours par la longueur d’onde plus élevée afin d’éviter le blanchiment (ou activation) des autres couleurs. Étant donné que la chambre de chamlide n’est pas étanche, il est possible de changer le tampon d’imagerie régulièrement, par exemple pour tester des conditions différentes de tampon. À l’aide de la ligne 488 laser pour épuiser les colorants Alexa 555 est nécessaire uniquement lorsque la puissance du 561 laser est limitée (avec lasers à 100 mW).

7. image reconstruction (5 min)

1. Dans l’outil PAL-Drift , utilisez le type de correction basée sur des modèles avec des segments automatiques avec une taille maximale de 8. Appuyez sur appliquer plusieurs fois de suite jusqu'à ce que la dérive est corrigée. Cette correction basée sur des modèles s’applique un algorithme basé sur l’analyse de corrélation croisée qui corrige la dérive.
2. Grâce aux outils PAL-filtre , améliorer l’apparence de l’image de tempête en sélectionnant seulement les molécules qui ont été mieux localisées. Par exemple, limitent la précision de localisation à 30 nm et les fibres discontinues de polyesters à 120-180 nm.
3. Utilisez une résolution de pixels de 5 ou 10 nm dans l’outil PAL-rendu , mais aussi un mode d’affichage gaussienne, avec un facteur d’expansion de 1 polyesters. Sélectionnez rendre auto gamme dynamique HR avec une valeur de 95 % et rendu automatique dynamique SWF avec une valeur de 90 %. Sélectionnez la meilleure qualité de rendu.
4. Sélectionnez convertir les palmiers, dans le menu de la palme de l’onglet transformation (mode post-traitement). Appuyez sur Sélectionner , puis appliquer. Enregistrez l’image créée avec un format. LSM (et pas .czi, très important).
   Remarque : La reconstruction de l’image peut être réalisée immédiatement après l’acquisition ou au plus tard en utilisant le mode de traitement d’image du logiciel acquisition. Dans la hors ligne mode de post-traitement, il est possible d’analyser à nouveau les piles avec différentes valeurs de paramètres (taille de masque de pic, pic d’intensité au bruit). Toujours choisir de « jeter des molécules qui se chevauchent » et pas « moyenne avant la localisation ».

8. estimation de la précision de la localisation d’une image de tempête (10 min)

1. Ouvrez vos données brutes de la tempête et utilisez le traitement d’Image onglet sélectionner la méthode PALM et puis PALM à nouveau. Appuyez sur Select.
2. Appuyez sur Apply pour commencer la reconstruction à l’aide d’une taille de masque de pic de 9 et un pic d’intensité au bruit de 6 (ou les paramètres que vous choisissez pour l’image).
3. Sélectionnez l’outil graphique de rectangle et dessinez un rectangle sur l’image raw autour d’une seule molécule présente à la surface du verre. Il y a habituellement quelques molécules simples là.
4. Appuyez sur appliquer à nouveau et seulement les molécules présentes à l’intérieur de la région de rectangle seront analysé.
5. Dans l’outil PAL-statistiques , sélectionnez le type de tracé : histogramme et la Source de l’histogramme : X position ou Y, de visualiser les histogrammes de position.
6. Enregistrez la table avec la liste des localisations sur la gauche sous les images.
7. À l’aide d’un logiciel d’analyse de données, créer des histogrammes de X et Y des positions (Figure 1).
8. Monter les distributions par une gaussienne et sauver le σ_X et σ des valeurs_Y . Le σ de précision de localisation_SMLM est estimé par (σ_{X *}σ_Y) ^ 0.5.
9. Répétez l’étape 8.3-8,8 sur des molécules autant que possible et en moyenne le σ_SMLM

9. canal enregistrement (5 min)

1. Ouvrez l’image de tempête de chaque couleur en utilisant le logiciel de Fidji (Image J).
2. Sélectionnez l’outil baguette magique pour mesurer les positions de chaque tetraspeck des perles.
3. Calculer les décalages X et Y pour chaque perle et leur moyenne.
4. Utilisez la commande « Traduire » pour traduire la deuxième image avec le calculé les décalages X et Y.
5. Fusionner les deux images à l’aide de la commande Merge canaux.

Résultats

Un microscope équipé de caméra de 512 x 512, un alpha Plan Apo 100 X 50 mW 405 nm et les 100 mW 488, 561 et 642 nm à semi-conducteurs lasers, une EMCCD / 1,46 objectif et Band passent 570-650 / passent longtemps 655 filtres d’émission a été utilisé pour les résultats représentatifs présentés ci-dessous.

Figure 1 a donne un exemple de la densité de la molécule et de signal / bruit qui...

Discussion

Étapes cruciales dans le protocole

Nous présentons ici un protocole qui minimise les artefacts dans les images dSTORM des microtubules et IFs dans les cellules gliales. Artefacts peuvent être créées à chaque étape de la préparation de l’échantillon et l’imagerie : fixation, blocage, immunomarquage, dérive pendant l’acquisition, non-optimale clignotant conditions²³. Nous énumérons ci-dessous les étapes plus critiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2