생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

요약

이수성 게놈 불안정성, 결국 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거를 이끌어 낸다. 이 문서 분할 중단 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

초록

염색체 미 분리 이수성, 조건이 있는 셀 항구 불균형 염색체 수를 이끌어 낸다. 여러 줄의 증거는 강하게 그 이수성 게놈 불안정성, 궁극적으로 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes와 세포 생성을 유발 나타냅니다. 격리 및 복잡 한 karyotypes를 은닉 하는 세포의 세포 생리학에 불균형 염색체 수의 영향을 연구 하는 중요 한 있습니다. 날짜 하려면, 아무 방법 같은 aneuploid 셀을 안정적으로 설립 되었습니다. 이 문서 표준, 저렴 한 조직 배양 기법을 활용 하 여 복잡 한 karyotypes 농축 및 aneuploid 세포의 분석을 위한 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜 등 그들의 유도 노화 관련 분 비 형, 프로-염증 성 속성, 능력을 면역 세포와 상호 작용 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 여러 가지 기능을 분석을 사용할 수 있습니다. 때문에 암 세포는 종종 불균형 염색체 수에 항구, 이수성 두는 pro 및 안티 tumorigenic 효과 잠복의 궁극적인 목표와 정상 세포에서 세포 생리학에 미치는 해독 결정적 이다.

서문

이수성, 단일 보완^1,2,,34의 배수가 염색체 수에 의해 특징 조건이 염색체 분리 과정에서 오류가 발생할. 이 게놈 불안정성^5,를 추가 생성 하는 트리거 복제 스트레스 karyotypes^6,7,8,,910증가 karyotype 복잡도 및 궁극적으로 리드 셀¹⁰의 부분 모집단의 세포 주기 검거를. 여기에 제시 된 방법의 목적은 생성 및 세포 사이클 같은 부분 모집단을 별도 것입니다. 저렴 한 조직 배양 기법을 채용 하 여이 프로토콜 격리 및 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀 세포 주기 검거의 특성화를 촉진 한다. 이러한 셀 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포와 컨트롤로 euploid 자전거 들을 이라고 합니다.

이 프로토콜은이 목적을 위해 설립 하는 첫 번째를 격리 허용 하 고 포함, 그들의 유도 노화 및 노화 관련 분 비 형 (SASP), 하 되이 국한 되지 않고 그들의 프로-염증 성 ArCK 라인의 진학 기능과 면역 세포와 함께 참여 하는 능력. 여기에 제시 된 방법 보내지고, 불멸 하 게 인간의 세포에서 개발 되었습니다 하지만 암 라인에서 아직 테스트 되지 않았습니다. 일부 변환 된 셀 하나 또는 여러 개의 경로;의 억제로 인해 세포 주기 검거에 민감한 있을 수 있습니다. 따라서, 추가 유효성 검사 다른 셀 라인에서 수행 되어야 합니다.

프로토콜

문화 조건

RPE 1 hTERT 셀 라인은 매체에 있는 Dulbecco의 수정이 글 (자료 테이블) 10% 보충 교양 소 태아 혈 청, 2 m L-글루타민, m 그리고 100 U/ml 페니실린/스. 셀 5% CO₂ 습도 환경에서 37 ° C에서 incubated 했다. 10 cm 요리를 사용 하 여 개발 되었습니다 아래에 설명 된 프로토콜을 모든 기술적인 세부 사항 보고 그 요리를 합니다. 다른 요리를 사용 하는 경우 확장 또는 그에 따라 아래로.

1입니다. RPE-1 셀의 동기화

1. 모든 실험에 대 한 15 개 이상의 구절 하지 받은 갓 해 동된 셀을 사용 합니다. 1 일에 해 동 하 고 분배 ~2.5-10 cm 조직 문화 접시에 10⁵ RPE 1 hTERT 셀 x 5.0. 표준 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 밤새 품 어. (예: hemocytometer) 표준 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.
   참고: 셀 밀도 RPE-1 세포의 성장 상태를 말합니다. 성장 조건이 다른 셀 라인; 사이에서 다를 수 있습니다. 그에 따라 그들을 조정 하십시오.
2. 하루에 2, g 1/S 테두리에서 셀 일반 성장 매체를 발음 5mm 티 미 딘을 포함 하는 8 mL 매체를 추가 하 여 동기화 합니다.
   참고: 티 미 딘 농도 치료의 길이 다른 세포 라인에 걸쳐 달라질 수 있습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최상의 조건을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.
3. 당일 3, 티 미 딘 매체 (1.2 단계)를 추가한 후 24 h, 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS로 세포 세척 하 여 티 미 딘 블록에서 놓습니다. 일반 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.

