Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Zusammenfassung

Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.

Zusammenfassung

Chromosom MIS Trennung führt zu Aneuploidie, eine Bedingung, in denen Zellen eine unausgewogene Chromosomenzahl beherbergen. Einige Linien des Beweises deuten stark, dass Aneuploidie löst Genom Instabilität, letztlich Erzeugung von Zellen mit komplexen Karyotyp, die ihre Verbreitung zu verhaften. Isolierung und Charakterisierung von Zellen beherbergen komplexe Karyotypen sind entscheidend für die Auswirkungen einer unausgewogenen Chromosomenzahl auf Zellphysiologie untersuchen. Bisher wurden keine Methoden zuverlässig solche aneuploiden Zellen isolieren gegründet. Dieses Dokument enthält ein Protokoll zur Bereicherung und Analyse von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen standard, preiswerte Gewebekultur Techniken. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere Funktionen von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen einschließlich ihrer induzierte Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp, Pro-inflammatorische Eigenschaften und Fähigkeit zur Interaktion mit Immunzellen zu analysieren. Da Krebszellen oft Ungleichgewichte im Chromosom Nummer Hafen, ist es wichtig, zu entschlüsseln, wie Aneuploidie Zellphysiologie in normalen Zellen, mit dem Ziel der Aufdeckung seiner Pro und anti tumorigenic Effekte auswirkt.

Einleitung

Fehler in den Prozess der Trennung der Chromosomen führen zu Aneuploidie, ein Zustand, gekennzeichnet durch eine Chromosomenzahl, die kein Vielfaches der haploiden Ergänzung^1,2,3,4. Aneuploidie Karyotypen Trigger Replikation Stress, die weiter genomische Instabilität^5,erzeugt^6,7,8,9,10, erhöht Karyotyp Komplexität, und letztlich zu Zellzyklus Festnahme von einer Subpopulation von Zellen¹⁰führt. Die hier vorgestellte Methode soll zu generieren und so eine Subpopulation aus dem Radsport Zellen zu trennen. Durch den Einsatz von preiswerten Gewebekultur Techniken, erleichtert dieses Protokoll die Isolierung und Charakterisierung des Zellzyklus verhaftet aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen und ihre euploide Radsport Gegenstücke als Steuerelemente bezeichnet.

Dieses Protokoll ist die erste, für diesen Zweck eingerichtet werden und ermöglicht für die Isolierung und weiter zu studieren, ArCK Linien einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ihre induzierte Seneszenz und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP), ihre Pro-inflammatorischen Funktionen und ihre Fähigkeit, mit Immunzellen zu engagieren. Die hier vorgestellte Methode entwickelt wurde, in den untransformierten, verewigt menschlichen Zellen aber in Krebs Linien noch nicht getestet. Einige transformierten Zellen möglicherweise unempfindlich gegen Zellzyklus Festnahme aufgrund der Unterdrückung der einen oder mehrere Pfade; Daher sollten weitere Validierung in anderen Zelllinien durchgeführt werden.

Protokoll

Kultur-Zustand

RPE-1 hTERT-Zell-Linie wurde in Dulbeccos geändert Eagle Medium (Table of Materials) ergänzt mit 10 % kultiviert fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin. Zellen wurden bei 37 ° C mit 5 % CO₂ in eine feuchte Umgebung inkubiert. Die nachfolgend beschriebene Protokoll entwickelt wurde, mit 10-cm-Gerichte und alle technischen Details berichtet beziehen sich auf die Gerichte. Skalieren, wenn verschiedene Gerichte, oben oder unten entsprechend.

(1) Synchronisation der RPE-1-Zellen

1. Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen, die nicht mehr als 15 Passagen für alle Experimente durchlaufen haben. Am 1. Tag Tauen und ~2.5 - 5,0 x 10⁵ RPE-1-hTERT-Zellen in der Kulturschale 10 cm Gewebe zu verzichten. 8 mL standard Wachstumsmedium hinzugeben und über Nacht inkubieren. Zellzahl Standardzelle Zähler (z. B. ein Hemocytometer) zu bestimmen.
   Hinweis: Zelldichte Wachstumsbedingungen des RPE-1-Zellen bezeichnet. Wachstumsbedingungen variieren zwischen verschiedenen Zelllinien; Betrachten sie entsprechend anpassen.
2. Am 2. Tag synchronisieren Sie Zellen an der G1/S-Grenze durch regelmäßige Wachstumsmedium Absaugen und Hinzufügen von 8 mL 5 mM Thymidin-haltigem Medium.
   Hinweis: Thymidin Konzentration und Dauer der Behandlung variieren in verschiedenen Zelllinien. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die besten Voraussetzungen für die Zelle Zeile(n) getestet werden.
3. Am 3. Tag, 24 h nach dem Hinzufügen von Thymidin Medium (Schritt 1.2) Thymidin-Block durch Absaugen von Medium und Zellen dreimal mit 1 X PBS waschen befreien. Geben Sie 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und wieder Platten in den Inkubator.

