Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

Zusammenfassung

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen durchführen

Zusammenfassung

Das Zellskelett, bestehend aus Aktin beschäftigt, Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente (IF), spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Polarität und Motilität. Die Organisation der Aktin und Mikrotubuli Netzwerke wurde ausgiebig studiert, aber der IFs ist noch nicht vollständig charakterisiert. IFs haben einen Durchmesser von 10 nm und bilden ein Netzwerk erweitern in der gesamten Zelle Zytoplasma. Sie sind physisch verbunden mit Aktin und Mikrotubuli durch molekulare Motoren und Zytoskeletts linker. Diese enge Verbindung ist das Herzstück der Regulationsmechanismen, die für die koordinierte Regulierung der drei Zellskelett Netze erforderlich für die meisten Zellfunktionen sorgen. Es ist daher entscheidend für IFs allein und auch gemeinsam mit den jeweiligen anderen Zellskelett Netzwerke zu visualisieren. IF-Netzwerke sind jedoch extrem dicht in den meisten Zelltypen, vor allem in Gliazellen, wodurch seine Auflösung sehr schwer zu erreichen mit standard Fluoreszenz-Mikroskopie (laterale Auflösung von ~ 250 nm). Direkte stochastische Wiederaufbau Lichtmikroskopie (dSTORM) ist eine Technik, so dass einen Gewinn in lateraler Auflösung um eine Größenordnung. Hier zeigen wir, dass seitliche dSTORM Auflösung ausreichend, um die dichten Organisation der IF Netze und vor allem IF-Bundles rund um Mikrotubuli zu beheben ist. Solche engen Assoziation wird voraussichtlich in der koordinierten Verordnung dieser zwei Netzwerke und Mai teilnehmen, erklären wie Vimentin IFs Vorlage und stabilisieren Mikrotubuli Organisation sowie Mikrotubuli abhängigen vesikuläre Menschenhandel beeinflussen könnten. Ganz allgemein zeigen wir, wie die Beobachtung des Zytoskeletts Zweikomponenten mit zweifarbige dSTORM Technik bringt neue Einblicke in ihren Wechselwirkungen.

Einleitung

Zytoplasmatischen intermediate Filamente (IFs) sind 10 nm Durchmesser Homo- oder Heteropolymers einer Zelle Art spezifische Teilmenge von IF-Proteine. IFs Teilnahme an einer Vielzahl von zellulären Funktionen wie Zell-Motilität, Verbreitung und Stress-Reaktionen. Ihre wichtige Rolle wird durch die Tatsache hervorgehoben, die mehr als 90 Krankheiten beim Menschen direkt durch Mutationen im IF-Proteine verursacht werden; zum Beispiel Veränderungen in der Zusammensetzung der IF begleitet Tumorwachstum und Ausbreitung^1,2,3. Es wächst Beweise, die die drei Zytoskelett-Systeme zusammen, um zelluläre Funktionen wie Zelle Polarisation, Teilung und Migration^{2,3 arbeiten}. Da gibt es eine enge Kopplung zwischen Raumarchitektur und Funktionen, ist es entscheidend, erhalten Einblicke in die strukturelle Organisation des IF mit den anderen Filamenten und ein besseres Verständnis des Zytoskeletts Übersprechen. Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur Durchführung der Super-Resolution Technik zweifarbige dSTORM (direkte stochastische optische Rekonstruktion Microscopy)⁴ und wie es verwendet wird, um die Interaktion zwischen wenn zu untersuchen und Mikrotubuli in feste, kultiviert Zellen in 2 Dimensionen (2D).

