Filamentos intermediários e microtúbulos com microscopia 2-dimensional direta estocástico reconstrução óptico de imagem

Resumo

O objetivo geral desta metodologia é dar as condições experimentais ideais de preparação da amostra para aquisição de imagem e reconstrução para realizar imagens de dSTORM 2D cor dupla de microtúbulos e filamentos intermediários em células fixas

Resumo

O citoesqueleto, composto de microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermediários (se), desempenha um papel fundamental no controle da forma da célula, polaridade e motilidade. A organização das redes de actina e microtúbulos tem sido extensivamente estudada, mas da IFs não é ainda totalmente caracterizada. O iFs tem um diâmetro médio de 10 nm e forma uma rede estendendo-se por todo o citoplasma da célula. Eles estão fisicamente associados com actina e microtúbulos através de motores moleculares e linkers do citoesqueleto. Esta associação apertada é o cerne dos mecanismos de regulação que asseguram o Regulamento coordenado das três redes cytoskeletal requeridas para a maioria das funções celulares. É, portanto, crucial Visualizar IFs sozinho e, também, juntamente com cada uma das outras redes do citoesqueleto. No entanto, as redes se são extremamente densas na maioria dos tipos de células, especialmente nas células gliais, que faz com que sua resolução muito difícil de conseguir com microscopia de fluorescência padrão (lateral resolução de ~ 250 nm). Direto estocástico microscopia óptica de reconstrução (dSTORM) é uma técnica que permite um ganho na resolução lateral de uma ordem de magnitude. Aqui, nós mostramos que a resolução lateral dSTORM é suficiente para resolver a densa organização das redes se e, em particular, dos feixes se cercam os microtúbulos. Tal associação apertada é provável que participam na regulação coordenada dessas duas redes e maio, explicar como modelo de IFs vimentina e estabilizar a organização microtubule também poderia influenciar microtubule dependente tráfico vesicular. Mais geralmente, mostramos como a observação de dois componentes do citoesqueleto, com técnica de duplo-cor dSTORM traz a introspecção nova sua interação mútua.

Introdução

Filamentos intermediários citoplasmáticos (IFs) são 10 nm de diâmetro, homo ou heteropolímeros de um subconjunto específico de tipo de célula de proteínas se. O iFs participam em uma grande variedade de funções celulares, tais como respostas de estresse, a proliferação e a motilidade celular. Seu papel-chave é realçado pelo fato de que mais de 90 doenças humanas são diretamente causadas por mutações em proteínas se; por exemplo, alterações na composição se acompanha o crescimento do tumor e espalhar^1,2,3. Existe uma crescente evidência de que os três sistemas de citoesqueleto trabalham em colaboração para controle de funções celulares como a polarização celular, divisão e migração^2,3. Uma vez que existe um acoplamento forte entre funções e arquitetura espacial, é crucial obter insights sobre a organização estrutural do que com os outros filamentos e entender melhor o cross-talk do citoesqueleto. Este artigo fornece um protocolo para realizar a técnica de super-resolução duplo-cor dSTORM (direct estocástico reconstrução microscopia óptica)⁴ e como ele é usado para investigar a interação entre se e microtúbulos em fixo, culta células em 2 dimensões (2D).