2. Generation von Aneuploiden Zellen durch Interferenz mit der Tätigkeit der mitotischen Kinase Mps1

1. Am 3. Tag, 6 h nach der Entlassung von Thymidin-Block (Schritt 1.3; Dies ist ca. 3-6 h, bevor Zellen Mitose eindringen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 500 nM Reversine (Mps1-Hemmer)-haltigem Medium zu ersetzen.
   Hinweis: RPE-1-Zellen eindringen Mitose 9-12 h nach Thymidin Auswaschen^10,11. Jedoch Zellzykluskinetik variieren zwischen den verschiedenen Zelllinien. Daher ist es wichtig diese Kinetik in Pilotversuchen durch Analyse der Zellzyklus durch bewährte Methoden (z.B.durch die Messung des DNA-Inhalt über FACS-Analyse) zu bestimmen. Darüber hinaus variiert die optimale Arbeit Konzentration Mps1 Inhibitor von Zelllinien. Frühere Experimente mit RPE1 Zellen wurden erfolgreich mit Reversine in einer Arbeitsgruppe Konzentration von 500 nM^10,11,12. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die optimale Konzentration für die Zell-Linie getestet werden.
2. Am Tag 4, 12 h nach Reversine Behandlung (ca. 6 h nach Zellen in Mitose waren) Aspirieren Sie Reversine Medium und waschen Sie Zellen dreimal mit 1 X PBS. Die Platte 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und Zellen in den Inkubator zurück.

3. Entfernung von Radsport Aneuploiden Zellen und Anreicherung von ArCK Bevölkerung

1. Am Tag 6, ca. 72 h nach Zellen der ersten Mitose eingeben (Schritt 2.2; Dies ist ca. 66 h nach Reversine Auswaschen, das entspricht etwa 2-3 Zelle Zyklen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 300 nM Nocodazole-haltigem Medium zu ersetzen.
   Hinweis: Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass RPE-1-Zellen beherbergen aneuploiden Karyotypen genomisch instabil sind und ihre Verbreitung über verhaften 2-3 Zelle Zyklen nach dem ersten fehlerhaften Mitose¹⁰. Allerdings variieren diese Kinetik unter verschiedenen Zelllinien. Daher ist es entscheidend für pilot Experimente um das richtige Timing für die Entfernung von Radsport aneuploiden Zellen zu bestimmen.
2. Am Tag 7, 12 h nach der Nocodazole Behandlung Aspirieren Sie Medium und 3 mL 1 X PBS auf den Teller. Der mitotischen Zellen durch Tippen auf die Seite der Platte abschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jeder Berührung, sogar die Entfernung der mitotischen Zellen ermöglichen.
3. Um die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen gewährleisten, wiederholen Sie schütteln-off für mehrere Runden (3-5 mal empfohlen), Absaugen und das Hinzufügen von 3 mL 1 X PBS zwischen jeder Runde.
4. Aspirieren Sie nach dem schütteln sanft jede Flüssigkeit, die den Deckel oder die Kante der Platte eingehalten. Kurz, überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Sicherstellen Sie, dass nur wenige mitotische Zellen beobachtet werden. Wenn mehr als fünf mitotische Zellen unter 10 X Objektiv gesehen werden, wiederholen Sie eine weitere Runde der Shake-off.
   Hinweis: Mitotische Zellen scheint abgerundet und können nach dem schütteln teilweise getrennt werden. Es ist entscheidend für die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen vor der Belichtung der Zellen in die nächste Runde der Nocodazole Behandlung zu gewährleisten. Nichtbeachtung kann zur mitotischen Zelltod führen und/oder bei der Erzeugung von tetraploiden Zellen führen.
5. Waschen Sie nach dem letzten Shake Zellen einmal mit 5 mL 1 X PBS. Fügen Sie 8 mL Medium mit 330 nM Nocodazole in die Platte und 12 h inkubieren.
6. Wiederholen Sie Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.5) alle 12 h bis keine mitotischen Zellen nach Inkubation eingehalten werden. In der Regel sind 4 bis 5 Runden Behandlung/Shake-off empfohlen.
   Hinweis: Die hier bereitgestellten Informationen beziehen sich auf RPE-1-Zellen. Die Anzahl der runden Behandlung/Shake-off variieren zwischen verschiedenen Zelllinien. Zur Vermeidung von langwierigen und unnötige Exposition gegenüber Nocodazole ist es entscheidend, die in einem Pilotversuch sorgfältig die Anzahl der Runden, die für die effiziente und vollständige Entfernung der Radsport aneuploiden Zellen bestimmen.
7. Fügen Sie nach 4 bis 5 Runden der Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.6) 10 mL regelmäßige Wachstumsmedium und inkubieren. Lassen Sie Zellen für 12-24 h vor Manipulationen oder Assay Nachnutzung ruhen.
   Hinweis: Nach dem letzten Shake, Zellen bleiben auf der Platte sind Zellzyklus verhaftet und vor kurzem¹⁰, siehe Hafen komplexe Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen bezeichnet. Es ist ratsam, Assays auf ArCK Populationen innerhalb einer Woche nach der Isolation führen.
8. Optional, den Anteil der verhafteten Zellen mit komplexen Karyotypen bewerten, sammeln Sie und zählen Sie Zellen von jeder Shake off Standardzelle Zähler.