Mehrere Super-Resolution-Techniken wurden in den vergangenen zehn Jahren und es gibt Entdeckungen wurden am Ursprung der Nobelpreis für Chemie im Jahr 2014⁵. Unter all diesen Techniken liegt die Einzelmolekül Lokalisierung-basierte Methoden wie PALM⁶ (Photo-Activated Localization Microscopy) die photoschaltbare fluoreszierende Proteine verwendet STORM⁷ mit paar Fluorophore oder dSTORM⁴ mit konventionellen Fluorophore. Alle diese Methoden basieren auf dem gleichen Prinzip besteht aus (i) den Schalter für den Großteil der fluoreszierenden Reporter in einem "off" Zustand"(nicht-fluoreszierende), (Ii) die stochastische Aktivierung einer Teilmenge davon in einem fluoreszierenden Zustand um lokalisieren ihre räumliche Lage mit Nanometer-Genauigkeit und (Iii) die Wiederholung dieses Prozesses um so viele Teilmengen des Fluorophore wie möglich zu aktivieren. Eine endgültige Bild wird rekonstruiert, mit alle Lokalisierungen der aktivierten Moleküle, bietet einen lateralen Auflösung bis zu ~ 20-40 nm. Mehrere kommerzialisierten optische Systeme, so dass PALM/Sturm stehen jetzt für Biologen für routinemäßige Experimente. Hier wurde ein solches System verwendet, um die strukturellen Vereinigung von Mikrotubuli und IFs zu studieren. Unter all den Einzelmolekül-Lokalisierung-basierte Methoden, die zweifarbige dSTORM Technik wurde ausgewählt, weil es gut geeignet, um sehr dünne lamellare Bereiche zu beobachten ist (< 1 µm) von adhärenten Zellen und bieten signifikante Verbesserung der Bildauflösung mit minimale Investition von Zeit und Geld. DSTORM ist in der Tat eine sehr bequeme und vielseitige Technik, die kompatibel mit den standard organischen Farbstoffen zum zellulären Beizen und Immunfluoreszenz routinemäßig eingesetzt.

Während einer Farbe dSTORM Bilder relativ einfach sind zu erhalten, mit dem Fluorophor Alexa647⁸, erfordert doppelte Farbe dSTORM die Versuchsbedingungen so optimieren, dass zwei Farbstoffen richtig im gewählten Puffer blinken können, vor allem, wenn es begrenzt ist Laserleistung. Ausgezeichnete Papiere sind bereits auf die Methoden zum Einrichten von Multi-Color-Bildgebung mit dSTORM^{9,10,11,12,13}, und diese Papiere im Detail erklären, die möglichen Fehlerquellen Artefakte und degradierten Bildauflösung sowie zu deren Überwindung. In diesem Artikel, der optimalen experimentellen Bedingungen in Bezug auf Zellen Fixierung, Immunostaining, Probenvorbereitung sind bildgebende Erwerb und Bildrekonstruktion beschrieben um Bilder von dichten zytoplasmatischen IF Netze und Mikrotubuli in erlangen Gliazellen mit zweifarbige dSTORM. Kurz, die Extraktion/Fixierung in Chazeau Et Al¹² beschriebene Methode wurde an Gliazellen angepasst und mit einem Post-Fixierung Schritt optimierte Antikörper Konzentration verwendet, ein Sturm-Puffer mit 10 mM MEA beschrieben in Dempsey⁹ Et Al. optimal für den experimentellen Aufbau und Probentyp zu finden.

Gliazellen express vor allem drei Typen von IF-Proteine: Vimentin, nestin und GFAP (glial fibrillary sauren Protein). Diese drei Proteine erwiesen sich in Astrozyten¹⁴Co polymerisieren. Wir haben bisher gezeigt, mit Höchstauflösung strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SR-SIM), dass diese drei IF-Proteine in der gleichen einzelnen IF Faden zu finden und sie ähnliche Verteilung und Dynamik in Gliazellen ¹⁵anzeigen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den drei IF-Proteinen Vimentin Färbung als Reporter für das gesamte Netzwerk IF diente. Mit dSTORM, konnten wir zu beheben, wie IF Form Bündel entlang der Mikrotubuli, die war nicht möglich mit Beugung Mikroskopie-Techniken¹⁵begrenzt. Diese Beobachtungen können helfen, zu verstehen wie Vimentin IFs Vorlage Mikrotubuli und regulieren ihren Wachstumskurs, Förderung der Aufrechterhaltung einer Polarität Achse während Zelle Migration¹⁶. Super-Auflösung Schlüsselinformationen auf die gegenseitige Interaktion der beiden Zellskelett Subsysteme zur Verfügung gestellt und brachte einen Einblick in die Verbindung zwischen räumlichen Zuordnung und lokale Funktion Zelltyp spezifische¹⁷sein könnte. Im Allgemeinen kann zweifarbige dSTORM das Übersprechen zwischen Zellskelett Elemente oder andere Arten von Organellen, studieren verwendet werden, vorausgesetzt, dass gute Immunostaining Bedingungen in Bezug auf Dichte und Spezifität erreicht werden. Diese Technik nützlich sein wird, die Zytoskelett Änderungen beobachtet, während Astrogliosis und Glioblastom besser zu charakterisieren, die häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, wo der Ausdruck von IF-Proteinen ist verändert ^{18 ,19,20,21}.

