I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

Riepilogo

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di dare le condizioni sperimentali ottimali dalla preparazione del campione per acquisizione di immagini e la ricostruzione al fine di eseguire immagini dSTORM 2D doppio colore dei microtubuli e filamenti intermedi in celle fisse

Abstract

Il citoscheletro, composto di microfilamenti di actina, microtubuli e filamenti intermedi (IF), svolge un ruolo chiave nel controllo della forma delle cellule, la polarità e la motilità. L'organizzazione delle reti di actina e dei microtubuli è stato studiato estesamente, ma quella di IFs non è ancora pienamente caratterizzato. IFs hanno un diametro medio di 10 nm e forma una rete che si estende in tutto il citoplasma delle cellule. Sono fisicamente associate con l'actina e i microtubuli attraverso motori molecolari e linker del citoscheletro. Questa stretta associazione è al centro dei meccanismi normativi che garantiscono la regolazione coordinata delle tre reti del citoscheletro necessari per la maggior parte delle funzioni delle cellule. È pertanto fondamentale per visualizzare IFs da solo e anche insieme a ciascuna delle altre reti del citoscheletro. Tuttavia, se le reti sono estremamente dense nella maggior parte dei tipi di cellule, soprattutto nelle cellule gliali, che rende molto difficile da raggiungere con microscopia di fluorescenza standard la sua risoluzione (risoluzione di ~ 250 laterale nm). Microscopia ottica stocastica diretta di ricostruzione (dSTORM) è una tecnica che permette un guadagno nella risoluzione laterale di un ordine di grandezza. Qui, indichiamo che laterale dSTORM risoluzione è sufficiente per risolvere l'organizzazione densa delle reti se e, in particolare, dei pacchi di se che circondano i microtubuli. Tale stretta associazione è probabile che partecipano alla regolazione coordinata di queste due reti e maggio, spiegare come modello IFs vimentin e stabilizzare la organizzazione dei microtubuli, nonché potrebbe influenzare il traffico vescicolare dipendente dei microtubuli. Più in generale, vi mostriamo come l'osservazione di due componenti citoscheletriche con tecnica dual-color dSTORM porta nuova comprensione nella loro reciproca interazione.

Introduzione

I filamenti intermedi citoplasmatici (IFs) sono 10 nm di diametro omo - o eteropolimeri di un sottoinsieme specifico del tipo di cella di proteine se. IFs partecipare a una vasta gamma di funzioni cellulari quali risposte di motilità, proliferazione e lo stress delle cellule. Loro ruolo chiave è evidenziato dal fatto che più di 90 malattie umane sono direttamente causati da mutazioni in proteine se; per esempio, cambiamenti nella composizione se accompagna la crescita del tumore e la diffusione di^1,2,3. Vi è crescente evidenza che i tre sistemi di citoscheletro lavorano in collaborazione per controllo funzioni cellulari quali la polarizzazione della cellula, divisione e migrazione^2,3. Poiché non vi è un accoppiamento stretto tra architettura spaziale e funzioni, è fondamentale ottenere approfondimenti l'organizzazione strutturale del se con altri filamenti e capire meglio il cross-talk del citoscheletro. Questo articolo fornisce un protocollo per eseguire il Super-risoluzione tecnica dual-color dSTORM (diretto stocastico microscopia ottica a ricostruzione)⁴ e come utilizzarlo per studiare l'interazione tra se e i microtubuli in fisso, coltivate cellule in 2 dimensioni (2D).