Abbildung 1: insgesamt schematische der Methode zum Generieren und Isolieren von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp (ArCK) und repräsentative Bilder. (A) schematische ArCK Zellen Generation und Isolation Protokoll. (B) repräsentative Bilder der RPE-1 hTERT Zellen in jeder Phase der Behandlung. Letzte Paneel (rot dargestellt) repräsentiert die isolierten Zellen ArCK. Skala bar 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Charakterisierung der ArCK Bevölkerung

1. Bestätigen Sie erfolgreiche Isolierung der ArCK Bevölkerung durch Ausführen der folgenden Tests.
   1. Esel Beta-Galaktosidase Färbung (die Markierung der Seneszenz) mit einem handelsüblichen kit (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Sekretion von Pro-inflammatorischen Zytokinen, z. B. CCL2, durch den Einsatz von handelsüblichen Kits (siehe Tabelle der Materialien) zu messen.
   3. Erhöhte Niveaus des Zellzyklus-Hemmer p53, p21, p16 durch Western-Blot zu bestätigen.
      Hinweis: Um diese Tests richtig zu steuern, sollte ArCK Populationen mit euploide und Aneuploidie Radsport Zellen verglichen werden. Ersteres ist niedrig Durchgang, Wildtyp RPE-1 hTERT Zellen wächst exponentiell. Letztere erhalten Sie durch Induktion Chromosom MIS Segregation im RPE-1 hTERT und Ernte Zellen 72 h nach der ersten aberranten Mitose. Folgen Sie dazu das Protokoll beschriebenen Schritt 1.1 und Ernte Zellen direkt vor der ersten Nocodazole-Behandlung (Schritt 3.1).
2. Führen Sie einzellige Sequenzierung um den Karyotyp der verhafteten Zellen zu beurteilen.
   Hinweis: Einzellige Sequenzierung ist eine etablierte Methode zur Bestimmung von chromosomaler und Sub-chromosomaler Veränderungen in einer Zellpopulation an der Einzelzelle Level¹³. Modalitäten für einzellige Sequenzierung durchführen finden Sie ebenfalls¹⁰.

