Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

Resumen

El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células fijas

Resumen

El citoesqueleto, compuesto de microfilamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios (IF), desempeña un papel clave en el control de la forma celular, la polaridad y la motilidad. La organización de las redes de actina y microtúbulos ha sido extensamente estudiada pero de IFs no es todavía completamente caracterizado. IFs tiene un diámetro promedio de 10 nm y forma una red que se extiende por todo el citoplasma de la célula. Se asocian físicamente con actina y microtúbulos a través de motores moleculares y linkers del citoesqueleto. Esta asociación estrecha está en el corazón de los mecanismos de regulación que garanticen la regulación coordinada de las tres redes citoesqueléticas necesarios para la mayoría de las funciones de la célula. Por lo tanto, es fundamental visualizar IFs solas y también conjuntamente con cada una de las otras redes citoesqueléticas. Sin embargo, las redes de IF son extremadamente densas en más tipos de células, especialmente en células gliales, que hace que su resolución sea muy difícil de conseguir con microscopía de fluorescencia estándar (lateral resolución de ~ 250 nm). Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es una técnica que permite un aumento en la resolución lateral de un orden de magnitud. Aquí, mostramos que resolución dSTORM lateral es suficiente para resolver la organización densa de las redes de IF y, en particular, de los paquetes de IF que rodea a los microtúbulos. Asociación tan apretado es probable que participan en la regulación coordinada de estas dos redes y mayo, explicar cómo plantilla de IFs vimentin y estabilizar la organización microtubular como podría influir en tráfico vesicular dependiente de microtúbulos. Más en general, nos muestran cómo la observación de dos componentes citoesqueléticos con técnica de doble color dSTORM trae nuevas perspectivas en su mutua interacción.

Introducción

Filamentos intermedios citoplasmáticos (IFs) son 10 nm de diámetro homo - o heteropolymers de un subconjunto específico de tipo de célula de las proteínas de los IF. IFs participan en una amplia gama de funciones celulares tales como respuestas de motilidad, proliferación y estrés celular. Su papel fundamental se destaca por el hecho de que más de 90 enfermedades humanas son causadas directamente por las mutaciones en las proteínas de la IF; por ejemplo, cambios en la composición de IF acompaña a crecimiento del tumor y propagación^1,2,3. Existe una creciente evidencia de que los tres sistemas de citoesqueleto trabajan en colaboración para el control de las funciones celulares tales como polarización celular, división y migración^2,3. Puesto que hay un acoplamiento apretado entre la arquitectura espacial y funciones, es crucial obtener ideas sobre la organización estructural de la IF con los otros filamentos y comprender mejor la diafonía citoesqueleto. Este artículo proporciona un protocolo para llevar a cabo la resolución súper técnica doble color dSTORM (directo estocástico reconstrucción microscopía óptica)⁴ y cómo se utiliza para investigar la interacción entre si y microtúbulos en fijo, cultivadas células en 2 dimensiones (2D).

Varias técnicas de superresolución se han desarrollado durante el pasado decenio y descubrimientos allí estaban en el origen del Premio Nobel de química en 2014⁵. Entre todas estas técnicas se encuentra los molécula única localización métodos como PALM⁶ (microscopía de localización Photo-Activated) que utiliza proteínas fluorescentes fotoconmutables, tormenta⁷ con pares de fluoróforos o dSTORM⁴ con fluoróforos convencional. Todos estos métodos se basan en el mismo principio que consiste en (i) el interruptor de la mayoría de los reporteros fluorescentes en un estado de "off" "la estado de (no fluorescente), (ii) la activación estocástica de un subconjunto de ellos en un fluorescente para localizar su posición espacial con precisión de nanómetros y (iii) la repetición de este proceso para activar tantos subconjuntos de fluoróforos como sea posible. Una imagen final es reconstruida usando todas las localizaciones de las moléculas activadas, proporcionando una resolución lateral de ~ 20-40 nm. Varios sistemas ópticos comercializados que tormenta de Palma ya están disponibles para los biólogos para experimentos de la rutina. Aquí, un sistema de este tipo fue utilizado para el estudio de la Asociación estructural de los microtúbulos e IFs. Entre todos los sola molécula basada en la localización de métodos, la técnica de doble color dSTORM fue seleccionada, porque es idóneo para observar las regiones laminares muy finas (< 1 μm) de células adherentes y pueden proporcionar una mejoría significativa de la resolución de la imagen con inversión mínima de tiempo y dinero. De hecho, dSTORM es una técnica muy conveniente y versátil que es compatible con el estándar colorantes orgánicos habitualmente utilizados para la tinción celular e inmunofluorescencia.