2.이 세대 Mitotic 키 Mps1의 활동을 방해 하 여 세포

1. 에 티 미 딘 블록에서 하루 3, 출시 후 6 h (1.3; 단계 세포 유사 분열을 입력 하기 전에이 약 3-6 h는), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 500 nM reversine (Mps1 억제제)를 포함 하는 매체를 바꿉니다.
   참고: RPE-1 세포는 유사 분열 9-12 h를 입력 후에 티 미 딘 워시 아웃^10,11. 그러나, 세포 주기 론 다른 셀 라인 마다 다릅니다. 따라서, 그것은 (예를 들어, 콘텐츠를 통해 FACS DNA 분석 측정 하 여) 설립된 방법으로 세포 주기 분석을 수행 하 여 파일럿 실험에서 그 속도 결정 하는 중요 한. 또한, Mps1 억제제의 최적의 작업 농도 세포 사이 달라질 수 있습니다. 이전 실험 RPE1 셀을 사용 하 여 reversine를 사용 하 여 500 nM^10,,1112의 작업 집중에 성공 했습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최적의 농도 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.
2. 하루에 4, reversine 처리 (후 세포 유사 분열에 약 6 h) 후 12 h, reversine 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 접시에 8 mL 일반 성장 매체를 추가 하 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.

3. Aneuploid 자전거 셀 및 ArCK 인구의 농축 제거

1. 하루 6, 셀 입력 첫 번째 유사 분열 후 약 72 h에 (2.2; 단계 약 66 h reversine 워시 아웃 후, 해당 약 하는 이것이 2-3 세포 주기), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 300 nM nocodazole를 포함 하는 매체를 바꿉니다.
   참고: 최근 작품 aneuploid karyotypes를 은닉 하는 RPE-1 셀 genomically 불안정 하 고 그들의 확산에 대 한 체포를 보이고 있다 2-3 세포 주기 후 첫 번째 잘못 된 유사 분열¹⁰. 그러나,이 활동은 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 aneuploid 순환 세포의 제거를 위한 적절 한 타이밍을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 중요 한입니다.
2. 하루 7, nocodazole 처리 후 12 h 매체를 발음 하 고 플레이트 1 x PBS의 3 개 mL를 추가 합니다. 접시의 측면을 눌러 mitotic 세포를 흔들어. Mitotic 세포도 제거를 허용 하도록 각 탭 사이의 접시를 회전 합니다.
3. Mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 여러 라운드 (3-5 회 권장), 발음 및 각 라운드 사이 1 x PBS의 3 mL를 추가 쉐이크-오프 프로세스를 반복 합니다.
4. 쉐이크-오프, 부드럽게 액체는 뚜껑이 나 접시의 가장자리에 고착 하는 발음. 간단히, 10 배 확대에 현미경 플레이트를 확인 하십시오. 몇 mitotic 세포 관찰 된다 확인 합니다. 5 개 이상의 mitotic 세포 10 X 목표 아래 볼 수 있습니다, 쉐이크-오프의 또 다른 라운드를 반복 합니다.
   참고: Mitotic 세포는 둥근 나타나고 쉐이크-오프 후 부분적으로 분리 될 수 있습니다. 그것은 nocodazole 치료의 다음 라운드에 세포를 노출 하기 전에 mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 중요 합니다. 이렇게 하지 않으면 mitotic 세포 죽음으로 이어질 및 tetraploid 세포의 생성 될 수 있습니다.
5. 마지막 악수-오프 후, 셀 1 x PBS의 5 mL로 한 번 씻는 다. 8 mL 매체 330 nM nocodazole를 포함 하는 접시에 추가 하 고 12 h에 품 어.
6. 아니 mitotic 세포 배양 후 관찰 하는 때까지 모든 12 h nocodazole 치료/동요-오프 (3.1-3.5 단계) 반복 합니다. 일반적으로, 치료/동요-오프의 4-5 라운드는 것이 좋습니다.
   참고: 여기에 제공 된 정보는 RPE-1 셀에 참조 하십시오. 치료/동요-오프 라운드의 수는 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. Nocodazole 연장 하 고 불필요 한 노출을 피하기 위해 신중 하 게 결정, 파일럿 실험에서 aneuploid 자전거 셀의 효율적이 고 완전 한 제거에 필요한 라운드 수에 결정적 이다.
7. 4-5 라운드 후의 nocodazole 치료/쉐이크-(3.1-3.6 단계), 일반 성장 매체의 10 mL을 추가 하 고 품 어. 세포 조작 또는 분석 결과 장차 전에 12-24 h 동안 휴식을 하실 수 있습니다.
   참고: 마지막 악수-오프 후, 접시에 남은 세포 세포 주기 검거 그리고, 같이 최근¹⁰, 항구의 복잡 한 karyotypes. 이 세포를 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포 라고 합니다. 그것은 격리 1 주일 이내 ArCK 인구에 분석 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.
8. 필요에 따라 복잡 한 karyotypes 체포 셀의 비율을 평가 하기 위해 수집 하 고 각 쉐이크-오프 표준 셀 카운터를 사용 하 여에서 셀 키를 누릅니다.