Diverse tecniche di Super-risoluzione sono state sviluppate nel corso degli ultimi dieci anni e là scoperte furono all'origine del premio Nobel in chimica nel 2014⁵. Tra tutte queste tecniche si trova i metodi basati su localizzazione singola molecola come PALM⁶ (Photo-Activated localizzazione microscopia) che utilizza proteine fluorescenti fotomodulabili, tempesta⁷ con coppie di fluorofori o dSTORM⁴ con fluorofori convenzionali. Tutti questi metodi sono basati sullo stesso principio che consiste di (i) l'interruttore della maggior parte dei reporter fluorescente in un stato "spento" "di stato (ii) l'attivazione stocastica di un sottoinsieme di essi in una fluorescente (non fluorescente), al fine di localizzare loro posizione spaziale con precisione nanometrica e (iii) la ripetizione di questo processo al fine di attivare come molti sottoinsiemi di fluorofori come possibile. Un'immagine finale viene ricostruita utilizzando tutte le localizzazioni delle molecole attivate, fornendo una risoluzione laterale fino a ~ 20-40 nm. Diversi sistemi ottici commercializzati permettendo PALM/STORM sono ora disponibili per i biologi per esperimenti di routine. Qui, uno di questi sistemi è stato usato per studiare l'associazione strutturale dei microtubuli e IFs. Tra tutti i singola molecola basati su localizzazione metodi, la tecnica di doppio-colore dSTORM è stata selezionata, perché è adatto per osservare regioni lamellare molto sottile (< 1 µm) delle cellule aderenti e può fornire un significativo miglioramento della risoluzione dell'immagine con investimento minimo di tempo e denaro. Infatti, dSTORM è una tecnica molto comoda e versatile che è compatibile con i coloranti organici standard abitualmente utilizzati per la colorazione cellulare e immunofluorescenza.

Mentre un colore dSTORM immagini sono relativamente semplici da ottenere utilizzando il fluoroforo Alexa647⁸, dSTORM doppio colore richiede per ottimizzare le condizioni sperimentali, in modo che due coloranti possono lampeggiare correttamente nel buffer selezionate, soprattutto quando c'è limitato potere del laser. Eccellente documenti sono già disponibili sui metodi per impostare la pagina di formazione immagine di multi-colore con dSTORM^{9,10,11,12,13}, e questi documenti spiegano in dettaglio le possibili fonti di artefatti e risoluzione dell'immagine degradata e come superarli. In questo articolo, le condizioni sperimentali ottimali in termini di cellule fissazione, immunostaining, preparazione del campione, sono descritti al fine di acquisire immagini di fitte reti di IF citoplasmatici e microtubuli in imaging acquisizione e ricostruzione dell'immagine cellule gliali con dual-color dSTORM. Brevemente, il metodo di estrazione/fissazione descritto in Chazeau et al¹² è stato adattato alle cellule gliali e utilizzato con un passaggio di post-fissazione, concentrazione di anticorpi ottimizzata, un buffer di tempesta con 10mm MEA descritto in Dempsey⁹ et al., che era risultati ottimali per la sperimentale messa a punto e il tipo di campione.

Cellule gliali esprimono principalmente tre tipi di proteine se: il vimentin, nestina e GFAP (proteina fibrillare acida). Queste tre proteine sono state indicate per co-polimerizzare in astrocytes¹⁴. Precedentemente abbiamo mostrato usando microscopia di Super-risoluzione strutturato illuminazione (SR SIM) che queste tre proteine se possono essere trovate nel singolo filamento di se stesso e consentono di visualizzare simile distribuzione e dinamica in cellule gliali ¹⁵. Dovuto le somiglianze tra le tre proteine di se, vimentin macchiatura è stata usata come reporter per l'intera rete di se. Utilizzando dSTORM, siamo riusciti a risolvere come fasci di forma se lungo i microtubuli, che non era possibile con la diffrazione limitata microscopia tecniche¹⁵. Queste osservazioni possono aiutare a comprendere come il vimentin IFs può microtubuli modello e regolare la loro traiettoria di crescita, promuovendo il mantenimento di un asse di polarità durante la migrazione di cellule¹⁶. Immagini di Super-risoluzione fornito informazioni chiave sull'interazione reciproca dei due sottosistemi del citoscheletro e portato approfondire il legame tra associazione spaziale e funzione locale che potrebbe essere il tipo di cella specifici¹⁷. In generale, dSTORM dual-color consente di studiare il crosstalk tra elementi del citoscheletro o altri tipi di organelli, condizione che immunostaining buone condizioni sono raggiunti in termini di densità e specificità. Questa tecnica sarà utile per caratterizzare meglio i cambiamenti di citoscheletro osservati durante astrogliosis e nel glioblastoma, il tumore più comune e più maligni del sistema nervoso centrale, dove l'espressione di proteine se è alterato ^{18 ,19,20,21}.