Mientras que un color dSTORM imágenes son relativamente fáciles de obtener con el fluoróforo Alexa647⁸, color doble dSTORM requiere para optimizar las condiciones experimentales para que dos tintes pueden parpadear correctamente en el buffer elegido, especialmente cuando hay limitada energía del laser. Excelentes artículos ya están disponibles en los métodos para crear imágenes de múltiples colores con dSTORM^{9,10,11,12,13}, y estos documentos explican detalladamente las posibles fuentes de artefactos y la resolución de la imagen degradada y cómo superarlos. En este artículo, las condiciones experimentales óptimas en términos de fijación de las células, immunostaining, preparación de muestras, adquisición de imágenes y reconstrucción de la imagen se describen para adquirir imágenes de densas redes de IF citoplásmicas y microtúbulos en células gliales con doble color dSTORM. Brevemente, el método de extracción/fijación descrito en Chazeau et al¹² fue adaptado a las células gliales y utilizado con un paso de la fijación, concentración de anticuerpos optimizado, un búfer de tormenta con 10 mM MEA descrito en⁹ de Dempsey et al. que fue encontrado para ser óptimo para el montaje experimental y el tipo de muestra.

Células gliales expresan principalmente tres tipos de proteínas de los IF: vimentina, nestina y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Estas tres proteínas mostraron Co polimerizarse en astrocitos¹⁴. Previamente demostramos mediante microscopía de iluminación súper resolución estructurada (SR SIM) que estas tres proteínas IF pueden encontrarse en el mismo filamento único de IF y que muestran similar dinámica y distribución en las células gliales ¹⁵. Debido a las similitudes entre las tres proteínas de IF, vimentin tinción fue utilizado como reportero para la red IF. Con dSTORM, hemos logrado resolver cómo haces de forma IF a lo largo de los microtúbulos, que no era posible con la difracción limitada de técnicas de microscopía¹⁵. Estas observaciones pueden ayudar a entender cómo vimentin IFs pueden microtúbulos de plantilla y regular la trayectoria de crecimiento, promoviendo el mantenimiento de un eje de polaridad durante la migración de la célula¹⁶. Imágenes de súper-resolución proporcionaron información clave en la interacción mutua de los dos subsistemas de citoesqueleto y trajeron la visión de la relación entre Asociación espacial y función local que podría ser el tipo de célula específica¹⁷. En general, dSTORM dos colores puede utilizarse para el estudio de la diafonía entre elementos citoesqueléticos u otros tipos de organelos, que immunostaining buenas condiciones se alcanzan en términos de densidad y especificidad. Esta técnica será útil para caracterizar mejor a los cambios del citoesqueleto observados astrogliosis y glioblastoma, el tumor más frecuente y más maligno del sistema nervioso central, donde la expresión de proteínas de IF es alterado ^{18 ,19,20,21}.