Várias técnicas de super-resolução foram desenvolvidas ao longo dos últimos década e descobertas lá estavam na origem do Prêmio Nobel de química em 2014⁵. Entre todas estas técnicas, encontra-se a métodos baseados em localização única molécula como PALM⁶ (microscopia de localização Photo-Activated) que usa photoswitchable proteínas fluorescentes, STORM⁷ com pares de fluorophores ou dSTORM⁴ com fluorophores convencional. Todos estes métodos são baseados no mesmo princípio que consiste em (i) o interruptor da maioria dos repórteres fluorescentes em um estado "desligado" "o estado de (não-fluorescente), (ii) a ativação estocástica de um subconjunto deles em um fluorescente para localizar suas posição espacial com precisão de nanômetros e (iii) a repetição deste processo a fim de ativar como muitos subconjuntos de fluorophores quanto possível. Uma imagem final é reconstruída usando todas as localizações das moléculas ativadas, fornecendo uma resolução lateral até ~ 20-40 nm. Diversos sistemas ópticos comercializados permitindo PALM/tempestade estão agora disponíveis para biólogos para experimentos de rotina. Aqui, um tal sistema foi usado para estudar a associação estrutural de microtúbulos e IFs. Entre todos os single-molécula localização com base em métodos, a técnica de duplo-cor dSTORM foi seleccionada, pois é bem adequado para observar regiões lamelares muito finas (< 1 µm) de células aderentes e pode proporcionar melhoria significativa de resolução de imagem com investimento mínimo de tempo e dinheiro. Com efeito, a dSTORM é uma técnica muito conveniente e versátil que é compatível com os padrão corantes orgânicos rotineiramente utilizados para coloração celular e imunofluorescência.

Enquanto uma cor dSTORM imagens são relativamente simples de obter usando o fluoróforo Alexa647⁸, dSTORM de cor dupla requer para otimizar as condições experimentais para que dois corantes podem piscar adequadamente no buffer escolhido, especialmente quando há limitado poder do laser. Excelentes trabalhos já estão disponíveis os métodos para definir as imagens de multi-color com dSTORM^{9,10,11,12,13}, e esses papéis explicam em detalhe as possíveis fontes de artefatos e resolução de imagem degradada e também como superá-los. No presente artigo, as condições experimentais ideais em termos de fixação de células, imunocoloração, preparação da amostra, aquisição de imagem e reconstrução de imagem são descritos para adquirir imagens de citoplasma denso se redes e microtúbulos em células gliais com duplo-cor dSTORM. Resumidamente, o método de extração/fixação descrito no Chazeau et al.¹² foi adaptado às células gliais e usado com uma etapa pós-fixação, concentração de anticorpos otimizado, um buffer de tempestade com 10mm MEA descrito em Dempsey⁹ et al, que foi encontrado para ser o ideal para a instalação experimental e tipo de amostra.

Células gliais expressam principalmente três tipos de proteínas se: vimentina, nestin e GFAP (proteína fibrilar ácida glia). Estes três proteínas foram mostradas para polimerizar co em astrócitos¹⁴. Mostramos anteriormente usando microscopia de iluminação Super-resolução estruturada (SIM SR) que estes três proteínas se encontram no mesmo filamento único se e que eles exibem semelhante distribuição e dinâmica em células gliais ¹⁵. Devido as semelhanças entre as três proteínas se, vimentina coloração foi usada como um repórter para toda a rede se. Usando dSTORM, conseguimos resolver como feixes de se forma ao longo dos microtúbulos, que não era possível com difração limitada de técnicas de microscopia¹⁵. Estas observações podem ajudar a entender como vimentina IFs pode microtúbulos modelo e regular a sua trajetória de crescimento, promovendo a manutenção de um eixo de polaridade durante a migração de células¹⁶. Imagens de super-resolução forneceram informações chaves sobre a interação mútua dos dois subsistemas do citoesqueleto e trouxeram o insight sobre a ligação entre a associação espacial e a função local que poderia ser o tipo de célula específica¹⁷. Em geral, duplo-cor dSTORM pode ser usado para estudar o crosstalk entre elementos do citoesqueleto ou outros tipos de organelas, desde que immunostaining boas condições são alcançadas em termos de densidade e especificidade. Esta técnica será útil para melhor caracterizar as alterações do citoesqueleto observadas durante astrogliosis e no glioblastoma, o tumor mais comum e mais malignos do sistema nervoso central, onde é a expressão de proteínas se alterou ^{18 ,19,20,21}.