그림 1: 생성 하 고 복잡 한 karyotype (ArCK)와 대표 이미지 aneuploid 세포를 분리 하는 데 사용 하는 방법의 전체 회로도. (A) 회로도의 ArCK 세포 생성 및 격리 프로토콜. (B) RPE 1 hTERT 세포 치료의 각 단계에서의 대표 이미지. 마지막 패널 (빨간색으로 설명 된) 격리 ArCK 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4입니다. ArCK 인구의 특성

1. 다음 분석을 수행 하 여 ArCK 인구의 성공적인 분리를 확인 합니다.
   1. 엉덩이 베타-galactosidase 얼룩 (노화의 마커)를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 키트 (재료의 표 참조).
   2. 상용 장비 (재료의 표 참조)를 채용 하 여 CCL2, 같은 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 측정 합니다.
   3. 세포 주기 억제제 p53, p21, 서쪽 오 점, p16의 증가 수준을 확인 합니다.
      참고: 이러한 분석을 제대로 제어 하려면 ArCK 인구는 euploid와 aneuploid 자전거 셀에 비교할 수 한다. 전자는 낮은 통로, 야생-타입 RPE 1 hTERT 기 하 급수적으로 성장 하는 세포. 후자의 RPE 1 hTERT에 염색체 미 분리를 유도 하 고 수확 하는 첫 번째 탈 선 유사 분열 후 세포 72 h에 의해 얻어질 수 있다. 이렇게 하려면 단계 1.1 수확 셀 및 첫 번째 nocodazole 치료 (3.1 단계) 앞에서 설명한 프로토콜을 따릅니다.
2. 체포 셀의 karyotype를 평가 하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 수행 합니다.
   참고: 단일 셀 연속¹³단일 셀 수준 셀 인구에서 염색체 및 하위 염색체 변화를 확인 하려면 잘 설립 방법 이다. 단일 셀 시퀀싱을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 절차 다른^10을찾을 수 있습니다.

