Generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi

Riepilogo

Aneuploide conduce all'instabilità del genoma, che alla fine produce le cellule ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Questo documento fornisce un metodo semplice e conveniente per isolare cellule aneuploidi con karyotypes complessi che non smettono di dividersi.

Abstract

Mis-segregazione del cromosoma conduce ad aneuploide, una condizione in cui cellule del porto un numero cromosomico squilibrato. Parecchie linee di prova indicano fortemente che aneuploide innesca instabilità genomica, in ultima analisi, generare cellule con karyotypes complessi che arrestano la loro proliferazione. Isolamento e caratterizzazione di cellule che harboring i karyotypes complessi sono cruciali per studiare l'impatto di un numero di cromosoma squilibrato sulla fisiologia cellulare. Ad oggi, non sono stati stabiliti metodi per isolare in modo affidabile tali cellule aneuploidi. Questo documento fornisce un protocollo per l'arricchimento e l'analisi di cellule aneuploidi con karyotypes complessi utilizzando tecniche di coltura del tessuto standard, poco costoso. Questo protocollo può essere usato per analizzare le diverse caratteristiche di cellule aneuploidi con karyotypes complessi inclusi indotta senescenza-collegata di fenotipo secretivo, proprietà pro-infiammatorie e capacità di interagire con le cellule immunitarie. Perché le cellule tumorali spesso porto gli squilibri nel numero dei cromosomi, è fondamentale decifrare come aneuploide impatti fisiologia cellulare in cellule normali, con l'obiettivo finale di scoprire entrambi suoi pro - e anti - tumorigenic effetti.

Introduzione

Errori nel processo di segregazione del cromosoma causare aneuploide, una condizione caratterizzata da un numero di cromosoma che non è un multiplo del aploide complemento^1,2,3,4. Aneuploid karyotypes stress di replica di trigger che genera ulteriore instabilità genomica^5,6,7,8,9,10, aumenta complessità del cariotipo e in ultima analisi porta ad arresto del ciclo cellulare di una sottopopolazione di cellule¹⁰. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di generare e separare tali una sottopopolazione dal riciclaggio delle cellule. Utilizzando tecniche di coltura del tessuto economico, questo protocollo facilita l'isolamento e la caratterizzazione di cellule aneuploidi ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Queste cellule sono denominate cellule ArCK (arrestato con Karyotype complesso) e le loro controparti in bicicletta euploide come controlli.

Questo protocollo è il primo ad essere istituito a tale scopo e permette l'isolamento e un ulteriore approfondimento delle linee di ArCK inclusi, ma non limitato a, loro indotta senescenza e il fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP), loro pro-infiammatorie caratteristiche e la loro capacità di impegnarsi con le cellule immunitarie. Il metodo presentato qui è stato sviluppato in cellule umane immortalizzate, non trasformate, ma non è ancora stato testato nelle linee del cancro. Alcune cellule trasformate possono essere insensibili all'arresto del ciclo cellulare a causa della soppressione di uno o più percorsi; di conseguenza, ulteriore convalida deve essere eseguita in altre linee cellulari.

Protocollo

Condizione di cultura

Linea cellulare RPE-1 hTERT è stato coltivato in per volta Eagle Medium di Dulbecco (Tabella materiali) completate con 10% siero bovino fetale, 2 mM L-Glutammina e 100 U/ml di penicillina/streptomicina. Le cellule sono state incubate a 37 ° C con 5% CO₂ in un ambiente umidificato. Il protocollo descritto di seguito è stato sviluppato utilizzando piatti 10 cm e tutti i dati tecnici riportati si riferiscono a quei piatti. Se utilizzando diversi piatti, scala verso l'alto o verso il basso di conseguenza.