Protocolo

1. cubreobjetos preparación (día 1, 30 min)

1. Colocar el cubreobjetos de vidrio 18 mm nº1.5H (170 μm +-5 μm) en una rejilla de plástico.
2. Poner la rejilla en un vaso de precipitados de 100 mL con acetona y remojo durante 5 minutos.
3. Transferencia de la bandeja un vaso de precipitados de 100 mL con etanol absoluto y remojo durante 5 minutos.
4. Transferencia de la parrilla un nuevo vaso de precipitados de 100 mL con etanol absoluto y colocar el vaso en un dispositivo limpiador ultrasónico (véase tabla de materiales) a temperatura ambiente. Presione "on" y esperar 10 minutos.
5. Rack bajo campana de flujo laminar y el cubre-objetos seco o seco el cubreobjetos con el flujo de aire filtrado.
6. Poner la rejilla con cubreobjetos en un dispositivo limpiador de plasma. Encienda la bomba de vacío, cerrar la puerta, espere 3 minutos hacer el vacío y poco después de la limpieza del interruptor en el plasma durante 1 minuto uso el cubreobjetos. No los guarde.

2. galjanoplastia (1 día, 20 min) de la célula

1. Crece la línea celular glial U373 en medio esencial mínimo (MEM) con 10% Suero Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina, 1% no esenciales aminoácidos y en plato de petri plástico de 10 cm de diámetro.
2. Colocar el cubreobjetos de vidrio limpio en placas 12-bien debajo de la campana de flujo laminar y agregar 1 mL de medio de celular precalentado por pozo.
3. Tomar un plato que contiene las células de la incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO₂).
4. Quite el medio y añadir 10 mL de PBS.
5. Retirar el PBS y añadir 1 mL 0.05% tripsina-EDTA.
6. Vuelva a colocar el plato en la incubadora durante 2-3 minutos.
7. Añadir 10 mL de medio caliente precalentado a 37 ° C en el plato y resuspender las células.
8. Semillas alrededor de 100 000 células por pocillo (~ 150 μL de células) en las placas de 12 pocillos que contienen el cubreobjetos.
9. Espere al menos 6 h (o noche) permitir la difusión de la célula.

3. fijación de cell (día 2, 2h)

1. Preparar el buffer del citoesqueleto con tubos de 80 mM, 7 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl y ajustar el pH a 6,9.
2. Lavar las células una vez con PBS.
3. Retirar el PBS y suavemente añadir 1 mL por pocillo de la solución de extracción/fijación (glutaraldehído al 0.25%, 0.3% Tritón X-100 en el búfer de citoesqueleto) precalentado a 37 ° C.
4. Incubar por 60 s a temperatura ambiente.
5. Retirar la solución y suavemente añadir 1 mL por pozo de precalentado y recién preparado 4% solución PFA (paraformaldehído) diluido en el búfer de citoesqueleto.
   PRECAUCIÓN: Utilice guantes y trabajar bajo la campana química.
6. Coloque la placa de 12 pozos en la incubadora a 37° C durante 10 minutos.
7. Retire la PFA y añadir 3 mL de PBS por pozo.
   Nota: Trabajar debajo de la campana química con guantes y poner la PFA reciclado en una ubicación específica.
8. Lavar dos veces con PBS.
9. Retirar el PBS y añadir solución recién preparada 10 mM NaBH₄ diluido en PBS con el fin de saciar el autofluorescence de glutaraldehído.
10. Incubar durante 7 min a temperatura ambiente.
11. Poner el reciclado de NaBH₄ en una ubicación específica.
12. Lavar tres veces con PBS 5 min.
13. Retire el PBS y la solución de bloqueo (5% solución de BSA en PBS).
14. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C).
    Nota: El búfer del citoesqueleto puede almacenarse a temperatura ambiente durante unos meses. PFA, NaBH₄ y glutaraldehído deben manejarse con especial cuidado (capucha, guantes y contenedores de reciclaje específicos). Soluciones se deben agregar y quitar suavemente con el fin de preservar la integridad de las células. Es importante no dejar que las células secas.