Protocolo

1. preparação lamelas (1 dia, 30 min)

1. Coloque as nº1.5H 18mm (170 µm + /-5µm) as lamelas de vidro em uma cremalheira de plástico.
2. Colocar o cesto cheio de acetona e molho por 5 min num copo de 100 mL.
3. Transferi o rack para um copo de 100 mL com etanol absoluto e molho por 5 min.
4. O rack de transferência para um novo copo de 100 mL cheio de etanol absoluto e colocar o copo em um dispositivo de limpeza ultra-sônico (ver tabela de materiais) à temperatura ambiente. Pressione "na" e aguarde 10 min.
5. Coloque a grelha sob uma capa de fluxo laminar e deixe as lamelas secar ou secar as lamelas com fluxo de ar filtrado.
6. Coloque a grelha com lamelas em um dispositivo de limpeza de plasma. Ligue a bomba de vácuo, feche a porta, esperar por 3 min fazer o vácuo e o plasma de 1 min. uso as lamelas, ligue logo após a limpeza. Não armazená-los.

2. célula chapeamento (1 dia, 20 min)

1. Cresce a célula glial linha U373 em meio essencial mínimo (MEM) com 10% de soro Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina e 1% não-essenciais aminoácidos no prato de petri plástico 10 cm de diâmetro.
2. Coloque as lamelas de vidro limpo em placas de 12 poços sob o capô de fluxo laminar e adicionar 1 mL de meio de célula pré-aquecido por bem.
3. Pegue um prato contendo células a partir da incubadora de célula (37 ° C, 5% CO₂).
4. Remover o meio e adicionar 10 mL de PBS.
5. Remover a PBS e adicione 1 mL de 0.05% Trypsin-EDTA.
6. Coloque o prato de volta na incubadora para 2-3 min.
7. Adicionar 10 mL de meio quente pré-aquecido a 37 ° C, sobre o prato e ressuspender as células.
8. Células de cerca de 100 000 sementes por alvéolo (~ 150 µ l de células) nas placas de 12 poços que contêm as lamelas.
9. Aguardar pelo menos 6 h (ou durante a noite) permitir que a célula se espalhando.

3. fixação da pilha (dia 2, 2h)

1. Preparar o buffer do citoesqueleto com tubos de 80 mM, 7 mM MgCl₂, 1mm EGTA, 150 mM de NaCl e ajustar o pH a 6,9.
2. Lave as células uma vez com PBS.
3. Remover a PBS e suavemente, adicionar 1 mL por poço da solução de extração/fixação (0,25% glutaraldeído, 0,3% Triton X-100 no buffer de citoesqueleto) pré-aquecido a 37 ° C.
4. Incubar durante 60 s à temperatura ambiente.
5. Remover a solução e delicadamente, adicione 1 mL por alvéolo de pré-aquecido e recentemente preparada solução PFA (paraformaldeído) de 4% diluída no buffer de citoesqueleto.
   Atenção: Usar luvas e trabalhar sob a capa de química.
6. Coloque a placa de 12 volta na incubadora a 37° C por 10 min.
7. Remover o PFA e adicionar 3 mL de PBS por bem.
   Nota: Trabalhar sob o capô químico com luvas e colocar o PFA reciclado em um escaninho específico.
8. Lave duas vezes com PBS.
9. Remover a PBS e adicionar solução recentemente preparada de 10mm NaBH₄ diluída em PBS, a fim de saciar a autofluorescência vindo de glutaraldeído.
10. Incube durante 7 min à temperatura ambiente.
11. Colocar o reciclado NaBH₄ em uma posição específica.
12. Lave três vezes 5 min com PBS.
13. Remover a PBS e adicionar a solução de bloqueio (solução a 5% BSA em PBS).
14. Encube por 1h à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C).
    Nota: O buffer do citoesqueleto pode ser armazenado em temperatura ambiente por alguns meses. PFA, NaBH₄ e glutaraldeído devem ser manuseados com cuidado especial (capuz, luvas e latas específicas). Soluções devem ser adicionadas e removidas delicadamente a fim de preservar a integridade das células. É importante não deixar as células secas.