Protokoll

(1) Deckgläsern Vorbereitung (Tag1, 30 min)

1. Legen Sie die 18 mm nº1.5H (170 µm + / 5µm) Glasdeckgläser auf einem Kunststoff-Rack.
2. Setzen Sie das Rack in einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit Aceton und für 5 Minuten einweichen.
3. Übertragung des Racks auf einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol und für 5 Minuten einweichen.
4. Rack auf eine neue 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol übertragen und stellen Sie den Becher in einem Ultraschall-Reiniger-Gerät (siehe Tabelle der Materialien) bei Raumtemperatur. Drücken Sie "on" und warten Sie 10 Minuten.
5. Rack unter einem Laminar-Flow-Haube und lassen Sie die Deckgläsern trocknen oder Deckgläsern mit gefilterten Luftstrom trocknen.
6. Setzen Sie das Rack mit Deckgläsern in einem Plasma Reiniger Gerät. Schalten Sie die Vakuumpumpe, schließen Sie die Tür, 3 min. zu machen das Vakuum und schalten Sie das Plasma für 1 min. Einsatz der Deckgläsern kurz nach der Reinigung warten. Lagern Sie sie nicht.

2. Handy-Beschichtung (Tag1, 20 min)

1. Wachsen Sie die Gliazelle Linie U373 im Minimum wesentliches Medium (MEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht-essentielle Aminosäure in 10 cm Durchmesser Kunststoff Petrischale.
2. 12-Well-Platten unter der Laminar-Flow-Haube entgegenbringen Sie sauber Glasdeckgläser und 1 mL vorgewärmten Zelle Medium pro Bohrloch.
3. Nehmen Sie eine Schale mit Zellen aus der Zelle Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂).
4. Entfernen Sie das Medium und 10 mL PBS.
5. Entfernen Sie die PBS und 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA.
6. Stelle die Schüssel wieder in den Inkubator für 2-3 min.
7. Fügen Sie 10 mL warmen Medium bei 37 ° C auf dem Teller vorgewärmt und Aufschwemmen der Zellen.
8. Samen etwa 100 000 Zellen pro Bohrloch (~ 150 µL Zellen) in der 12-Well-Platten, die die Deckgläsern enthalten.
9. Warten Sie mindestens 6 Stunden (oder über Nacht) zu Zelle ausbreiten können.