4. inmunotinción (día 2, 5h)

1. Preparar la solución de anticuerpos primarios anti-vimentina y anti-tubulina con una dilución de 1: 500 en la solución de bloqueo.
2. Poner gotas de 100 μl de anticuerpos primarios diluidos sobre una capa de película de parafina y colocar el cubreobjetos encima de ellos con celdas hacia abajo.
3. Incubar las células con anticuerpos primarios para 2 h. Ponga el cubreobjetos en una placa de 12 pozos llenos con PBS. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS a temperatura ambiente en un agitador orbital.
4. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos secundaria usando anti-ratón Alexa647 y anti-rata Alexa555 a la dilución de un 1:1, 000 en la solución de bloqueo. Incubar las células con anticuerpos secundarios por 1 h a temperatura ambiente. Proceder como 4.2. proteger las células de la luz.
5. Volver a poner el cubreobjetos en una placa de 12 pozos llenada de PBS. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS a temperatura ambiente en un agitador orbital. Retirar el PBS y añadir 0,5 mL de PBS con 1 μl de 0,1 μm de tetraspeck.
6. Poner los pocillos en un agitador orbital para 30 minutos enjuague con PBS. Retirar el PBS e incubar las células durante 5 minutos con una solución PFA 4% en PBS. Enjuague tres veces en PBS.
   Nota: Las células fijas pueden conservarse durante un par de semanas en PBS a 4° C. Inmunotinción puede hacerse en el último minuto.

5. preparación (día 3, 5 min)

1. Poner alícuotas de MEA (cisteamina, 1 M, pH 8,3), glucosa oxidasa (100 x, 50 mg/mL), catalasa (500 x, 20 mg/mL) en una cesta de hielo.
2. Preparar 50 mL de tampón de Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) suplementado con 10% de glucosa (100 mg/mL).
3. Preparar 1,2 mL de tampón justo antes de la proyección de imagen de 10 mM MEA, oxidasa de glucosa 0, 5 mg/mL (75 U/mL), la catalasa de 40 μg/mL (80-200 U/mL) la proyección de imagen en el tampón de Tris-NaCl con 10% de glucosa.
4. Monte el cubreobjetos que contiene las células etiquetadas en el portamuestras magnética (e.g. cámara de chamlide) y añadir el buffer de imagen para llenar completamente la cámara. Ponga la tapa en y asegúrese de que no existe ninguna burbuja de aire entre la tapa y el buffer de imagen.
5. Limpiar la superficie de la muestra con etanol absoluto y verificar que no hay escape. Utilice grasa para sellar el portamuestras correctamente si es necesario.
   Nota: Preparar 1 M stock de solución MEA (pH 8.3 ajustado con ácido clorhídrico), acción de la oxidasa de glucosa 50 mg/ml y acción de la catalasa en 20 mg/mL en el agua, hacer alícuotas y almacenarlos a-20 ° C hasta por un mes para MEA y un año para glucosa oxidasa y catalasa. No vuelva a congelar alícuotas. Preparar el tampón de Tris-NaCl con antelación y almacenar a temperatura ambiente durante varios meses. Añadir la glucosa el día del experimento (paso 5.3).

6. adquisición de imágenes (día 3, ~ 1h por celda)