4. imunocoloração (dia 2, 5h)

1. Prepare a solução de anticorpos primários usando antivimentina e antitubulina com uma diluição de 1: 500 na solução de bloqueio.
2. Coloquei 100 gotas de µ l de anticorpos primários diluídos em uma camada de película de parafina e coloque as lamelas em cima deles com células virada para baixo.
3. Incube as células com anticorpos primários por 2 h. Coloque as lamelas em uma placa de 12 preenchidas com PBS. Lavar três vezes para cada vez em PBS em temperatura ambiente em um agitador orbital de 5 min.
4. Entretanto, prepare a solução de anticorpos secundários usando anti-rato Alexa647 e antirato Alexa555 a uma diluição de um 1:1, 000 na solução de bloqueio. Incube as células com anticorpos secundários por 1h à temperatura ambiente. Proceda como 4.2. protegendo as células de luz.
5. Colocar a lamela em uma placa de 12 preenchida com PBS. Lavar três vezes para cada vez em PBS em temperatura ambiente em um agitador orbital de 5 min. Remover a PBS e adicionar 0,5 mL de PBS misturado com 1 µ l de 0,1 µm tetraspeck grânulos.
6. Colocar os poços em um agitador orbital de 30 min. enxaguar com PBS. Remover a PBS e incube as celulas por 5 min com uma solução PFA 4% em PBS. Lave três vezes em PBS.
   Nota: Células fixas podem ser armazenadas por um par de semanas em PBS a 4° C. Immunostaining deve ser feito no último minuto.

5. preparação da amostra (dia 3, 5 min)

1. Colocar alíquotas de MEA (cisteamina, 1 M, pH 8,3), glicose oxidase (100 x, 50 mg/mL), catalase (500 x, 20 mg/mL) em uma cesta de gelo.
2. Prepare-se 50 mL de tampão Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM de NaCl, pH = 8) suplementado com 10% de glicose (100 mg/mL).
3. Prepare 1,2 mL de tampão antes de imagem com 10mm MEA, glicose oxidase de 0,5 mg/mL (75 U/mL), 40 catalase µ g/mL (80-200 U/mL) de imagem no buffer Tris-NaCl com 10% de glicose.
4. Montar a lamela contendo as pilhas etiquetadas no porta-amostra magnética (por exemplo, câmara de chamlide) e adicionar o buffer de imagem para preencher completamente a câmara. Coloque a tampa e certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar entre a tampa e o buffer de imagem.
5. Limpar a parte inferior da amostra com etanol absoluto e verifique se não há vazamento. Use graxa de vedação do porta-amostras adequadamente, se necessário.
   Nota: Preparar o estoque de 1 M de solução MEA (pH 8.3 ajustado usando HCl), estoque de glicose oxidase em 50 mg/mL e estoque de catalase em 20 mg/mL em água, fazer alíquotas e armazená-los em-20 ° C por até um mês para MEA e um ano para glicose oxidase e catalase. Não volte a congelar alíquotas. Preparar o tampão Tris-NaCl com antecedência e armazená-lo em temperatura ambiente por vários meses. Adicione glicose no dia do experimento (passo 5.3).

6. aquisição de imagem (dia 3, ~ 1h por célula)