1. sincronizzazione delle cellule RPE-1

1. Utilizzare appena scongelate cellule che non hanno subito più di 15 passaggi per tutti gli esperimenti. Il giorno 1, scongelare e dispensare ~2.5 - 5,0 x 10 celle di hTERT⁵ RPE-1 in un piatto di coltura del tessuto di 10 cm. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura standard e incubare per una notte. Determinare il numero di cellulare utilizzando un contatore di cella standard (ad esempio un emocitometro).
   Nota: Densità cellulare si riferiscono a condizioni di crescita delle cellule RPE-1. Condizioni di crescita potrebbero variare tra diverse linee cellulari; si consiglia di regolare loro conseguenza.
2. Il giorno 2, è necessario sincronizzare celle al bordo di G1/S ad aspirazione normale crescita medio e aggiungendo mezzo 8 mL contenente timidina 5 mM.
   Nota: Timidina concentrazione e durata del trattamento può variare in diverse linee cellulari. Si consiglia di eseguire esperimenti pilota per determinare le migliori condizioni per le righe di cella essere testato.
3. Il giorno 3, 24 h dopo l'aggiunta della timidina medio (punto 1.2), rilasciare dal blocco di timidina aspirando medio e lavando le cellule tre volte con PBS 1X. Aggiungere 8 mL di medium di crescita regolare e restituire le piastre nell'incubatore.

2. generazione di Aneuploid cellule tramite interferenza con l'attività della chinasi mitotica Mps1

1. Il giorno 3, 6 h dopo il rilascio dal blocco di timidina (passo 1.3; si tratta di circa 3-6 h prima celle immettere mitosi), aspirare medio, lavare una volta con PBS 1X e sostituire con mezzo contenente 500 nM reversine (l'inibitore Mps1).
   Nota: Le cellule RPE-1 immettere mitosi 9-12 h dopo timidina sbiaditura^10,11. Tuttavia, la cinetica del ciclo cellulare variano tra differenti linee cellulari. Pertanto, è cruciale per determinare quelli cinetica in esperimenti pilota eseguendo analisi del ciclo cellulare di metodi consolidati (ad es., misurando l'analisi del DNA contenuto via FACS). Inoltre, la concentrazione di lavoro ottimale di Mps1 inibitore può variare tra linee cellulari. Precedenti esperimenti usando le cellule RPE1 hanno avuto successo usando reversine ad una concentrazione di lavoro di 500 nM^10,11,12. Si consiglia di eseguire esperimenti pilota per determinare la concentrazione ottimale per la linea cellulare essere testato.
2. Il giorno 4, 12 h dopo il trattamento reversine (circa 6 h dopo erano cellule in mitosi), aspirare reversine medio e lavare le cellule tre volte con PBS 1X. Aggiungere 8 mL di terreno di crescita regolare alla piastra e restituire le cellule nell'incubatore.

3. rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta e di arricchimento della popolazione ArCK