3. Zelle Fixierung (Tag2, 2h)

1. Bereiten Sie des Zytoskeletts Puffers mit 80-mM-Rohre, 7 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl vor, und passen Sie den pH-Wert auf 6,9.
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
3. Entfernen Sie die PBS und sanft 1 mL pro Bohrloch Extraktion/Fixierung Lösung (0,25 % Glutaraldehyd, 0,3 % Triton x-100 im Zytoskelett Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt
4. Inkubieren 60 s bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie die Lösung und sanft 1 mL pro Bohrloch vorgeheizten und frisch zubereitete 4 % PFA (Paraformaldehyd) Lösung im Zytoskelett Puffer verdünnt.
   Vorsicht: Benutzen Sie Handschuhe und arbeiten unter der chemischen Haube.
6. Platz 12-Well-Platte wieder in den Inkubator bei 37° C für 10 Minuten.
7. Entfernen Sie die PFA und 3 mL PBS pro Bohrloch.
   Hinweis: Unter der chemischen Haube mit Handschuhen arbeiten Sie und legen Sie die recycelte PFA in einem bestimmten Lagerplatz.
8. Zweimal mit PBS waschen.
9. Entfernen der PBS und frisch zubereiteten 10 mM NaBH₄ Lösung verdünnt mit PBS-Puffer um die Autofluoreszenz Glutaraldehyd aus zu löschen.
10. 7 min bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Setzen Sie den recycelten NaBH₄ in einem bestimmten Lagerplatz.
12. Waschen Sie dreimal 5 min mit PBS.
13. Entfernen Sie die PBS zu und fügen Sie die blockierende Lösung (5 % BSA mit PBS-Puffer).
14. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4 ° C).
    Hinweis: Der Zellskelett Puffer kann für ein paar Monate bei Raumtemperatur gelagert. PFA, NaBH₄ und Glutaraldehyd sollten mit besonderer Sorgfalt (Haube, Handschuhe und spezielle recycling-Behälter) behandelt werden. Lösungen sollten hinzugefügt und entfernt sanft um die Integrität der Zellen zu erhalten. Es ist wichtig, nicht die Zellen trocknen lassen.

4. Immunostaining (Tag 2, 5h)

1. Bereiten Sie die Lösung der primären Antikörper mit Anti-Vimentin und Anti-Tubulin mit einer Verdünnung von 1: 500 in der blockierenden Lösung.
2. 100 µL Tropfen verdünnter Primärantikörper auf eine Folienschicht Paraffin und stellen Sie die Deckgläsern auf ihnen mit Zellen nach unten.
3. Inkubieren Sie Zellen mit Primärantikörpern für 2 h Put Deckgläsern zurück in ein 12-Well-Platte gefüllt mit PBS. 5 min jedes Mal mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler dreimal spülen.
4. In der Zwischenzeit bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung mit Anti-Maus-Alexa647 und Anti-Ratte-Alexa555 in einer Verdünnung von einem 1:1, 000 in der blockierenden Lösung. Inkubieren Sie Zellen mit Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Fahren Sie fort wie 4.2. schützt die Zellen vor Licht.
5. Das Deckglas wieder an einem 12-Well-Platte mit PBS gefüllt. 5 min jedes Mal mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler dreimal spülen. Entfernen der PBS und 0,5 mL PBS mit 1 µL von 0,1 µm Tetraspeck Perlen gemischt.
6. Setzen Sie die Brunnen auf einem Orbitalschüttler für 30 min. Spülen mit PBS. Entfernen Sie die PBS und inkubieren Sie die Zellen für 5 min mit 4 % PFA-Lösung mit PBS-Puffer. Spülen Sie dreimal mit PBS-Puffer.
   Hinweis: Fixe Zellen können für ein paar Wochen mit PBS-Puffer bei 4 ° c gelagert werden Immunostaining sollte in letzter Minute erfolgen.

(5) Probenvorbereitung (Tag3, 5 min)

1. Geben Sie Aliquote MEA (Cysteamin, 1 M, pH 8,3), Glukose-Oxidase (100 X, 50 mg/mL), Katalase (500 X, 20 mg/mL) in ein Eis-Korb.
2. Bereiten Sie 50 mL Tris-NaCl-Puffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) mit 10 % der Glukose (100 mg/mL) ergänzt.
3. Bereiten Sie 1,2 mL von imaging-Puffer kurz vor Bildgebung mit 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) Glukose-Oxidase, 40 µg/mL Katalase (80-200 U/mL vor) in der Tris-NaCl-Puffer mit 10 % Glukose.
4. Montieren Sie das Deckglas mit beschrifteten Zellen auf dem magnetischen Probenhalter (z.B. Chamlide-Kammer) und fügen Sie den bildgebenden Puffer, um die Kammer vollständig zu füllen. Setzen Sie den Deckel auf und stellen Sie sicher, dass gibt es keine Luftblasen zwischen den bildgebenden Puffer und den Deckel.
5. Reinigen Sie die Unterseite der Probe mit absoluten Ethanol und stellen Sie sicher, dass es nicht Leck. Verwenden Sie Fett, um dem Probenhalter richtig ggf. versiegeln.
   Hinweis: Bereiten Sie 1 M Lager MEA-Lösung (pH 8,3 mit HCl eingestellt), Lager von Glukose-Oxidase bei 50 mg/mL und Bestand an Katalase bei 20 mg/mL in Wasser, Aliquote und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zu einem Monat für MEA und ein Jahr für Glukose-Oxidase und Katalase. Aliquote nicht wieder einfrieren. Den Tris-NaCl-Puffer im Voraus vorbereitet und es für mehrere Monate bei Raumtemperatur lagern. Fügen Sie Glukose am Tag des Experiments (Schritt 5.3).