Ergebnisse

Diese Methode nutzt eine in-vitro- Gewebekultur-System um aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die ihre Verbreitung zu verhaften. Diese Bevölkerung wird als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotypen) Zellen bezeichnet. Abbildung 1A zeigt das Schema des Experiments. Wildtyp Radsport RPE-1 hTERT Zellen sind an der G1/S-Grenze mit Thymidin synchronisiert und behandelt mit einem Mps1-Inhibitor, Chromosom MIS Segregation zu induzieren. Die Spindel vergiften Nocodazole ergänzt die Zellen 72 h nach Induktion der Chromosom MIS Segregation. 12 h nach der Nocodazole Behandlung der aneuploiden Zellen, noch in der Lage zu vermehren sind, geben Sie Mitose und befinden sich in dieser Phase des Zellzyklus aufgrund von Interferenzen mit Mikrotubuli Polymerisation gefangen. Diese gefangen Zellen werden dann einfach durch sanftes schütteln entfernt. Der Shake-off-Prozess soll wiederholte 3 - 5 Mal vollständige Entfernung des Radsports Zellen sichergestellt. Abbildung 1 b zeigt die repräsentative Bilder der RPE-1-Zellen in jeder Phase der Behandlung.

ArCK Zellen zeigen erhöhte der Zellzyklus-Inhibitoren, wie p53, p21 und p16 im Vergleich zu euploide und aneuploiden Zellen, Radfahren, wie in Abbildung 2Agezeigt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2 b positive β-Galaktosidase Färbung in ArCK Zellen im Vergleich zu euploide Kontrollzellen, eine gut etablierte Marker für zelluläre Seneszenz.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung ArCK Zellen. (A) Western-blot Beurteilung der Zellzyklus Inhibitor Ebenen in euploide, Aneuploidie, Radfahren und ArCK Zellen. Die Ebenen von p53, p21 und p16 wurden durch western-Blot Analyse ermittelt. Aktin als laden Kontrolle diente. (B) β-Galaktosidase Färbung, die Höhe der Seneszenz in ArCK Zellen. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (β-Gal) Aktivität war in euploide und ArCK Zellen bestimmt. Skala bar 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diese Zellzyklus Festnahme ist ein hervorstechendes Merkmal der aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp, wie gezeigt durch repräsentative Karyotyp Analyse von einzelligen Sequenzierung in Abbildung 3, in dem ArCK Zellen mehrere Anzeigen zufällig Chromosom Gewinne und Verluste. Dieser Befund ist in voller Übereinstimmung mit früheren Berichte¹⁰.

Abbildung 3: Repräsentative einzellige Sequenzierung von ArCK Zellen. Segmentierung Grundstücke zeigen den Karyotyp der sechs repräsentative ArCK Zellen. Segmentierung Diagramme zeigen die Kopienzahl alle Chromosomen von 1 bis X bezogen auf ein euploide Verweis auf eine Log₂ Skala (Wilde Typ RPE-1 ist eine diploide Zelle Linie weiblichen Ursprungs). Chromosom-Gewinne werden in rot, Chromosom Verluste in grün hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Diese neuartige Methode zu erzeugen und zu bereichern für festgenommene Zellen mit komplexen Karyotypen (ArCK) ermöglicht die Untersuchung von Zellen, die mehrere Chromosom Gewinne oder Verluste und aufhören zu teilen. Die Methode Setup wurde entwickelt, um die Isolation der ArCK Zellen auf eine schnelle und zuverlässige Weise zu erleichtern.

Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist rigoros die Timeline der medikamentösen Behandlung und vor allem die Beseitigung von Radsport aneuploiden Zellen steuern. Um optimale Ergebnisse zu erzielen ist das Timing von Nocodazole Behandlung und Shake-off von besonderer Bedeutung, um sicherzustellen, dass Radfahren Zellen von der Platte entfernt werden, während sie noch abgerundet und mitotischen, die Möglichkeit der mitotischen Zelltod oder Schlupf in G1 zu verhindern, potenziell Erstellen einer tetraploiden Bevölkerung. Es wird nicht empfohlen, dass das Timing der Shake-aus mehr als zwei Stunden von der empfohlenen 12-h-Nocodazole-Inkubation abweicht.

Zukünftige Studien an Zellen das Potenzial haben, zu ein tieferes Verständnis der wie komplex Karyotypen erleichtern ArCK beeinflussen Zellphysiologie. Insbesondere zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Zellen des Immunsystems in der Lage sind zu interagieren und Trigger immun Clearance von ArCK^{10 Zellen}. Die hier beschriebene Methode bietet einen hervorragenden Ausgangspunkt für die weitere Charakterisierung der ArCK Zellen, einschließlich der Klärung von den molekularen Mechanismen immun Lichtung im untransformierten Zellen und die Studie wie Onkogenen Transformation kann dieser Überwachungsmechanismus, eine entscheidende Frage in das Feld^14,15umgehen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B