Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Özet

Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Özet

Kromozom mis segregasyon anöploidi, hücreleri bir dengesiz kromozom sayısı liman bir koşul için yol açar. Kanıt birkaç satırlık şiddetle o anöploidi genom istikrarsızlık, sonuçta onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes içeren hücreleri üreten tetikler gösterir. Yalıtım ve karmaşık karyotypes yataklık hücrelerin karakterizasyonu bir dengesiz kromozom sayısı hücre fizyolojisi üzerinde etkisini incelemek büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar hiçbir yöntem güvenilir bir şekilde böyle aneuploid hücreleri izole etmek için kurulmuştur. Bu kağıt standart, ucuz doku kültürü teknikleri kullanan karmaşık karyotypes ile zenginleştirme ve aneuploid hücre analizi için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı aneuploid hücrelerin çeşitli özellikler ile indüklenen yaşlanma ilişkili salgı fenotip, pro-inflamatuar özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim yeteneği de dahil olmak üzere karmaşık karyotypes analiz etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin kez dengesizlikler kromozom sayısı içinde liman çünkü anöploidi hem yanlısı ve anti tumorigenic etkileri ortaya çıkararak nihai hedefi ile normal hücrelerde hücre fizyolojisi nasıl etkilediğini deşifre önemlidir.

Giriş

Kromozom ayrımı sürecinde hataları anöploidi, haploit tamamlayıcı^1,2,3,4katı değil bir kromozom sayısı ile karakterize bir durum neden. Aneuploid daha fazla genomik istikrarsızlık^5,oluşturur tetikleyicisi çoğaltma stres karyotypes^6,7,8,9,10, artırır karyotip karmaşıklık ve sonuçta bir subpopulation hücre¹⁰hücre döngüsü tutuklanması yol açar. Burada sunulan yöntemin amacı oluşturmak ve hücreleri Bisiklete binme böyle bir subpopulation ayrı etmektir. Ucuz doku kültürü teknikleri kullanarak, bu iletişim kuralı yalıtım ve hücre döngüsü tutuklandı karmaşık karyotypes aneuploid hücrelerle karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreleri ve euploid Bisiklete binme karşılıkları denetimleri olarak adlandırılır.

Bu iletişim kuralı bu amaçla kurulacak Birincisi ve yalıtım için izin verir ve daha fazla dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, onların indüklenen yaşlanma ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP), onların pro-inflamatuar ArCK satırlarının çalışma özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile girmeye yeteneklerini. Burada sunulan yöntem dönüştürülmemiş, ölümsüzleştirdi insan hücrelerinde geliştirilmiştir ancak kanser satırlarında henüz test edilmemiştir. Bazı dönüştürülmüş hücrelerin hücre döngüsü tutuklama bir veya birden çok yolları bastırılması nedeniyle duyarsız olabilir; Bu nedenle, daha fazla doğrulama diğer hücre satırlarında gerçekleştirilmesi gerekiyor.

Protokol

Kültür durumu

RPE-1 hTERT hücre kültürünü kültürlü Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 ile desteklenmiş orta (Tablo reçetesi) Fetal sığır Serum, 2 mM L-glutamin ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. Hücreleri oksijen bir ortamda % 5 CO₂ 37 ° C'de inkübe. Aşağıda açıklanan protokol 10 cm yemekleri kullanılarak geliştirilen ve tüm teknik detayları bildirdi o yemekleri için başvurun. Farklı yemekler kullanıyorsanız, ölçek yukarı ya da buna göre aşağı.

