جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة

Summary

انيوبلويدي يؤدي إلى عدم الاستقرار الجينوم، التي تنتج في النهاية القبض على دورة الخلية خلايا مع كاريوتيبيس المعقدة. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة وملائمة لعزل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تتوقف على تقسيم.

Abstract

كروموسوم سوء العزل يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط فيها خلايا إيواء عدد الكروموسومات غير متوازن. خطوط العديد من الأدلة تشير بقوة إلى أن انيوبلويدي مشغلات الجينوم عدم الاستقرار، وتوليد الخلايا مع كاريوتيبيس المعقدة التي وقف انتشار هذه الأسلحة في نهاية المطاف. عزل وتوصيف الخلايا التي تأوي كاريوتيبيس معقدة ذات أهمية حاسمة لدراسة أثر عدد الكروموسومات غير متوازن في فيزيولوجيا الخلية. وحتى الآن، تم إنشاء أية أساليب موثوق بها عزل هذه الخلايا أنيوبلويد. تقدم هذه الورقة وضع بروتوكول لتخصيب اليورانيوم وتحليل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة القياسية، وغير مكلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل العديد من الميزات من الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة، بما في ذلك النمط الظاهري المستحث الافرازية المرتبطة بالشيخوخة، وممتلكاتهم برو التحريضية، والقدرة على التفاعل مع الخلايا المناعية. لأن الخلايا السرطانية غالباً ما تأوي الاختلالات في عدد الكروموسوم، من الأهمية بمكان فك كيفية تأثير انيوبلويدي فسيولوجيا الخلية في الخلايا الطبيعية، مع الهدف النهائي المتمثل في الكشف عن كلا توموريجينيك برو ومكافحة إثارة.

Introduction

أخطاء عملية العزل الصبغي يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط تتميز بعدد الكروموسومات التي ليست متعددة لتكملة فرداني^1،2،،من³⁴. أنيوبلويد كاريوتيبيس مشغل النسخ المتماثل للتأكيد على أن يولد مزيدا من عدم الاستقرار المجيني^5،6،،من^78،،من⁹¹⁰، يزيد تناذر التعقيد، وفي نهاية المطاف يؤدي إلى دورة الخلية اعتقال يتدنى من الخلايا¹⁰. وغرض الطريقة المعروضة هنا هو توليد وفصل هذه يتدنى من ركوب الدراجات الخلايا. عن طريق استخدام تقنيات زراعة الأنسجة غير مكلفة، يسهل هذا البروتوكول إلى العزلة وتوصيف للقبض على دورة الخلية خلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة. هذه الخلايا هي المشار إليها كخلايا أركك (توقيف مع تناذر معقدة) ونظرائهم ركوب يوبلويد كعناصر تحكم.

هذا البروتوكول هو الأول الذي سينشأ لهذا الغرض ويسمح بالعزل ودراسة المزيد من خطوط أركك بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على، فعل الشيخوخة والمرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري (ساسب)، على برو-التهابات ميزات، وقدرتها على التعامل مع الخلايا المناعية. الطريقة المعروضة هنا قد وضعت في الخلايا البشرية تناظري، مخلدة ولكن لم يتم اختباره في خطوط السرطان بعد. قد تكون بعض الخلايا المحولة غير مبال بدوره الخلية اعتقال بسبب قمع مسارات واحدة أو متعددة؛ ولذلك، ينبغي إجراء التحقق من الصحة كذلك في خطوط الخلايا الأخرى.

Protocol

حالة الثقافة

كان مثقف هتيرت RPE-1 خط الخلية في تعديل النسر المتوسطة دولبيكو (جدول المواد) وتستكمل مع 10% "مصل بقرى الجنين" ومم 2 لتر-الجلوتامين 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين. كانت الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ في بيئة هوميديفيد. وضعت البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام أطباق 10 سم وجميع التفاصيل التقنية التي ذكرت تشير إلى تلك الأطباق. في حالة استخدام أطباق مختلفة، مقياس صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك.