Protocollo

1. vetrini coprioggetti preparazione (giorno 1, 30 min)

1. Posizionare le lamelle di vetro di 18 mm nº1.5H (170 µm + /-5 µm) su una cremagliera in plastica.
2. Inserite la griglia in un becher da 100 mL riempito con acetone e ammollo per 5 min.
3. Trasferimento del rack in un becher da 100 mL riempito con etanolo assoluto e ammollo per 5 min.
4. Trasferire il rack in un becher da 100 mL nuovo riempito con etanolo assoluto e porre il becher in un dispositivo di pulizia ad ultrasuoni (Vedi tabella materiali) a temperatura ambiente. Premere "on" e attendere per 10 min.
5. Inserite la griglia sotto cappa a flusso laminare e lasciare i coprioggetti asciugare o asciugare i vetrini coprioggetti con flusso di aria filtrata.
6. Mettere il rack con i vetrini coprioggetti in un dispositivo di pulizia al plasma. Accendere la pompa del vuoto, chiudere la porta, attendere 3 minuti fare il vuoto e accendere il plasma per 1 min. uso i coprioggetti poco dopo la pulizia. Non riporli.

2. cellula placcatura (1 giorno, 20 min)

1. Crescere la linea delle cellule gliali U373 in Medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale, 1% penicillina-streptomicina e l'1% non essenziali aminoacidi in piastre Petri in plastica di diametro 10cm.
2. Posto pulito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti sotto la cappa a flusso laminare e aggiungere 1 mL di medium preriscaldato cellule per pozzetto.
3. Prendete un piatto che contiene le cellule dall'incubatrice delle cellule (37 ° C, 5% CO₂).
4. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di PBS.
5. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL 0.05% tripsina-EDTA.
6. Posizionare il piatto indietro nell'incubatore per 2-3 min.
7. Aggiungere 10 mL di medium caldo preriscaldato a 37 ° C sul piatto e risospendere le cellule.
8. Seme circa 100 000 cellule per pozzetto (~ 150 µ l di cellule) nelle piastre 12-pozzetti contenenti i coprioggetti.
9. Attendere almeno 6 h (o durante la notte) consentire la diffusione delle cellule.

3. fixation cell (giorno 2, 2h)

1. Preparare il tampone di citoscheletro con tubi da 80 mM, 7 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl e regolare il pH a 6,9.
2. Lavare le cellule una volta con PBS.
3. Rimuovere il PBS e delicatamente aggiungere 1 mL / pozzetto di soluzione di estrazione/fissazione (0,25% glutaraldeide, 0,3% Triton X-100 nel buffer del citoscheletro) preriscaldato a 37 ° C.
4. Incubare per 60 s a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la soluzione e delicatamente aggiungere 1 mL per pozzetto preriscaldato e preparata al momento soluzione di PFA (paraformaldeide) 4% diluito nel buffer del citoscheletro.
   Attenzione: Utilizzare guanti e lavorare sotto cappa chimica.
6. Rimettere la piastra 12-pozzetti nell'incubatore a 37° C per 10 min.
7. Rimuovere il PFA e aggiungere 3 mL di PBS per pozzetto.
   Nota: Lavorare sotto cappa chimica con i guanti e mettere il PFA riciclato in una collocazione specifica.
8. Lavare due volte con PBS.
9. Rimuovere il PBS ed aggiungere la soluzione appena preparata 10mm NaBH₄ diluita in PBS per placare l'autofluorescenza provenienti da glutaraldeide.
10. Incubare per 7 min a temperatura ambiente.
11. Mettere il riciclato NaBH₄ in una collocazione specifica.
12. Lavare tre volte 5 min con PBS.
13. Rimuovere il PBS e aggiungere la soluzione bloccante (soluzione 5% BSA in PBS).
14. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 ° C).
    Nota: Il tampone di citoscheletro può essere conservato a temperatura ambiente per un paio di mesi. PFA, NaBH₄ e glutaraldeide devono essere maneggiati con cura speciale (cappuccio, guanti e bidoni di riciclaggio specifici). Soluzioni dovrebbero essere aggiunti e rimossi delicatamente al fine di preservare l'integrità delle cellule. È importante non lasciare che le celle a secco.