1. Il giorno 6, circa 72 h dopo celle immettere la prima mitosi (passaggio 2.2; si tratta di circa 66 h dopo reversine wash-out, che corrisponde a circa 2-3 cicli cellulari), aspirare medio, lavare una volta con PBS 1X e sostituire con mezzo contenente 300 nM nocodazole.
   Nota: Lavoro recente ha dimostrato che cellule RPE-1 che harboring i karyotypes aneuploidi sono genomically instabile e arrestano la loro proliferazione circa 2-3 cicli cellulari dopo i primi¹⁰di mitosi difettoso. Tuttavia, questa cinetica potrebbe variare tra diverse linee cellulari. Di conseguenza, è fondamentale eseguire esperimenti pilota per determinare il corretto timing per la rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta.
2. Il giorno 7, 12 h dopo il trattamento nocodazole, aspirare medio e aggiungere 3 mL di 1X PBS alla piastra. Scrollarsi di dosso le cellule mitotiche toccando il lato della piastra. Ruotare la piastra tra ogni rubinetto per consentire anche la rimozione di cellule mitotiche.
3. Per garantire la completa rimozione di cellule mitotiche, ripetere il processo di shake-off per più turni (3 - 5 volte consigliati), aspirando e aggiungere 3 mL di 1X PBS tra ogni round.
4. Dopo shake-off, delicatamente aspirare tutto il liquido che ha aderito il coperchio o il bordo della piastra. Brevemente, controllare la piastra con un microscopio a ingrandimento 10x. Assicurare che siano osservate alcune cellule mitotiche. Se più di cinque cellule mitotiche sono visti sotto obiettivo 10x, ripetere un altro giro di shake-off.
   Nota: Cellule mitotiche sembrerebbero arrotondate e possono essere parzialmente disconnesso dopo shake-off. È fondamentale garantire la completa rimozione di cellule mitotiche prima esposizione delle cellule al turno successivo del trattamento nocodazole. Non farlo può portare alla morte cellulare mitotica e/o causare la generazione di cellule tetraploidi.
5. Dopo shake-off finale, lavare le cellule una volta con 5 mL di PBS 1X. Aggiungere 8 mL di terreno contenente 330 nM nocodazole nella piastra ed incubare per 12 h.
6. Ripetere nocodazole trattamento/shake-off (passaggi 3.1-3.5) ogni 12 h fino a nessun cellule mitotic sono state osservate dopo incubazione. Di solito, sono consigliati 4-5 cicli di trattamento/shake-off.
   Nota: Le informazioni qui fornite si riferiscono alle cellule RPE-1. Il numero di giri del trattamento/shake-off potrebbe variare tra diverse linee cellulari. Per evitare l'esposizione prolungata e inutile a nocodazole è cruciale per determinare accuratamente, in un esperimento pilota, il numero di giri richiesto per rimozione completa ed efficiente di cellule aneuploidi in bicicletta.
7. Dopo 4-5 giri di nocodazole trattamento/shake-off (passaggi 3.1-3.6), aggiungere 10 mL di medium di crescita regolare e incubare. Consentire alle cellule di riposare per 12-24 h prima dell'uso futuro di manipolazione o saggio.
   Nota: Dopo shake-off finale, cellule residue sulla piastra sono ciclo cellulare arrestato e, come recentemente dimostrato¹⁰, harbor karyotypes complessi. Queste cellule si riferiscono a come cellule di ArCK (arrestato con Karyotype complesso). Si consiglia di effettuare saggi sulle popolazioni di ArCK entro una settimana di isolamento.
8. Facoltativamente, per valutare la percentuale di cellule arrestate con karyotypes complessi, raccogliere e contare le celle da ogni shake-off utilizzando un contatore di cella standard.

Figura 1: nel complesso schematico del metodo utilizzato per generare e isolare cellule aneuploidi con karyotype complesso (ArCK) e immagini rappresentative. (A) schematico di ArCK cellule protocollo di isolamento e di generazione. (B) immagini rappresentative delle cellule di hTERT RPE-1 in ogni fase del trattamento. L'ultimo pannello (evidenziato in rosso) rappresenta le cellule isolate di ArCK. Scala bar 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. caratterizzazione della popolazione ArCK

1. Confermare successo isolamento della popolazione ArCK eseguendo i seguenti saggi.
   1. Asini della beta-galattosidasi che macchia (l'indicatore della senescenza) utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi tabella materiali).
   2. Misurare la secrezione di citochine pro-infiammatorie, quali CCL2, impiegando Kit commercialmente disponibili (Vedi tabella materiali).
   3. Confermare i livelli aumentati del ciclo cellulare inibitori p53, p21, p16 mediante Western Blot.
      Nota: Per controllare correttamente queste analisi, ArCK popolazioni devono essere confrontati con cellule ciclanti sia euploide e aneuploidi. Il primo è basso passaggio, hTERT RPE-1 selvaggio-tipo cellule in crescita esponenziale. Quest'ultimo può essere ottenuto inducendo mis-segregazione del cromosoma in RPE-1 hTERT e raccolta delle cellule 72 h dopo la prima mitosi aberrante. A tale scopo, seguire il protocollo descritto sopra dal passaggio 1.1 e raccolto le cellule destra prima del primo trattamento nocodazole (punto 3.1).
2. Eseguire il sequenziamento di singola cellula per valutare il karyotype delle cellule arrestati.
   Nota: Il sequenziamento di cella singola è un metodo ben consolidato per determinare cambiamenti cromosomici e sub-cromosomici fra una popolazione di cellule al livello unicellulare¹³. Procedure dettagliate per come eseguire la sequenziazione di singola cellula possono essere trovate altrove¹⁰.