1. Encienda el microscopio. Encender el software de adquisición y presione Start sistema.
2. Seleccione la adquisición ficha expandir la herramienta de Configuración de imágenes en el grupo de herramienta de administrador de configuración. Seleccione el modo láser WF (gran campo) de adquisición. Seleccione el objetivo 100 X NA 1.46 . Seleccione el modo TIRF u-HP que utiliza un colimador para reducir el campo de visión se ilumina y concentrar la energía del láser en un área más pequeña. Utilice el optovar de la lente 1.6 x que da un tamaño de píxel de 100nm.
3. Seleccione la herramienta de series de tiempo y establecer el lapso de tiempo con los marcos de 50.000 y ms 0.0 entre marcos. Expanda la herramienta de canales en el grupo de herramienta de parámetros de adquisición y seleccione "Mostrar todo".
4. Configurar la pista Alexa647: retirar la 642 405 líneas para la excitación del laser y aceptar para activar el. Seleccione el filtro de emisión "655 LP" en la Configuración de imagen. Cambiar el nombre de "647".
5. Haga clic en '+' en la herramienta de canales para agregar otro paso de luz y seleccionar el modo de "interruptor de pista cada: marco" en la herramienta de Configuración de imágenes . Compruebe 561, 488 y láser de 405 líneas y aceptar para activar el. Seleccione el "BP 570-650 + LP750" emisión filtro y uso optovar lente 1.6 x. Compruebe que está seleccionado el modo de TIRF-uHP. Cambiar el nombre de la pista "555".
6. Seleccione la herramienta modo de adquisición y establecer el tamaño de marco 200 x 200 píxeles. Seleccione la herramienta estrategia y dispositivos de enfoque y ajustar el enfoque definido a 1 000 marcos (si existe un sistema de bloqueo de enfoque).
7. Poner el aceite en el objetivo y la muestra en. Seleccione la ficha Localice y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia. Encontrar el foco y buscar la celda a la imagen utilizando el ocular. Poner en el centro del campo de visión utilizando el joystick.
8. Seleccione la ficha de adquisición para volver al modo de adquisición. Seleccione la pista "647" ajustar la potencia del láser 642 al 0,2%, la potencia del láser de 405 se establece en 0, configurar el tiempo de exposición a 50 ms y la ganancia de 50. Seleccione el modo de adquisición continuo observar la célula en la pantalla. Ajuste el enfoque. Asegúrese de que hay al menos un grano de tetraspeck en el campo de visión, aumenta el contraste para ver si es necesario. Utilizar un modo de escala automática de la pantalla. Tomar una imagen de epifluorescencia de campo amplio de la red de vimentina haciendo clic en ajustar y guardar. Para comprobar la iluminación de la TIRF, haga clic en TIRF, ajustar el ángulo de iluminación o colimador si es necesario tener un campo de iluminación homogéneo y guardarlo.
   Nota: Es importante que las imágenes TIRF y epifluorescente son de alta calidad antes de iniciar la adquisición de datos. Filamentos discontinuos, no uniformemente marcados dará lugar a imágenes de pobre calidad dSTORM.
9. Desactive la pista "647" y seleccione y marque la pista "555". Tomar una imagen de epifluorescencia de la red de microtúbulos y guárdelo. Tomar una imagen de la TIRF y ahorrar demasiado.
10. Desactive la pista "555", seleccione y verifique la pista "647", luego oprima continuo. Poner la ganancia a 0 y tiempo de exposición a la Sra. 10 establece el poder de 642 nm láser al 100% para la mayoría de los tintes Alexa647 la bomba al Estado oscuro (~ 2 kW/cm²). Una vez que los fluoróforos empiezan a parpadear, ponga la exposición a 15 ms y ganar hasta 300. Seleccione el modo TIRF de iluminación. Utilice el modo de indicador de rango sin escala automática para verificar que las señales a la sola molécula no saturan la cámara (indicada por el color rojo). En ese caso, disminuye la ganancia hasta que desaparezca la saturación. Tetraspeck granos permanecerá saturados al inicio de la adquisición. Pulse detener para detener la continua observación de la célula.