4. Immunostaining (giorno 2, 5h)

1. Preparare la soluzione di anticorpi primari utilizzando anti-vimentin e anti-tubulina con una diluizione di 1: 500 nella soluzione di blocco.
2. Mettere 100 µ l gocce di anticorpi primari diluiti su uno strato di pellicola di paraffina e posizionare i vetrini coprioggetti sopra di loro con le cellule rivolto verso il basso.
3. Incubare le cellule con anticorpi primari per 2 h. Put i coprioggetti indietro in una piastra 12-pozzetti riempiti con PBS. Sciacquare tre volte per 5 min ogni volta in PBS a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
4. Nel frattempo, preparare la soluzione di anticorpi secondari utilizzando anti-topo Alexa647 e anti-ratto Alexa555 ad una diluizione di un 1:1, 000 nella soluzione di blocco. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 1 h a temperatura ambiente. Procedere come 4.2. proteggendo le cellule dalla luce.
5. Mettere il vetrino coprioggetto indietro in un piatto di 12-pozzetti pieno di PBS. Sciacquare tre volte per 5 min ogni volta in PBS a temperatura ambiente su agitatore orbitale. Rimuovere il PBS e aggiungere 0,5 mL di PBS mescolato con 1 µ l di 0,1 µm tetraspeck perline.
6. Mettere i pozzetti su agitatore orbitale per 30 min. Risciacquare con PBS. Rimuovere il PBS e incubare le cellule per 5 minuti con una soluzione PFA 4% in PBS. Sciacquare tre volte con PBS.
   Nota: Celle fisse possono essere conservate per un paio di settimane in PBS a 4° C. Immunostaining dovrebbe essere fatto all'ultimo minuto.

5. preparazione del campione (giorno 3, 5 min)

1. Mettere le aliquote di MEA (cisteamina, 1 M, pH 8.3), glucosio ossidasi (100 x, 50 mg/mL), catalasi (500 x, 20 mg/mL) in un cestello di ghiaccio.
2. Preparare 50 mL di tampone Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 millimetri di NaCl, pH = 8) completati con 10% di glucosio (100 mg/mL).
3. Preparare 1,2 mL di tampone appena prima dell'imaging con 10mm MEA, ossidasi di glucosio di 0,5 mg/mL (75 U/mL), catalasi di 40 µ g/mL (80-200 U/mL) di imaging nel buffer di Tris-NaCl con 10% di glucosio.
4. Montare il vetrino coprioggetto contenente le celle con etichettate su supporto magnetico (ad es. sezione chamlide) e aggiungere il buffer di imaging per riempire completamente la camera. Mettere il coperchio e assicurarsi che non ci sia nessuna bolla di aria tra il buffer di imaging e il coperchio.
5. Pulire il fondo del campione con etanolo assoluto e verificare che non vi sia perdita. Usare grasso per sigillare il portacampioni correttamente se necessario.
   Nota: Preparare 1 M stock di soluzione MEA (pH 8.3 regolata usando HCl), stock di ossidasi di glucosio 50 mg/ml e stock di catalasi a 20 mg/mL in acqua, fare aliquote e conservare a-20 ° C per fino a un mese per MEA e un anno per glucosio ossidasi e catalasi. Non ricongelare le aliquote. Preparare il tampone di Tris-NaCl in anticipo e conservare a temperatura ambiente per diversi mesi. Aggiungere glucosio il giorno dell'esperimento (punto 5.3).

6. acquisizione immagini (giorno 3, ~ 1h per cella)