(6) Bildaufnahme (Tag3, ~ 1h pro Zelle)

1. Schalten Sie das Mikroskop. Schalten Sie die Software zur Datenerfassung und drücken Sie Start System.
2. Wählen Sie den Erwerb Tab. erweitern das Imaging-Setup -Tool in der Installations-Manager-Tool-Gruppe. Wählen Sie den Laser WF (weites Feld) Modus des Erwerbs. Wählen Sie das Ziel 100 X NA 1,46 . Wählen Sie den TIRF u-HP -Modus, der ein Kollimator verwendet, um das Sichtfeld beleuchteten zu verringern und konzentrieren Sie die Laserenergie in einen kleineren Bereich zu. Verwenden Sie die Optovar 1,6 X Objektiv , das eine Pixelgröße von 100nm gibt.
3. Wählen Sie das Werkzeug Zeitreihen und Zeitraffer mit 50 000 Rahmen und 0,0 ms zwischen Frames einrichten. Erweitern Sie das Kanäle -Tool in der Parametergruppe Tool Erwerb und wählen Sie "alle anzeigen".
4. Legen Sie die Alexa647-Strecke: Überprüfen Sie die 642 und 405 Laserlinien für Anregung und akzeptieren, um sie zu aktivieren. Wählen Sie den "655 LP" Emission Filter im Imaging-Setup. Benennen Sie "647".
5. Klicken Sie auf "+" in der Kanäle -Werkzeug, um einen weiteren leichten Durchlauf hinzufügen und wählen den Modus "Schalter Track jeden: Frame" in der Imaging-Setup -Tool. Prüfen Sie 561, 488 und 405 Laserlinien und akzeptieren Sie, um sie zu aktivieren. Wählen Sie die "BP 570-650 + LP750" Emission filtern und Optovar Objektiv 1,6 X. Überprüfen Sie, dass die TIRF-uHP-Modus ausgewählt ist. Benennen Sie den Track "555".
6. Wählen Sie das Werkzeug Akquisitionsmodus und legen Sie die Frame-Größe 200 x 200 Pixel. Wählen Sie das Tool Fokus Geräte und Strategie und setzen Sie den bestimmten Fokus auf 1 000 Frames (wenn vorhanden ein Fokus-Lock-System ist).
7. Öl auf das Ziel und die Probe auf. Wählen Sie die Registerkarte " Suchen ", und öffnen Sie den Verschluss der Fluoreszenz Lampe. Suchen Sie den Fokus und die Zelle zum Bild mit dem Okular. Legen Sie es in der Mitte des Sichtfeldes der Joystick.
8. Wählen Sie die Registerkarte " Erwerb ", um den Erwerb Modus zurückzukehren. Wählen Sie die "647" Spur, 642-Laserleistung auf 0,2 % festgelegt, die 405-Laserleistung auf 0 gesetzt, die Belichtungszeit auf 50 ms und der Gewinn von 50 festgelegt. Wählen Sie die kontinuierliche Akquisitionsmodus die Zelle auf dem Bildschirm beobachten. Schärfe einstellen. Stellen Sie sicher, es gibt mindestens einen Tetraspeck Wulst in das Blickfeld, erhöhen Sie den Kontrast um sie ggf. zu sehen. Verwenden Sie einen automatische Skalierung Modus für die Anzeige. Nehmen Sie ein Weitfeld-Epifluoreszenz Bild des Netzwerks Vimentin durch Anklicken snap und speichern Sie es. Um die TIRF Beleuchtung zu überprüfen, klicken Sie auf TIRF, passen Sie den Winkel der Beleuchtung bzw. Kollimator, ggf. zu einem homogenen Feld der Beleuchtung haben und speichern Sie es.
   Hinweis: Es ist wichtig, dass die TIRF und Epifluorescent Bilder von hoher Qualität sind, bevor die raw-Daten-Übernahme. Diskontinuierliche und ungleichmäßig beschriftete Borsten werden zu dSTORM Bilder in schlechter Qualität führen.
9. Deaktivieren Sie die "647" Track wählen Sie und überprüfen Sie die "555" Strecke. Ein Epifluoreszenz Bild von Mikrotubuli-Netzwerk und speichern Sie es. Eine TIRF Bild nehmen und es zu speichern.
10. Deaktivieren Sie die "555" Spur, wählen Sie und überprüfen Sie die "647" Track, und drücken Sie dann kontinuierlich. Den Gewinn auf 0 setzen und Belichtungszeit bis 10 ms 642 nm Laserleistung auf 100 % eingestellt, um die meisten der Alexa647 Farbstoffe in den dunklen Zustand (~ 2 kW/cm²) Pumpen. Sobald die Fluorophore beginnt zu blinken, setzen die Exposition gegenüber 15 ms und gewinnen auf 300. Wählen Sie die TIRF Beleuchtung. Verwenden Sie den Range Indikator Modus ohne automatische Skalierung, um sicherzustellen, dass Einzelmolekül-Signale die Kamera (durch die rote Farbe gekennzeichnet) nicht sättigen. In diesem Fall verringern Sie den Gewinn, bis die Sättigung verschwindet. Tetraspeck Perlen bleiben gesättigten zu Beginn des Erwerbs. Drücken Sie Stop , um die kontinuierliche Beobachtung der Zelle zu stoppen.