1. Ligue o microscópio. Ligue o software de aquisição e pressione iniciar o sistema.
2. Selecione o Tab de aquisição Expand a ferramenta de Configuração de imagem no grupo de ferramenta Gerenciador de instalação. Selecione o modo laser WF (campo largo) de aquisição. Selecione o objetivo 100 X at 1.46 . Selecione o modo TIRF u-HP que usa um colimador para reduzir o campo de visão sendo iluminado e concentrar a energia do laser em uma área menor. Use o optovar 1,6 x da lente que dá um tamanho de pixel de 100nm.
3. Selecione a ferramenta de séries temporais e configurar o lapso de tempo com 50 000 quadros e 0.0 ms entre os quadros. Expandir a ferramenta canais do grupo de ferramenta de parâmetro de aquisição e selecione "Mostrar tudo".
4. Defina a faixa de Alexa647: Verifique se a 642 e 405 linhas para a excitação de laser e aceitar para ativá-los. Selecione o filtro de emissão "655 LP" na Configuração de imagem. Renomear "647".
5. Clique no '+' na ferramenta de canais para adicionar outra passagem de luz e selecione o modo "agulha cada: moldura" na ferramenta de Configuração de imagem . Verifique a 561, 488 e linhas de laser 405 e aceitar para ativá-los. Selecione o "BP 570-650 + LP750" emissão de filtrar e usar a lente optovar 1.6 x. Verifique que o modo TIRF-uHP é selecionado. Renomear a faixa "555".
6. Selecione a ferramenta de modo de aquisição e definir o tamanho do quadro para 200 x 200 pixels. Selecione a ferramenta de estratégia e dispositivos de foco e definir o foco definido para 1 000 quadros, (se houver um sistema de trava de foco).
7. Coloque óleo no objectivo e coloque a amostra. Selecione a guia Localizar e abrir o obturador da lâmpada da fluorescência. Encontrar o foco e olhar para a célula a imagem usando a ocular. Colocá-lo no centro do campo de visão usando o joystick.
8. Selecione a guia de aquisição para voltar ao modo de aquisição. Selecione a faixa "647" definir a potência do laser-642 a 0,2%, como a potência do laser-405 0, definir o tempo de exposição a 50 ms e o ganho de 50. Escolha o modo de aquisição contínua de observar o celular na tela. Ajuste o foco. Verifique se há pelo menos um grânulo de tetraspeck no campo de visão, aumentar o contraste para vê-los se necessário. Use um modo de dimensionar automaticamente para a exibição. Pegue uma imagem de epifluorescência campo amplo da vimentina rede clicando no encaixe e salvá-lo. Para verificar a iluminação TIRF, clique em TIRF, ajustar o ângulo de iluminação e/ou colimador, se necessário, para ter um campo homogêneo da iluminação e salvá-lo.
   Nota: É importante que as imagens TIRF e epifluorescente são de alta qualidade, antes de iniciar a aquisição de dados brutos. Descontínuos, não uniformemente etiquetados filamentos dará origem a imagens de dSTORM de má qualidade.
9. A faixa "647" desmarque a opção e selecione e verificar se a faixa "555". Pegue uma imagem de epifluorescência da rede microtubule e salvá-lo. Pegue uma imagem TIRF e salvá-lo também.
10. Desmarque a faixa "555", selecionar e verificar a faixa "647", então pressione contínuo. Coloque o ganho de 0 e tempo de exposição de 10 ms. definir a potência do laser 642-nm para 100% para bombear a maioria dos corantes Alexa647 ao estado escuro (~ 2 kW/cm²). Uma vez que o fluorophores começam a piscar, colocar a exposição a 15 ms e ganhar a 300. Selecione o modo TIRF da iluminação. Use o modo de indicador de intervalo sem escala automática para verificar que os sinais da molécula não saturar a câmera (indicada pela cor vermelha). Nesse caso, diminua o ganho até que desapareça a saturação. Tetraspeck grânulos permanecerá saturados no início da aquisição. Pressione parar para parar a observação contínua da célula.