Risultati

Questo metodo utilizza un sistema di coltura di tessuti in vitro per isolare cellule aneuploidi con karyotypes complessi che arrestano la loro proliferazione. Questa popolazione viene riferita come celle di ArCK (arrestato con Karyotypes complessi). Figura 1A Mostra lo schema dell'esperimento. Cellule di hTERT ciclismo RPE-1 wild-type sono sincronizzate al bordo di G1/S con timidina e trattate con un inibitore di Mps1 per indurre mis-segregazione del cromosoma. Il nocodazole veleno dell'alberino è aggiunto alle cellule 72h dopo induzione di mis-segregazione del cromosoma. 12 h dopo il trattamento nocodazole, le cellule aneuploidi che sono ancora in grado di proliferare immettere mitosi e sono intrappolati in questa fase del ciclo cellulare a causa dell'interferenza con la polimerizzazione dei microtubuli. Questi intrappolato le cellule vengono poi rimossi facilmente dal delicato shake-off. Il processo di shake-off è ripetuta 3 - 5 volte per garantire la completa rimozione del riciclaggio delle cellule. Figura 1B Mostra le immagini rappresentative delle cellule RPE-1 in ogni fase del trattamento.

ArCK celle visualizzare i livelli aumentati di inibitori del ciclo cellulare, quali p53, p21 e p16 rispetto al euploide e aneuploid riciclaggio delle cellule, come mostrato nella Figura 2A. Inoltre, la Figura 2B Mostra positiva β-galattosidasi macchiatura in cellule di ArCK rispetto alle cellule di controllo euploide, un indicatore ben consolidato per la senescenza cellulare.

Figura 2: risultati rappresentativi che utilizzano cellule di ArCK. (A) valutazione dei livelli dell'inibitore ciclo cellulare in euploide aneuploid ciclismo e cellule di ArCK macchia occidentale. I livelli di p53, p21 e p16 sono stati determinati mediante analisi western blot. Actina servito come un controllo di carico. (B) β-galattosidasi macchiatura valutazione del livello di senescenza in cellule di ArCK. Attività di β-galattosidasi senescenza-collegata (β-gallone) è stata determinata in euploide e cellule di ArCK. Scala bar 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo arresto del ciclo cellulare è una caratteristica prominente di cellule aneuploidi con karyotypes complessi, come indicato dall'analisi del cariotipo rappresentativo da unicellulare sequenziamento in Figura 3, in cui le cellule ArCK visualizzano multipli, random del cromosoma guadagni e perdite. Questa scoperta è in pieno accordo con precedenti rapporti¹⁰.

Figura 3: rappresentanza unicellulare sequenziamento delle cellule di ArCK. Segmentazione diagrammi che mostrano il karyotype del rappresentante ArCK sei celle. Segmentazione grafici mostrano il numero di copie di tutti i cromosomi da 1 a X rispetto a un riferimento euploide su una scala di₂ log (tipo selvaggio RPE-1 è una linea di cellula diploide di origine femminile). Cromosoma guadagni sono evidenziati in rosso, perdite di cromosoma in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo nuovo metodo per generare e arricchire di cellule arrestato con karyotypes complessi (ArCK) consente lo studio delle cellule che hanno più del cromosoma guadagni o perdite e smettono di dividersi. Il metodo setup è stato progettato per facilitare l'isolamento di cellule ArCK in modo rapido e affidabile.

La fase più critica in questo test è rigorosamente il controllo timeline di trattamento farmacologico e, soprattutto, la rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta. Per risultati ottimali, i tempi di trattamento nocodazole e shake-off sono di particolare importanza per garantire che le cellule ciclanti sono rimosse dalla piastra mentre sono ancora arrotondati e mitotica, impedendo la possibilità di morte cellulare mitotica o slittamento in G1, potenzialmente creando una popolazione tetraploide. Non è consigliabile che i tempi di shake-off devia più di due ore dall'incubazione consigliato 12-h nocodazole.

Gli studi futuri su ArCK cellule hanno il potenziale per facilitare una più profonda comprensione di come complesso karyotypes influisce sulla fisiologia cellulare. In particolare, uno studio recente ha dimostrato che le cellule del sistema immunitario sono in grado di interagire con e grilletto clearance immuni di ArCK cellule¹⁰. Il metodo qui descritto fornisce un ottimo punto di partenza per ulteriore caratterizzazione delle cellule di ArCK, compreso il chiarimento dei meccanismi molecolari che liquidazione immuni in cellule non trasformate e lo studio della trasformazione come oncogeni può ignorare questo meccanismo di sorveglianza, una questione cruciale nel campo^14,15.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B