11. Erweitern Sie die Verarbeitung von Online -Tool zu und überprüfen Sie Online Verarbeitung PALM um das Sturm-Bild während der Akquisition zu visualisieren. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 9 für die Peak Maskengröße (9 Pixel Durchmesser) und 6 für die Peak-Intensität zu Lärm. Thesen-Parameter bestimmen die Moleküle, die bei der Verarbeitung (hell genug und nicht überlappend) berücksichtigt werden. Wählen Sie in der PAL-Statistik -Tool Plot Typ: Histogrammund Histogramm Quelle: Präzision. Drücken Sie Start Erwerb.
12. Während der Akquisition bei Bedarf (wenn keine Fokusverriegelung Gerät) zu konzentrieren. Passen Sie die Parameter (Exposition, Laserleistungen) und schließlich die 405 nm Laserlinie (ab 0,001 %), eine mittlere Dichte von Fluorophore mit einem Mindestabstand von 1 µm zwischen den einzelnen Molekülen zu halten Einschalten (> 9 Pixel von 100 nm, die Peak Maskengröße) ( Abbildung 1A-B). Wenn die Molekül-Dichte ein wenig zu hoch ist, verwenden Sie den HILO (stark geneigt und kaschiert optische Blatt) Modus der Beleuchtung statt TIRF. Dies wird die Laserleistung um 20 % erhöhen. Stellen Sie sicher, dass der Höhepunkt der Lokalisierung Präzision auf das Histogramm unter dem rekonstruierten Bild, um oder unter 10 zentriert ist nm.
    Hinweis: In der Regel die Anzahl der Moleküle sinkt mit der Zeit, und die 405 nm Laserleistung wird entsprechend langsam erhöht. Ziel ist es, die Genauigkeit der Lokalisierung (Histogramm angezeigt unter dem Super-Resolution-Bild) so viel wie möglich mit einer Spitzenleistung unter 10 verringern nm (Abbildung 1). Erhöhen Sie den Kontrast der PALM-Image, falls erforderlich, wenn zu viele helle Perlen in das Feld vorhanden sind.
13. Drücken Sie Stop , um den Film zu stoppen, wenn mehr als 10⁶ Lokalisierungen (in der Regel nach 40 000 Frames) erreicht haben. Setzen Sie den Laser wieder auf 0,2 % (642 nm) und 0 (405 nm). Speichern Sie die Rohdaten der Sturm-Übernahme mit dem .czi-Format. Deaktivieren Sie Track "647" Werkzeug "Kanäle" und wählen Sie und überprüfen Sie Track "555".
14. Die Belichtungszeit auf 25 ms festgelegt und auf 0 zu gewinnen. Drücken Sie die Schaltfläche " fortlaufend " und 100 % auf Pumpe Alexa555 Farbstoffe in den dunklen Zustand (~ 2 kW/cm² ) 488 und 561 Laser festgesetzt. Sobald die Fluorophore fängt an zu blinken, legte den Gewinn um 250, verwenden Sie den HILO -Beleuchtung-Modus und überprüfen Sie, ob einzelne Moleküle nicht, die Kamera mit der Range-Anzeige-Modus sättigen. Wenn das der Fall ist, verringern Sie den Gewinn. Drücken Sie Stop. Die 488 Laserleistung auf 50 % zu verringern.
15. Drücken Sie Start Erwerb. Während der Akquisition schrittweise die Verstärkung immer an der Grenze der Sättigung zu erhöhen. Erhöhen Sie Schritt für Schritt die 405 nm Laserleistung, eine mittlere Dichte von Einzelmolekül in das Sichtfeld (siehe Schritt 6.18) zu halten. Die 488 Laserleistung auf 20-30 % zu verringern, wenn der 405 Laser höher als 15 %. Dann sinken Sie allmählich die 488 während der 405 Laserlinie zu erhöhen, um das Blinken der Moleküle so schnell wie möglich zu halten. 488 Laserlinie gepaart mit 561 Erregung Laser mit maximaler Intensität steigt auf sowohl die Tarife der Fluorophore, während 405 Laserlinie nur die weiter steigt.
16. Die Übernahme, wenn mehr als 500 000 Lokalisierungen (nach ca. 20 000 Frames) erreicht haben, oder mehr zu stoppen, blinkende keine weitere Moleküle. Speichern Sie die Rohdaten der Sturm-Übernahme mit dem .czi-Format.
    Hinweis: Beginnen Sie immer mit der höheren Wellenlänge, Bleichen (oder Aktivierung) von den anderen Farben zu vermeiden. Da die Chamlide Kammer nicht versiegelt ist, ist es möglich den bildgebenden Puffer regelmäßig, z. B. zu ändern, verschiedene Pufferbedingungen zu testen. Mit 488 Laserlinie, die Alexa 555 Farbstoffe zum Abbau ist erforderlich, nur wenn die 561 Laserleistung (mit 100 mW Laser) beschränkt.