1-التزامن بين الخلايا RPE-1

1. تستخدم الخلايا المذابة الطازجة التي لم تخضع لأكثر من 15 مقاطع لجميع التجارب. في يوم 1، ذوبان الجليد والاستغناء عن ~2.5-5.0 × 10⁵ RPE 1 هتيرت الخلايا إلى طبق استنبات الأنسجة 10 سم. إضافة 8 مل متوسط النمو القياسية واحتضان بين عشية وضحاها. تحديد عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا قياسية (مثل هيموسيتوميتير).
   ملاحظة: كثافة الخلية يشير إلى ظروف نمو الخلايا RPE-1. قد تختلف شروط النمو بين خطوط الخلايا المختلفة؛ النظر في تعديلها تبعاً لذلك.
2. في اليوم 2، مزامنة الخلايا عند الحدود G1/S يسفط المتوسطة النمو المنتظم وإضافة متوسطة 8 مل تحتوي على thymidine 5 ملم.
   ملاحظة: قد تختلف تركيز التريتيوم وطول مدة العلاج عبر خطوط الخلايا المختلفة. فمن المستحسن لإجراء تجارب رائدة لتحديد أفضل الظروف للخلية خط (خطوط) لفحصها.
3. في يوم 3، 24 ساعة بعد إضافة thymidine المتوسطة (الخطوة 1، 2)، الإفراج عن كتلة thymidine يسفط المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 8 مل متوسط النمو المنتظم وإرجاع لوحات للحاضنة.

2-جيل أنيوبلويد الخلايا التي تدخل في نشاط Mps1 كيناز الانقسامية

1. في يوم 3، 6 ح بعد الإفراج عنهم من كتلة thymidine (الخطوة 1، 3؛ هذا حوالي 3-6 ح قبل دخول الخلايا الانقسام)، نضح متوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x واستبدال مع المتوسطة التي تحتوي على 500 نانومتر ريفيرسيني (مثبط Mps1).
   ملاحظة: الخلايا RPE-1 أدخل الانقسام ح 9-12 بعد thymidine^،بالغسيل¹⁰¹¹. ومع ذلك، تختلف حركية دورة الخلية بين خطوط الخلايا المختلفة. ولذلك، من الأهمية بمكان لتحديد تلك الحركية في تجارب رائدة بإجراء تحليل دورة الخلية بأساليب محددة (مثلاً، عن طريق قياس المحتوى عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل الحمض النووي). بالإضافة إلى ذلك، قد تختلف تركيز مثبط Mps1 العامل الأمثل بين خطوط الخلايا. قد نجحت تجارب سابقة باستخدام خلايا RPE1 باستخدام ريفيرسيني بتركيز عامل 500 نانومتر^10،،من¹¹¹². فمن المستحسن لإجراء تجارب رائدة لتحديد تركيز الأمثل لخط الخلية لفحصها.
2. في يوم 4، ح 12 بعد العلاج ريفيرسيني (حوالي 6 ح بعد أن كانت الخلايا في الانقسام)، نضح المتوسطة ريفيرسيني وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 8 مل المتوسطة النمو العادية إلى اللوحة وإرجاع الخلايا للحاضنة.