1. Accendere il microscopio. Accendere il software di acquisizione e premere Avvia il sistema.
2. Selezionare acquisizione scheda Espandi lo strumento di Imaging installazione nel gruppo di strumenti di gestione guidata installazione. Selezionare la modalità laser WF (campo largo) di acquisizione. Selezionare l'obiettivo 100 X NA 1,46 . Selezionare la modalità TIRF u-HP che utilizza un collimatore per ridurre il campo di vista essere illuminato e concentrare l'energia del laser in un'area più piccola. Utilizzare il optovar lente 1,6 x che dà una dimensione di pixel di 100nm.
3. Selezionare lo strumento di serie temporali e impostare il lasso di tempo con 50 000 cornici e 0.0 ms tra i fotogrammi. Espandere lo strumento canali nel gruppo di strumenti di acquisizione parametro e selezionare "Mostra tutti".
4. Impostare la traccia Alexa647: verifica la 642 e 405 linee per l'eccitazione del laser e accettare per accenderli. Selezionare il filtro di emissione "655 LP" nel Setup di Imaging. Rinominare "647".
5. Fare clic su '+' nello strumento canali per aggiungere un altro passaggio di luce e selezionare la modalità "interruttore traccia ogni: telaio" nello strumento Setup Imaging . Verifica 561, 488 e linee laser 405 e accettare per accenderli. Selezionare il "BP 570-650 + LP750" emissione filtrare e utilizzare optovar lente 1.6 x. Verifica che sia selezionata la modalità TIRF-uHP. Rinominare la traccia "555".
6. Selezionare lo strumento in modalità di acquisizione e impostare le dimensioni della cornice a 200 x 200 pixel. Selezionare lo strumento di strategia e dispositivi di messa a fuoco e impostare lo stato attivo definito 1 000 fotogrammi (se c'è un sistema di blocco di messa a fuoco).
7. Mettere olio sull'obiettivo e mettere il campione. Selezionare la scheda di Locate e aprire l'otturatore della lampada fluorescenza. Trovare la messa a fuoco e guardare per la cella all'immagine utilizzando l'oculare. Metterla al centro del campo di vista utilizzando il joystick.
8. Selezionare la scheda di acquisizione per tornare alla modalità acquisizione. Selezionare la traccia "647", impostare la potenza del 642-laser allo 0,2%, la potenza di 405-laser impostato su 0, impostare il tempo di esposizione di 50 ms e il guadagno di 50. Scegliere la modalità di acquisizione continua ad osservare la cella sullo schermo. Regolare il fuoco. Assicurarsi che vi sia almeno un tetraspeck tallone nel campo visivo, aumentare il contrasto per vederli se necessario. Utilizzare una modalità di ridimensionamento automatico per la visualizzazione. Prendere un'immagine di grande campo epifluorescenza della rete il vimentin cliccando su snap e salvarlo. Per controllare l'illuminazione TIRF, fare clic su TIRF, regolare l'angolo di illuminazione e/o collimatore se necessario avere un campo omogeneo di illuminazione e salvarlo.
   Nota: È importante che le immagini TIRF ed epifluorescente sono di alta qualità prima di iniziare l'acquisizione di dati grezzi. Discontinui, non uniformemente con etichettati filamenti darà luogo a immagini di scarsa qualità dSTORM.
9. Deselezionare la traccia "647", selezionare e controllare la traccia "555". Acquisire un'immagine di epifluorescenza della rete dei microtubuli e salvarlo. Prendere un'immagine TIRF e salvarlo troppo.
10. Deselezionare la traccia "555", selezionare e controllare la traccia "647", quindi premere continua. Mettere il gain a 0 e tempo di esposizione di 10 ms. impostata la potenza del laser 642 nm al 100% per pompare la maggior parte delle tinture Alexa647 allo stato scuro (~ 2 kW/cm²). Una volta i fluorophores cominciano a lampeggiare, mettere l'esposizione a 15 ms e guadagnare a 300. Selezionare la modalità TIRF di illuminazione. Utilizzare la modalità di indicazione del campo senza scala automatica per verificare che i segnali di singola molecola non saturano la fotocamera (indicata dal colore rosso). In tal caso, diminuire il guadagno fino a quando scomparirà la saturazione. Tetraspeck perline rimane saturati all'inizio dell'acquisizione. Premere Stop per arrestare il continuo controllo della cella.