(7) Bildrekonstruktion (5 min)

1. Verwenden Sie im PAL-Drift -Tool Modell-basierte Korrektur mit automatischen Segmente mit einer maximalen Größe von 8. Drücken Sie anwenden mehrmals hintereinander, bis die Drift korrigiert wird. Diese Modell-basierte Korrektur gilt einen Algorithmus basiert auf Kreuzkorrelation Analyse, die die Drift korrigiert.
2. Mithilfe der Tools zur PAL-Filter verbessern Sie das Aussehen des Bildes Sturm durch die Auswahl nur Moleküle, die am besten lokalisiert wurden. Z. B. begrenzen die Genauigkeit der Lokalisierung bis 30 nm und die PSF auf 120-180 nm.
3. Verwenden Sie eine Pixelauflösung von 5 oder 10 nm in der PAL-Render -Tool sowie einen "glockenförmig" Anzeigemodus mit Ausbau-Faktor 1 PSF Rendern wählen Sie automatische Dynamikbereich HR mit einem Wert von 95 % und Render Auto Auflösungsbereich SWF-Datei mit einem Wert von 90 %. Wählen Sie beste Qualität rendern.
4. Wählen Sie PALM konvertieren, im PALM -Menü der Registerkarte " Ablauf " (Post-processing-Modus). Drücken Sie auf auswählen , und dann anwenden. Das erstellte Image mit einem Format zu speichern. LSM (und nicht .czi, sehr wichtig).
   Hinweis: Die Bildrekonstruktion kann unmittelbar nach dem Erwerb oder der späteren Verwendung des Bildverarbeitung-Modus der Datenerfassungs-Software durchgeführt werden. In den Off-Line Post-processing-Modus ist es möglich, die Stapel mit unterschiedlichen Werten der Parameter (Maskengröße Peak, Peak-Intensität zu Lärm) zu diagnostizieren. Wählen Sie immer "verwerfen überlappende Moleküle" und nicht "durchschnittliche vor der Lokalisierung".