1. senkronizasyon 1 RPE hücrelerinin

1. Tüm deneyler için 15'ten fazla pasajlar tabi tutulmuştur değil taze çözdürülen hücreler kullanın. Gün 1, çözülme ve ~2.5 - 5.0 x 10⁵ RPE-1 hTERT hücreleri bir 10 cm doku kültürü çanak içine dağıtmak. Standart büyüme Orta 8 mL ekleyin ve gecede kuluçkaya. Standart hücre sayaç (örneğin, hemasitometre) kullanarak cep numarasını belirleyin.
   Not: Hücre yoğunluğu 1 RPE hücrelerinin büyüme koşullarına anlamına gelir. Büyüme koşulları farklı hücre hatları arasında değişebilir; Buna göre ayarlayarak göz önünde bulundurun.
2. 2 günde hücreleri G1/S sınır normal büyüme orta alıyorum ve 5 mM timidin içeren 8 mL orta ekleyerek eşitleyin.
   Not: Timidin konsantrasyon ve tedavi uzunluğunu farklı hücre hatları arasında değişebilir. Test edilecek hücre satırları için en iyi koşulları belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
3. Timidin ekledikten sonra günde 3, 24 h orta (Adım 1.2), serbest timidin bloğundan orta alıyorum ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkama tarafından. 8 mL normal büyüme ortamının eklemek ve tabakları da kuluçka için dönmek.

2. nesil Aneuploid Mitotik kinaz Mps1 aktivite ile girişim tarafından hücreleri

1. Günde 3, yayımlanmasından sonra 6 h timidin Block (1.3; adım hücreler mitoz girmeden önce yaklaşık 3-6 h bu), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 500 nM reversine (Mps1 inhibitörü) içeren orta ile değiştirin.
   Not: RPE-1 hücreler mitoz 9-12 h girin timidin wash-out^10,11' den sonra. Ancak, hücre döngüsü Kinetik farklı hücre hatları arasında değişiklik gösterir. Bu nedenle, pilot deneylerde Bu kinetik tarafından kurulan yöntemleri (DNA analizi içerik üzerinden FACS ölçme tarafındanörneğin,) hücre döngüsü analizi gerçekleştirerek belirlemek çok önemlidir. Ayrıca, Mps1 inhibitörü en uygun çalışma konsantrasyonu hücre hatları arasında değişebilir. Önceki deneyler RPE1 hücreleri kullanarak bir çalışma konsantrasyonu 500 nM^10,11,12reversine kullanarak başarılı olmuştur. Test edilecek hücre satırı için en uygun konsantrasyonu belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
2. Günde 4, 12 h reversine tedavi (yaklaşık 6 hücreler mitoz sonra h gibi) sonra reversine orta Aspire edin ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın. 8 mL normal büyüme orta plakasına eklemek ve hücreler için kuluçka dönmek.