11. Espandere lo strumento Online di elaborazione e verifica Online PALM di elaborazione per visualizzare l'immagine di tempesta durante l'acquisizione. Utilizzare i seguenti parametri: 9 per la dimensione di maschera di picco (diametro 9 pixel) e 6 per l'intensità di picco al rumore. I parametri tesi definirà le molecole che sono presi in considerazione nell'elaborazione (abbastanza luminoso e non sovrapposte). Nello strumento di Statistiche di PAL , selezionare il tipo di trama: istogrammae istogramma fonte: precisione. Premere Avvia acquisizione.
12. Durante l'acquisizione, rimettere a fuoco se necessario (se non c'è nessun dispositivo di blocco messa a fuoco). Regolare i parametri (esposizione, laser poteri) e alla fine passare sulla linea laser 405 nm (a partire da 0,001%) mantenere una densità media di fluorofori con una distanza minima di 1 µm tra singole molecole (> 9 pixel di 100 nm, la dimensione di maschera di picco) ( Figura 1A-B). Se la densità di molecola è un po ' troppo alta, è possibile utilizzare la modalità di HILO (foglio altamente inclinata e laminato ottico) di illuminazione anziché TIRF. Ciò aumenterà la potenza del laser del 20%. Assicurarsi che il picco di precisione di localizzazione sull'istogramma sotto l'immagine ricostruita è centrato intorno o inferiore a 10 nm.
    Nota: Solitamente il numero di molecole diminuisce con il tempo, e la potenza del laser 405 nm è aumentata lentamente di conseguenza. L'obiettivo è quello di diminuire la precisione di localizzazione (istogramma visualizzato sotto l'immagine di Super-risoluzione) quanto più possibile con un picco inferiore a 10 nm (Figura 1). Aumentare il contrasto dell'immagine PALM se necessario, se troppi perle luminose sono presenti nel campo.
13. Premere Stop per interrompere il filmato quando più di 10⁶ localizzazioni sono stati raggiunti (in genere dopo 40 000 fotogrammi). Mettere i laser torna allo 0,2% (642 nm) e 0 (405 nm). Salvare i dati grezzi dell'acquisizione tempesta con il formato .czi. Deselezionare traccia "647" nello strumento di canali, selezionare e controllare la traccia "555".
14. Impostare il tempo di esposizione a 25 ms e guadagno su 0. Premere il pulsante continua e impostato il laser sia 488 e 561 al 100% per pompa Alexa555 coloranti allo stato scuro (~ 2 kW/cm² ). Quando i fluorophores cominciano a lampeggiare, mettere il guadagno a 250, utilizzare la modalità di illuminazione di HILO e verifica che singole molecole non saturano la fotocamera con la modalità di indicatore di intervallo. Se questo è il caso, diminuire il guadagno. Premere Stop. Diminuire la potenza di 488-laser al 50%.
15. Premere Avvia acquisizione. Durante l'acquisizione, aumentare progressivamente il guadagno per essere sempre al limite della saturazione. Passo dopo passo aumentare la potenza laser 405 nm per mantenere una densità media di singola molecola nel campo visivo (vedere passo 6,18). Diminuire la potenza del 488 laser 20-30% quando il laser 405 è superiore al 15%. Quindi diminuire gradualmente la 488 aumentando la linea 405 laser al fine di mantenere il lampeggio delle molecole più velocemente possibile. La linea di 488 laser accoppiata con il laser di 561 eccitazione a massima intensità aumenta sia l'on e off tariffe di fluorofori, considerando che la linea 405 laser solo aumenta il tasso in.
16. Interrompere l'acquisizione quando sono stati raggiunti più di 500 000 localizzazioni (dopo circa 20 000 fotogrammi) o più, quando non più molecole lampeggiano. Salvare i dati grezzi dell'acquisizione tempesta con il formato .czi.
    Nota: Iniziare sempre con la lunghezza d'onda superiore per evitare lo sbiancamento (o attivazione) degli altri colori. Poiché la camera di chamlide non è chiusa, è possibile modificare il buffer di imaging regolarmente, ad esempio per verificare le condizioni di buffer diversi. Utilizzando la linea 488 laser per vuotare le tinture di Alexa 555 è necessaria solo quando la potenza del 561 laser è limitata (con laser a 100 mW).