11. Expandir la herramienta en línea de procesamiento y verifique Online procesamiento PALM para visualizar la imagen de la tormenta durante la adquisición. Utilice los siguientes parámetros: 9 para el tamaño de la máscara de pico (diámetro 9 píxeles) y 6 para la intensidad de pico al ruido. Parámetros de tesis se definen las moléculas que se tienen en cuenta en el proceso (lo suficientemente brillante y no superpuestas). La herramienta Estadísticas de PAL , seleccione el tipo de parcela: histogramae histograma fuente: precisión. Pulse iniciar adquisición.
12. Durante la adquisición, vuelva a enfocar si es necesario (si no hay ningún dispositivo de bloqueo de enfoque). Ajustar los parámetros (exposición, potencias de láser) y finalmente en la línea de láser de 405 nm (a partir de 0,001%) mantener una densidad media de fluoróforos con una distancia mínima de 1 μm entre moléculas individuales (> 9 píxeles de 100 nm, el tamaño de la máscara de pico) ( Figura 1A-B). Si la densidad de la molécula es un poco demasiado alta, use el modo de HILO (muy inclinado y laminado óptica hoja) de la iluminación en lugar de TIRF. Esto aumentará la potencia del láser en un 20%. Asegúrese de que el pico de la precisión de la localización en el histograma debajo de la imagen reconstruida se centra alrededor o por debajo de 10 nm.
    Nota: Generalmente el número de moléculas disminuye con el tiempo, y la potencia del láser de 405 nm aumenta lentamente en consecuencia. El objetivo es disminuir la precisión de localización (histograma aparece debajo de la imagen de la estupendo-resolución) tanto como sea posible con un pico por debajo de 10 nm (figura 1). Aumentar el contraste de la imagen de Palma si es necesario, si hay demasiadas perlas brillantes en el campo.
13. Pulse detener para detener la película cuando se han alcanzado más de 10 localizaciones de⁶ (por lo general después de 40 000 marcos). Poner los lasers a 0.2% (642 nm) y 0 (405 nm). Guardar los datos raws de la adquisición de tormenta con el formato .czi. Desactivar pista "647" en la herramienta de canales y seleccione comprobar pista "555".
14. Configurar el tiempo de exposición a 25 ms y ganancia a 0. Presione el botón de continuo y sistema láser 488 y 561 al 100% a los tintes de Alexa555 de la bomba al Estado oscuro (~ 2 kW/cm² cada uno). Una vez que los fluoróforos empiezan a parpadear, que la ganancia de 250, utilice el modo de iluminación de HILO y comprobar que las moléculas individuales no saturan la cámara con el modo de indicador de escala. Si ese es el caso, disminuya la ganancia. Pulse Stop. Disminuir la energía del laser de 488 al 50%.
15. Pulse iniciar adquisición. Durante la adquisición, aumente progresivamente la ganancia para estar siempre en el límite de saturación. Aumentar gradualmente la potencia del láser de 405 nm para mantener una densidad media de una molécula en el campo de visión (ver paso 6.18). Disminuir la energía del laser de 488 a 20-30% cuando el láser 405 es superior al 15%. Luego disminuya gradualmente la 488 aumentando la línea de 405 láser para evitar el parpadeo de las moléculas lo más rápido posible. La línea de 488 láser juntada con el láser de 561 excitación a intensidad máxima aumenta en tanto el descuento en tarifas de los fluoróforos, mientras que la línea de 405 láser sólo aumenta la tasa de.
16. Detener la adquisición cuando se haya llegado a localizaciones más de 500 000 (después de unos 20 000 marcos) o más cuando no hay más moléculas están parpadeando. Guardar los datos raws de la adquisición de tormenta con el formato .czi.
    Nota: Comience siempre con la mayor longitud de onda para evitar la decoloración o la activación de los otros colores. Puesto que no se sella la cámara de chamlide, es posible cambiar el buffer de imagen regularmente, por ejemplo, para probar las condiciones de amortiguamiento diferentes. Usar la línea de láser de 488 a agotar los tintes Alexa 555 es necesario sólo cuando la energía del 561 laser (con láseres de mW 100).