11. Expandir a ferramenta de processamento on-line e verificar Online processamento PALM para visualizar a imagem da tempestade durante a aquisição. Use os seguintes parâmetros: 9 para o tamanho da máscara de pico (diâmetro de 9 pixéis) e 6 para o pico de intensidade de ruído. Parâmetros de teses definirá as moléculas que são tidos em conta no processamento (brilhante o suficiente e não se sobrepõem). A ferramenta de Estatísticas-PAL , selecione o tipo de trama: histogramae histograma fonte: precisão. Pressione Iniciar aquisição.
12. Durante a aquisição, recentrar se necessário (se não houver nenhum dispositivo de trava de foco). Ajustar os parâmetros (exposição, poderes do laser) e eventualmente ligar a linha de laser 405 nm (a partir de 0,001%) manter uma densidade média de fluorophores com uma distância mínima de 1 µm entre moléculas simples (> 9 pixels de 100 nm, o tamanho da máscara de pico) ( Figura 1A-B). Se a densidade da molécula é um pouco alta demais, use o modo de HILO (folha altamente inclinados e laminado ópticos) de iluminação em vez de TIRF. Isto irá aumentar a potência do laser em 20%. Certifique-se que o pico de precisão de localização no histograma abaixo da imagem reconstruída é centrado em torno ou abaixo de 10 nm.
    Nota: Geralmente o número de moléculas diminui com o tempo e a potência do laser 405 nm é aumentada lentamente em conformidade. O objetivo é diminuir a precisão de localização (histograma exibida abaixo da imagem de super-resolução), tanto quanto possível, com um pico inferior a 10 nm (Figura 1). Aumente o contraste da imagem a PALM, se necessário, se muitos grânulos brilhantes estão presentes no campo.
13. Pressione parar para parar o filme, quando se chegou a mais de 10 localizações⁶ (normalmente depois de 40 000 frames). Colocar os lasers para 0,2% (642 nm) e 0 (405 nm). Salve os dados brutos da aquisição tempestade com o formato de .czi. Desmarque a faixa "647" na ferramenta de canais, selecione e verificar a faixa "555".
14. Definir o tempo de exposição para 25 ms e ganhar como 0. Pressione o botão de contínuo e conjunto de lasers de 488 e 561 a 100% para bomba Alexa555 corantes ao estado escuro (~ 2 kW/cm² cada). Uma vez que o fluorophores começam a piscar, colocar o ganho para 250, use o modo de iluminação de HILO e verificar que moléculas simples não saturar a câmera com o modo de indicador de intervalo. Se for esse o caso, diminua o ganho. Pressione parar. Diminua o poder de 488-laser de 50%.
15. Pressione Iniciar aquisição. Durante a aquisição, aumente progressivamente o ganho para estar sempre no limite de saturação. Aumente o passo a passo o poder do laser 405 nm para manter uma densidade média de uma única molécula no campo de visão (ver passo 6.18). Diminua o poder do 488 laser de 20-30%, quando o laser 405 é superior a 15%. Em seguida diminua gradualmente a 488 aumentando a linha de 405 laser a fim de manter o piscar das moléculas mais rápido possível. A linha de 488 laser juntamente com o laser de 561 excitação em máxima intensidade aumenta tanto a ligar e desligar taxas do fluorophores, Considerando que a linha de 405 laser só aumenta a taxa de no.
16. Pare a aquisição quando se chegou a mais de 500 000 localizações (depois de cerca de 20 000 frames) ou mais, quando não há mais moléculas estão piscando. Salve os dados brutos da aquisição tempestade com o formato de .czi.
    Nota: Comece sempre com o maior comprimento de onda para evitar o branqueamento (ou ativação) de outras cores. Desde que a câmara de chamlide não é selada, é possível alterar o buffer de imagem regularmente, por exemplo, para testar as condições de reserva diferentes. Usando a linha de 488 laser para esgotar as tinturas de Alexa 555 é necessária apenas quando a potência do 561 laser é limitada (com lasers de 100 mW).