결과

이 메서드는 생체 외에서 조직 문화 시스템 그들의 확산을 체포 하는 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 사용 합니다. 이 인구 (복잡 한 Karyotypes와 체포) ArCK 셀 이라고 합니다. 그림 1A 는 실험의 계획을 보여 줍니다. 야생-타입 자전거 RPE 1 hTERT 셀 티 미 딘 G1/S 국경에 동기화 되며 염색체 미 분리를 유도 하는 Mps1 억제제로 치료. 스핀 들 독 nocodazole 염색체 미 분리의 유도 후 72 h에 있는 셀에 추가 됩니다. nocodazole 치료, 증식 수 aneuploid 셀 후 12 h 유사 분열을 입력 하 고이 세포 주기 단계 microtubule 합 방해 때문에 갇혀 있다. 갇혀 이러한 셀은 다음 부드러운 쉐이크-오프에 의해 쉽게 제거. 동요-오프 과정이 반복된 3-5 회 순환 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해입니다. 그림 1B 는 처리의 각 단계에서 RPE-1 셀의 대표 이미지를 보여 줍니다.

ArCK 셀 세포 주기 억제제, p53, p21, p16 그림 2A와 같이 euploid와이 셀, 자전거에 비해 등의 증가 수준을 표시 합니다. 또한, 그림 2B 긍정적인 β-galactosidase ArCK euploid 제어 세포에 비해 세포에서 세포 노화에 대 한 확고 마커 얼룩을 보여 줍니다.

그림 2: ArCK 셀을 활용 하는 대표적인 결과. ((A)) 서쪽 오 점 euploid,이 순환, 및 ArCK 세포에서 세포 주기 억제제 수준 평가. P53, p21, p16의 레벨은 서쪽 오 점 분석에 의해 결정 되었다. 말라 로드 제어로 제공. (B) β-galactosidase ArCK 세포에서 노화의 수준 평가 얼룩. 노화 관련 된 β-galactosidase (β-Gal) 활동 euploid 셀과 ArCK 셀에서 결정 되었다. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 세포 주기 검거 대표 karyotype 분석 단일 셀 임의의 염색체 이득과 손실을 그림 3ArCK 셀 표시 여러, 시퀀싱에서 같이 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀의 눈에 띄는 기능입니다. 이 발견 이전 보고서¹⁰완전 한 합의에 있다.

그림 3: ArCK 셀의 대표 단일 셀 시퀀싱. 세그먼트화 6 대표 ArCK 셀의 karyotype를 보여주는 플롯 합니다. 세그먼트화 플롯 (야생 유형 RPE-1은 여성 근원의 2 중 셀 라인) 로그₂ 규모로 euploid 참조를 기준으로 x 1에서 모든 염색체의 복사본 수를 표시 합니다. 염색체 이득 녹색에서 빨간색, 염색체 손실에 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

생성 하 고 복잡 한 karyotypes (ArCK) 체포 된 셀에 대 한 풍부이 소설 메서드는 여러 염색체 이익 또는 손실이 있고 분할 중단 셀의 연구에 대 한 수 있습니다. 방법은 설치는 신속 하 고 안정적인 방식으로 ArCK 셀의 분리를 촉진 하기 위하여 설계 되었습니다.

이 분석 결과에서 가장 중요 한 단계는 약물 치료의 타임 라인 및, 가장 중요 한 것은, aneuploid 자전거 세포의 제거를 엄격 하 게 통제 하 고. 최적의 결과 얻으려면 nocodazole 치료와 쉐이크-오프 타이밍은 특정 중요 그들은 여전히 둥근 mitotic, g 1에 mitotic 세포 죽음 또는 지연의 가능성을 방지 하는 동안 자전거 셀 접시에서 제거 되도록 잠재적으로 만드는 tetraploid 인구. 동요-오프 타이밍 권장된 12 h nocodazole 외피에서 2 시간 이상 일탈 하지는 것이 좋습니다.

세포는 어떻게 복잡 한 karyotypes의 깊은 이해를 촉진 가능성이 ArCK 미래 연구 세포 생리학을 영향을 줍니다. 특히, 최근 연구는 면역 체계의 세포와 상호 작용 수 있습니다 및 ArCK의 트리거 면역 클리어런스 셀¹⁰설명 했다. 여기 설명 하는 방법을 기본 현상은 세포와 어떻게 종양 변화의 연구에서 면역 클리어런스 분자 메커니즘의 정화를 포함 하 여 ArCK 셀의 추가 특성에 대 한 훌륭한 출발점을 제공 이 감시 메커니즘, 필드^14,15에서 중요 한 질문을 무시할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B