7. reconstrucción de imagen (5 min)

1. La herramienta PAL-Drift , utilizando el tipo de corrección basado en el modelo automáticos segmentos con un tamaño máximo de 8. Pulse aplicar varias veces seguidas hasta que se corrija la deriva. Esta basado en el modelo de corrección se aplica un algoritmo basado en el análisis de correlación cruzada que corrige la deriva.
2. Utilizando las herramientas de Filtro de PAL , mejorar el aspecto de la imagen de tormenta seleccionando sólo las moléculas que fueron mejor localizadas. Por ejemplo, limitar la precisión de la localización a 30 nm y la PSF a 120-180 nm.
3. Utilice una resolución de pixel de 5 o 10 nm en la herramienta render PAL , así como un modo de visualización gaussiano, con un factor de expansión de 1 PSF. Seleccione Render auto rango dinámico HR con un valor de 95% y rango dinámico de auto de procesamiento SWF con un valor de 90%. Seleccionar la mejor calidad de Render.
4. Seleccione convertir de Palma, en el menú de la Palma de la ficha de proceso (modo postproceso). Pulse seleccionar y aplicar. Guardar la imagen creada con un formato. LSM (y no .czi, muy importante).
   Nota: La reconstrucción de la imagen puede realizarse inmediatamente después de la adquisición o más adelante usando el modo de procesamiento de imágenes de software de adquisición de la. En el modo de procesamiento posterior fuera de la línea, es posible analizar las pilas con diferentes valores de los parámetros (tamaño de la máscara de pico, intensidad máxima de ruido). Siempre elija "Descabar superpuestas de las moléculas" y no "promedio antes de localización".

8. estimación de la precisión de la localización de una imagen de la tormenta (10 min)

1. Abra los datos crudos de tormenta y utilice el procesamiento de imágenes ficha Seleccione el método de la Palma y luego Palma otra vez. Presione Selecc.
2. Pulse aplicar para iniciar la reconstrucción utilizando un tamaño de máscara de pico de 9 y una intensidad de pico de ruido de 6 (o los parámetros que usted elija para la imagen).
3. Seleccione la herramienta de gráficos de rectángulo y dibuje un rectángulo en la imagen cruda alrededor de una sola molécula presente en la superficie de vidrio. Generalmente son unas moléculas individuales allí.
4. Presione aplicar otra vez y sólo las moléculas presentes dentro de la región del rectángulo serán analizada.
5. La herramienta Estadísticas de PAL , seleccione el tipo de parcela: histograma y fuente del histograma: X o Y, visualizar los histogramas de posición.
6. Guarde la tabla con la lista de localizaciones de la izquierda debajo de las imágenes.
7. Utilizando un software de análisis de datos, crear histogramas de X y Y (figura 1).
8. Ajuste de las distribuciones por una gaussiana y guardar el σ_X y σ_Y valores. El σ de la precisión de localización_SMLM se calcula por (σ_{X *}σ_Y) ^ 0.5.
9. Repita el paso 8.3-8.8 en tantas moléculas como sea posible y media σ_SMLM

9. canal registro (5 min)

1. Abre la imagen de la tormenta de cada color con el software de Fiji (imagen J).
2. Seleccione la herramienta varita mágica para medir las posiciones de cada tetraspeck los granos.
3. Calcular los cambios de X y Y para cada cuenta y los promedio de.
4. Utilice el comando "Traducir" para traducir la segunda imagen con el calculado turnos X e Y.
5. Fusionar las dos imágenes utilizando el comando combinar canales.

Resultados

Un microscopio equipado con 50 mW 405 nm y 100 mW 488, 561 y 642 nm láseres de estado sólido, un EMCCD cámara de 512 x 512, un alfa Apo Plan 100 X / 1,46 objetivo banda pasar 570-650 y pase largo 655 filtros de emisión se utilizó para los representante resultados presentados a continuación.

Figura 1A da un ejemplo de molécula densidad y señal a ruido que se debe utilizar durante la adquisici...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo

Aquí presentamos un protocolo que reduce al mínimo los artefactos en las imágenes dSTORM de los microtúbulos e IFs en células gliales. Cada paso de la preparación de la muestra y proyección de imagen pueden crear artefactos: fijación, bloqueo, inmunomarcación, a la deriva durante la adquisición, no óptima intermitente condiciones²³. Enumeramos a continuación los pasos más críticos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2