7. image reconstruction (5 min)

1. Nello strumento di PAL-Drift , utilizzare il tipo di correzione basato su modello con segmenti automatici con una dimensione massima di 8. Premere applica più volte in una fila finché la deriva non è corretto. Questa correzione basati sul modello si applica un algoritmo basato sull'analisi di correlazione incrociata che corregge la deriva.
2. Utilizzando gli strumenti di PAL-filtro , migliorare l'aspetto dell'immagine tempesta selezionando solo le molecole che meglio sono state localizzate. Ad esempio, limitare la precisione di localizzazione a 30 nm e il PSF a 120-180 nm.
3. Utilizzare una risoluzione di pixel di 5 o 10 nm nello strumento PAL-rendering , come pure una modalità di visualizzazione gaussiana, con un fattore di espansione di 1 FPF selezionare il rendering dinamico gamma auto HR con un valore di 95% e gamma dinamica auto da Render SWF con un valore di 90%. Selezionare le migliori qualità di rendering.
4. Selezionare PALM convertire, nel menu PALM della scheda elaborazione (modalità di post-elaborazione). Premere Seleziona e poi applicare. Salvare l'immagine creata con un formato. LSM (e non .czi, molto importante).
   Nota: La ricostruzione delle immagini può essere eseguita immediatamente dopo l'acquisizione o la successiva utilizzando la modalità di elaborazione dell'immagine del software di acquisizione. In fuori linea modalità di post-elaborazione, è possibile rianalizzare le pile con diversi valori dei parametri (dimensioni di picco della maschera, intensità di picco di rumore). Sempre scegliere di "scartare molecole sovrapposti" e non "media prima localizzazione".

8. stima della precisione di localizzazione di un'immagine di tempesta (10 min)

1. Aprire i dati grezzi di tempesta e utilizzare elaborando sulla scheda e selezionare il metodo PALM e quindi PALM nuovamente l'immagine. Premere il tasto Select.
2. Premere applica per avviare la ricostruzione utilizzando una dimensione di maschera di picco di 9 e un'intensità di picco al rumore di 6 (o i parametri che si sceglie per l'immagine).
3. Selezionare lo strumento di grafica di rettangolo e disegnare un rettangolo sull'immagine raw intorno a una singola molecola presente sulla superficie del vetro. Ci sono solitamente alcune singole molecole ci.
4. Premere applica nuovamente e solo le molecole presenti all'interno dell'area del rettangolo saranno analizzati.
5. Nello strumento di Statistiche di PAL , selezionare il tipo di trama: istogramma e istogramma fonte: X posizione o posizione Y, per visualizzare gli istogrammi di posizione.
6. Salvare la tabella con l'elenco delle localizzazioni a sinistra sotto le immagini.
7. Utilizzando un software di analisi dei dati, creare istogrammi di X e Y posizioni (Figura 1).
8. Montare le distribuzioni di una gaussiana e salvare il σ_X e σ_Y valori. Secondo le stime il σ di precisione di localizzazione_SMLM (σ_{X *}σ_Y) ^ 0,5.
9. Ripetere il passaggio 8.3-8.8 su molecole come molti come possibile e media σ_SMLM

9. canale registrazione (5 min)

1. Aprire l'immagine di tempesta di ogni colore utilizzando il software di Fiji (figura J).
2. Selezionare lo strumento bacchetta per misurare le posizioni di ogni perle tetraspeck.
3. Calcolare gli spostamenti X e Y per ogni perlina e media li.
4. Utilizzare il comando "Translate" per tradurre la seconda immagine con la calcolata spostamenti X e Y.
5. Sovrapporre le immagini utilizzando il comando Merge canali.

Risultati

Un microscopio dotato di 50 mW 405 nm e laser a stato solido da 100 mW 488, 561 e 642 nm, un EMCCD 512x512 fotocamera, un alpha Plan Apo 100 X / 1,46 obiettivo e Band Pass 570-650 / 655 emissione filtri passa-lungo è stato usato per i risultati rappresentativi presentati di seguito.

Figura 1A fornisce un esempio di molecola densità e segnale / rumore che deve essere utilizzato durante l'acquisizio...

Discussione

Fasi critiche nel protocollo

Presentiamo qui un protocollo che riduce al minimo gli artefatti nelle immagini dSTORM dei microtubuli e IFs nelle cellule gliali. Gli artefatti possono essere creati in ogni fase della preparazione del campione e la formazione immagine: fissazione, blocco, immunolabeling, deriva durante l'acquisizione, non ottimale lampeggiante condizioni²³. Elenchiamo qui di seguito le fasi più critiche.

Pulizi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2