7. reconstrução de imagem (5 min)

1. A ferramenta PAL-Drift , use o tipo de correção baseados no modelo com segmentos automáticos com um tamanho máximo de 8. Pressione aplicar várias vezes seguidas até que o desvio seja corrigido. Esta correção baseado no modelo se aplica um algoritmo baseado na análise de correlação cruzada que corrige a deriva.
2. Usando as ferramentas de Filtro de PAL , melhorar a aparência da imagem tempestade, selecionando apenas as moléculas que foram melhor localizadas. Por exemplo, limitar a precisão da localização , a 30 nm e o PSF a 120-180 nm.
3. Use uma resolução de pixel de 5 ou 10 nm na ferramenta PAL-render , bem como um modo de exibição gaussiana, com um factor de expansão de 1 PSF. Selecione processar auto gama dinâmica HR com um valor de 95% e Render auto escala dinâmica SWF com um valor de 90%. Selecione a melhor qualidade de Render.
4. Selecione converter PALM, no menu de Palma da guia de processamento (modo de pós-processamento). Pressione selecionar e aplicar. Salve a imagem criada com um formato. LSM (e não .czi, muito importante).
   Nota: A reconstrução da imagem pode ser realizada imediatamente após a aquisição ou posterior usando o modo de processamento de imagem de software a aquisição. Na linha fora de pós-processamento modo, é possível analisar novamente as pilhas com diferentes valores de parâmetros (tamanho da máscara de pico, pico de intensidade de ruído). Sempre optar por "descartar moléculas sobrepostas" e não "média antes de localização".

8. estimativa da precisão de localização de uma imagem de tempestade (10 min)

1. Abra seus dados brutos de tempestade e uso o guia de processamento de imagem selecione o método de Palma e então Palma novamente. Pressione selecionar.
2. Pressione aplicar para começar a reconstrução usando um tamanho de máscara de pico de 9 e o pico de intensidade de ruído de 6 (ou os parâmetros que você escolher para a imagem).
3. Selecione a ferramenta gráfica do retângulo e desenhe um retângulo na imagem crua em torno de uma única molécula presente na superfície de vidro. Normalmente existem algumas moléculas simples lá.
4. Pressione aplicar novamente e só as moléculas presentes no interior da região do retângulo serão analisados.
5. A ferramenta de Estatísticas-PAL , selecione o tipo de trama: histograma e histograma fonte: X posição ou Y, para visualizar os histogramas de posição.
6. Salve a tabela com a lista de localizações em seguida as imagens à esquerda.
7. Usando um software de análise de dados, criar histogramas de X e Y posições (Figura 1).
8. Encaixe as distribuições por um Gaussian e salvar o σ_X e σ_Y valores. A precisão de localização σ_SMLM é estimado pelo (σ_{X *}σ_Y) ^ 0.5.
9. Repita a etapa 8.3-8,8 em moléculas como muitos como possível e média a σ_SMLM

9. canal registro (5 min)

1. Abra a imagem de tempestade de cada cor, usando o software de Fiji (Image J).
2. Selecione a ferramenta varinha para medir as posições de cada grânulos de tetraspeck.
3. Calcular os deslocamentos X e Y para cada grânulo e média-los.
4. Use o comando "Traduzir" para traduzir a segunda imagem com o calculado deslocamentos X e Y.
5. Fundir as duas imagens usando o comando mesclar canais.

Resultados

Um microscópio equipado com 50 mW 405 nm e 100 mW, 488, 561 e 642 nm Solid-State lasers, um EMCCD câmera de 512 x 512, um alfa Apo plano 100 X / 1,46 objectivo e banda passam 570-650 / 655 emissões de filtros passam-tempo foi usado para os resultados representativos apresentados abaixo.

Figura 1A dá um exemplo de molécula densidade e sinal à relação de ruído que deve ser usada durante a aqu...

Discussão

Passos críticos no protocolo

Apresentamos aqui um protocolo que minimiza artefatos nas imagens dSTORM de microtúbulos e IFs em células gliais. Artefatos podem ser criados em cada etapa da preparação da amostra e imagem latente: fixação, bloqueando, immunolabeling, deriva durante a aquisição, não ideal piscando condições²³. Listamos abaixo os passos mais críticos.

As lamelas de limpeza é um passo importante para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2