3-إزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد والإثراء للسكان أركك

1. في يوم 6، حوالي 72 ساعة بعد إدخال الخلايا في الانقسام الأول (الخطوة 2، 2؛ هذا هو حوالي 66 ح وبعد ريفيرسيني المياه والصرف الصحي، الذي يتوافق مع حوالي الخلية 2-3 دورات) ونضح متوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x واستبدال مع المتوسطة التي تحتوي على 300 نانومتر نوكودازولي.
   ملاحظة: العمل الأخيرة قد أظهرت أن الخلايا RPE-1 إيواء كاريوتيبيس أنيوبلويد جينوميكالي غير مستقرة ووقف انتشارها حول دورة الخلية 2-3 بعد الانقسام الخاطئ الأول¹⁰. ومع ذلك، قد تختلف هذه الحركية بين خطوط الخلايا المختلفة. ولذلك، من الأهمية بمكان القيام بتجارب رائدة لتحديد التوقيت المناسب لإزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد.
2. في يوم 7، ح 12 وبعد العلاج نوكودازولي، نضح المتوسطة وأضف 3 مل من 1 x برنامج تلفزيوني اللوحة. التخلص من الخلايا الانقسامية بالتنصت على الجانب من اللوحة. قم بتدوير اللوحة بين كل برنامج المشورة التقنية السماح بإزالة حتى الخلايا الانقسامية.
3. لضمان الإزالة الكاملة للخلايا الانقسامية، كرر عملية اهتزاز قبالة لجولات متعددة (مستحسن) من 3-5 مرات، يسفط وإضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني س 1 بين كل جولة.
4. بعد إيقاف اهتزاز، نضح بلطف أي سائل أن تلتزم بالغطاء أو حافة اللوحة. باختصار، تحقق من لوحة تحت مجهر بتكبير X 10. ضمان الالتزام بعدد قليل من الخلايا الانقسامية. إذا كان أكثر من خمس خلايا الانقسامية تعتبر تحت 10 X الهدف، كرر جولة أخرى من اهتزاز قبالة.
   ملاحظة: سوف تظهر مستدير الزوايا الخلايا الانقسامية وقد تكون منفصلة جزئيا بعد هزة قبالة. من الأهمية بمكان لضمان الإزالة الكاملة للخلايا الانقسامية قبل تعريض الخلايا للجولة التالية من العلاج نوكودازولي. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى موت الخلية الانقسامية و/أو يؤدي إلى توليد خلايا تيترابلويد.
5. بعد اهتزاز النهائي، يغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. إضافة متوسطة 8 مل يحتوي على 330 نانومتر نوكودازولي في اللوحة واحتضانها ح 12.
6. كرر نوكودازولي المعاملة/هزة-إيقاف (الخطوات 3.1 3.5) كل ح 12 حتى يتم ملاحظة لا الخلايا الانقسامية بعد الحضانة. وينصح عادة، 4-5 جولات من العلاج/هزة-إيقاف.
   ملاحظة: المعلومات المقدمة هنا الإشارة إلى خلايا RPE-1. قد يختلف عدد جولات من العلاج/هزة-إيقاف بين خطوط الخلايا المختلفة. لتجنب التعرض المطول وغير الضرورية إلى نوكودازولي من الأهمية بمكان لتحديد بدقة، في تجربة رائدة، عدد جولات المطلوبة لإزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد فعالة وكاملة.
7. بعد 4-5 جولات من نوكودازولي العلاج/هزة-إيقاف (الخطوات 3.1-3.6)، أضف 10 مل متوسط النمو المنتظم واحتضان. السماح للخلايا للراحة ح 12-24 قبل استخدام التلاعب أو الفحص في المستقبل.
   ملاحظة: بعد اهتزاز النهائي، الخلايا المتبقية على اللوحة دورة الخلية اعتقال، وكما أظهرت مؤخرا¹⁰، ميناء كاريوتيبيس المعقدة. هذه الخلايا يشار إلى خلايا أركك (توقيف مع تناذر المعقدة). فمن المستحسن لإجراء فحوصات على السكان أركك خلال أسبوع عزلة.
8. اختيارياً، لتقييم النسبة المئوية للخلايا المقبوض عليه مع كاريوتيبيس المعقدة، جمع وحساب عدد الخلايا من كل هزة-إيقاف استخدام عداد خلايا قياسية.

رقم 1: التخطيطي العام للطريقة المستخدمة لتوليد وعزل الخلايا أنيوبلويد مع تناذر معقدة (أركك) وصور الممثل. (أ) الخلايا "أركك التخطيطي ل" بروتوكول الجيل والعزلة. (ب) صور الممثل RPE-1 هتيرت الخلايا في كل مرحلة من العلاج. ويمثل الفريق الأخير (المشار إليها باللون الأحمر) أركك الخلايا المعزولة. مقياس بار 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-وصف للسكان أركك

1. تأكيد نجاح عزل السكان أركك بإجراء الاختبارات التالية.
   1. تقويم بيتا-جالاكتوسيداسي تلطيخ (العلامة للشيخوخة) استخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد).
   2. قياس إفراز السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل CCL2، باستخدام أدوات متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
   3. وتؤكد زيادة مستويات دورة الخلية مثبطات p53، p21، p16 "الغربية لطخة".
      ملاحظة: للتحكم في هذه الاختبارات بشكل صحيح، يجب مقارنة السكان أركك إلى خلايا ركوب يوبلويد وأنيوبلويد على حد سواء. السابقة ومرور منخفضة، هتيرت RPE-1 البرية من نوع الخلايا المتزايدة أضعافاً مضاعفة. هذا الأخير يمكن الحصول على حمل كروموسوم سوء العزل في هتيرت RPE-1 وحصد الخلايا ح 72 بعد الانقسام الشاذة الأولى. للقيام بذلك، اتبع البروتوكول المذكورة أعلاه من الخطوة 1، 1 وحصاد الخلايا حق قبل المعالجة نوكودازولي الأولى (الخطوة 3.1).
2. إجراء تسلسل خلية واحدة لتقييم تناذر الزنزانات المقبوض عليهم.
   ملاحظة: يسلسل خلية واحدة بطريقة راسخة لتحديد التغيرات الصبغية وشبه الصبغية عبر جمهرة خلايا في خلية مفردة مستوى¹³. يمكن الاطلاع على إجراءات تفصيلية لكيفية إجراء تسلسل خلية واحدة في أماكن أخرى¹⁰.