(8) Schätzung der Lokalisierung Präzision eines Sturm-Images (10 min)

1. Öffnen Sie Ihre Sturm-Rohdaten und verwenden Sie die Bildverarbeitung tab. Wählen Sie die PALM -Methode und dann PALM wieder. Drücken Sie, Wählen Sie.
2. Klicken Sie auf anwenden um den Wiederaufbau unter Verwendung einer Maske Maximalgröße von 9 und eine Peak-Intensität Lärm von 6 (oder die Parameter wählen Sie für das Bild) zu starten.
3. Wählen Sie das Rechteckwerkzeug Grafik und zeichnen Sie ein Rechteck auf das raw-Bild um ein einzelnes Molekül anwesend auf der Glasoberfläche. In der Regel gibt es dort ein paar einzelne Moleküle.
4. Presse übernehmen wieder, und nur die Moleküle innerhalb des Rechtecks-Bereichs werden analysiert.
5. Wählen Sie in der PAL-Statistik -Tool Plot Typ: Histogramm und Histogramm Quelle: X oder Y Position, um die Position Histogramme zu visualisieren.
6. Speichern Sie die Tabelle mit der Liste der Lokalisierungen auf der linken Seite unter den Bildern.
7. Mit Hilfe einer Software der Datenanalyse, erstellen die Histogramme der X und Y-Positionen (Abbildung 1).
8. Passen Sie die Verteilungen von einem Gauß und speichern Sie die σ_X und σ_Y -Werte zu. Die Lokalisierung Präzision σ_SMLM wird geschätzt durch (σ_{X *}σ_Y) ^ 0.5.
9. Wiederholen Sie Schritt 8,3 8,8 auf so viele Moleküle wie möglich und die durchschnittliche σ_SMLM

9. Kanal-Registrierung (5 min)

1. Öffnen Sie das Sturm-Bild von jeder Farbe mit Hilfe der Software von Fidschi (Bild J).
2. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug, um die Positionen der einzelnen Tetraspeck Perlen zu messen.
3. Berechnen Sie die X- und Y-Schichten für jede Perle und sie im Durchschnitt.
4. Mit dem Befehl "Übersetzen", das zweite Bild mit den berechneten übersetzen X und Y Schichten.
5. Verbinden Sie die beiden Bilder mit dem Befehl Kanäle zusammenfügen.

Ergebnisse

Ein Mikroskop mit 50 mW 405 nm und 100 mW 488, 561 und 642 nm Festkörperlaser, einer EMCCD Kamera 512 x 512, Alpha Plan Apo 100 X / 1,46 Ziel und Band Pass 570-650 / lange Pass 655 Emission Filter diente für die repräsentativen Ergebnisse dargestellt.

Abbildung 1A gibt ein Beispiel für Molekül Dichte und Signal Rauschabstand, die während der raw-Bildakquisition verwendet werden sollte. Bilder ...

Diskussion

Wichtige Schritte im Protokoll

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das Artefakte in den dSTORM Bildern von Mikrotubuli und IFs in Gliazellen minimiert. Artefakte können erstellt werden, bei jedem Schritt der Probenvorbereitung und Bildgebung: Fixierung, Blockierung, Immunolabeling, treiben während der Akquisition, suboptimale blinkende Bedingungen²³. Nachfolgend die wichtigsten Schritte auflisten

Reinigung der Deckgläser...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2