النتائج

هذا الأسلوب يستخدم نظام زراعة الأنسجة في المختبر لعزل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي وقف انتشارها. هذه الفئة من السكان يشار إلى خلايا أركك (توقيف مع كاريوتيبيس المعقدة). ويبين الشكل 1A مخطط التجربة. يتم مزامنتها عند الحدود G1/S مع thymidine RPE-1 الدراجات البرية من نوع هتيرت الخلايا وتعامل مع مثبط Mps1 للحث على كروموسوم سوء العزل. نوكودازولي السم المغزل يضاف إلى الخلايا ح 72 بعد تحريض كروموسوم سوء العزل. أدخل الانقسام ح 12 بعد العلاج نوكودازولي، أنيوبلويد الخلايا التي لا تزال قادرة على الانتشار ومحاصرون في هذه المرحلة دورة الخلية نتيجة للتدخل مع البلمرة microtubule. هذه المحاصرين ثم تتم إزالة الخلايا بسهولة بواسطة يهز قبالة لطيف. هو عملية اهتزاز قبالة المتكررة من 3-5 مرات ضمان الإزالة الكاملة لركوب الدراجات الخلايا. ويبين الشكل 1B الصور التمثيلية للخلايا RPE-1 في كل مرحلة من العلاج.

تعرض الخلايا أركك زيادة مستويات مثبطات دورة الخلية، مثل p53، p21، و p16 مقارنة يوبلويد وأنيوبلويد ركوب الدراجات الخلايا، كما هو موضح في الشكل 2 ألف. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الشكل 2B β-جالاكتوسيداسي إيجابية تلطيخ في خلايا أركك بالمقارنة مع الخلايا التحكم يوبلويد، علامة راسخة للشيخوخة الخلوية.

رقم 2: الممثل نتائج استخدام الخلايا أركك- ((أ)) وصمة عار الغربية تقييم مستويات المانع دورة الخلية في يوبلويد، أنيوبلويد ركوب الدراجات، والخلايا أركك. حددت مستويات p53، p21، و p16 بتحليل لطخة غربية. أكتين كعنصر تحكم تحميل. (ب) β-جالاكتوسيداسي تلطيخ تقييم مستوى الشيخوخة في الخلايا أركك. تم تحديد النشاط المرتبط بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (β-غال) في يوبلويد الخلايا والخلايا أركك. مقياس بار 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

هذا الاعتقال دورة الخلية سمة بارزة للخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة، كما يتضح من تحليل تناذر الممثل من خلية واحدة تسلسلها في الشكل 3، التي تعرض الخلايا أركك متعددة وعشوائية كروموسوم المكاسب والخسائر. وهذا الاستنتاج في اتفاق تام مع التقارير السابقة¹⁰.

الشكل 3: الممثل تسلسل خلية واحدة من الخلايا أركك- تقسيم قطع الأراضي تبين تناذر من ست خلايا أركك الممثل. إظهار تجزئة قطع عدد نسخ الكروموسومات جميع من 1 إلى س بالنسبة إلى مرجع يوبلويد في نطاق₂ سجل (نوع البرية RPE-1 خط خلية مثنوية المنشأ الإناث). ويبرز الخسائر كروموسوم الأحمر والأخضر في المكاسب كروموسوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

يسمح هذا الأسلوب رواية لتوليد وإثراء للخلايا المقبوض عليهم مع مجمع كاريوتيبيس (أركك) لدراسة الخلايا التي لديها كروموسوم المكاسب أو الخسائر متعددة، والكف عن تقسيم. قد تم تصميم إعداد أسلوب لتسهيل عزل خلايا أركك بطريقة سريعة وموثوق بها.

أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا التحليل هو السيطرة صرامة الجدول الزمني للعلاج من تعاطي المخدرات، والأهم من ذلك، إزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد. لتحقيق أفضل النتائج، توقيت العلاج نوكودازولي ويهز قبالة أهمية خاصة لضمان إزالة الخلايا الدراجات من اللوحة في حين أنها لا تزال مقربة والانقسامية، منع احتمال موت الخلية الانقسامية أو انزلاق إلى G1، يحتمل أن تكون تهيئة عدد سكان تيترابلويد. من غير المستحسن أن توقيت هزة قبالة ينحرف أكثر من ساعتين من حضانة الموصى به 12-ح نوكودازولي.

الدراسات المستقبلية في أركك الخلايا لديها القدرة على تيسير فهم أعمق لكيفية كاريوتيبيس معقدة تؤثر على فيزيولوجيا الخلية. على وجه الخصوص، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا أن خلايا الجهاز المناعي قادراً على التفاعل مع وإزالة المشغل محصنة من أركك الخلايا¹⁰. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر نقطة انطلاق ممتازة لتوصيف المزيد من الخلايا أركك، بما في ذلك توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إزالة المناعي في الخلايا تناظري ودراسة كيفية النمطان التحول وقد تجاوز هذا إليه المراقبة، مسألة جوهرية في الحقل^14،15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B