3. Aneuploid Bisiklete binme hücreleri ve ArCK nüfus zenginleştirme kaldırılması

1. Günde 6, hücreleri ilk mitoz girdikten sonra yaklaşık 72 h (2.2; adım yaklaşık 66 h reversine yıkama hakkında için karşılık gelen çıkış sonra bu 2-3 hücre döngüsü), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 300 nM nocodazole içeren orta ile değiştirin.
   Not: Son iş aneuploid karyotypes yataklık RPE-1 hücreleri genomically kararsız olan ve onların yayılması hakkında tutuklama göstermiştir ilk hatalı mitoz¹⁰sonra 2-3 hücre döngüsü. Ancak, bu Kinetik farklı hücre hatları arasında değişebilir. Bu nedenle, aneuploid Bisiklete binme hücreleri kaldırılması için uygun zamanlama belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek çok önemlidir.
2. Gün 7, 12 h nocodazole tedavi sonra orta Aspire edin ve 3 mL 1 x PBS için plaka ekleyin. Mitotik hücre plaka tarafında dokunarak sallamak. Mitotik hücre bile kaldırılmasına izin için her dokunun arasında plaka döndür.
3. Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak için alıyorum ve 3 mL 1 x PBS her turun arasında ekleme (3 - 5 kez önerilir), birden fazla mermi için shake-off işlemi tekrarlayın.
4. Sallamak-off sonra yavaşça kapağı veya plaka kenarına yapıştırılır herhangi bir sıvı Aspire edin. Kısaca, plaka 10 X büyütme, mikroskop altında kontrol edin. Kaç Mitotik hücre gözlenir emin olun. Beşten fazla Mitotik hücre 10 X amaç altında görülürse, başka yuvarlak-in sallamak-off yineleyin.
   Not: Mitotik hücreler yuvarlak görünür ve shake-kapalı sonra kısmen müstakil olabilir. Nocodazole tedavi bir sonraki turda hücrelere açığa önce Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak çok önemlidir. Aksi halde Mitotik hücre ölüme yol ve/veya tetraploid hücreler nesilde neden.
5. Son sallamak-off sonra bir kez 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri yıkayın. 330 nM nocodazole plaka içeren 8 mL orta ekleyin ve 12 h için kuluçkaya.
6. Nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3,5) her 12 h tekrarlayın kadar hiçbir Mitotik hücre kuluçka sonra gözlenir. Genellikle, 4-5 tur tedavi/sallamak-kapalı tavsiye edilir.
   Not: burada sağlanan bilgi RPE-1 hücrelere bakın. Tedavi/sallamak-off tur sayısını farklı hücre hatları arasında değişebilir. Nocodazole uzun süreli ve gereksiz maruz önlemek için dikkatli bir şekilde, pilot bir deneyde aneuploid Bisiklete binme hücreleri verimli ve tam kaldırılması için gerekli tur sayısını belirlemek önemlidir.
7. 4-5 tur sonra nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3.6), normal büyüme orta 10 mL ekleyin ve kuluçkaya. Hücreler için 12-24 h gelecekteki manipülasyon veya tahlil kullanmadan önce dinlenmek izin verir.
   Not: Son sallamak kapalı sonra plaka üzerinde kalan hücreleri hücre döngüsü tutuklandı ve¹⁰, son zamanlarda görüldüğü gibi karmaşık karyotypes liman var. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreler olarak adlandırılır. Bu deneyleri ArCK nüfus üzerinde yalıtım bir hafta içinde gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
8. İsteğe bağlı olarak, karmaşık karyotypes tutuklandı hücrelerle yüzdesi değerlendirmek için toplamak ve standart hücre sayaç kapalı her sallamak-hücreleri saymak.

Şekil 1: genel olarak oluşturmak ve karmaşık karyotip (ArCK) ve temsilcisi görüntüleri ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanılan yönteminin şematik. (A) üretimi ve yalıtım Protokolü şematik ArCK hücreleri. (B) temsilcisi görüntüleri RPE-1 hTERT hücre tedavisi her aşamasında. (Kırmızı özetlenen) son paneli izole ArCK hücreleri temsil eder. Ölçek bar 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. ArCK nüfus karakterizasyonu

1. ArCK nüfusunun başarılı yalıtım aşağıdaki testleri gerçekleştirerek onaylayın.
   1. Eşek beta-galaktozidaz (yaşlanma marker) Boyama ticari olarak kullanılabilir kullanarak (tablo malzemeleri görmek) kit.
   2. CCL2 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını piyasada kitleri (tablo malzemeleri görmek) istihdam ederek ölçmek.
   3. Hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21, p16 Western Blot tarafından yüksek düzeyde onaylayın.
      Not: düzgün bu deneyleri denetlemek için ArCK nüfusu euploid ve aneuploid Bisiklete binme hücrelere göre olmalıdır. Eski düşük geçiş, katlanarak büyüyen yaban tipi RPE-1 hTERT hücreleri. İkinci RPE-1 hTERT kromozom mis segregasyon inducing ve sonra ilk anormal mitoz hücre 72 h hasat tarafından alınabilir. Bunu yapmak için ilk nocodazole tedavi (Adım 3.1) önce adım 1.1 ve hasat hücrelerden yukarıda açıklanan Protokolü uygulayın.
2. Karyotip tutuklandı hücre değerlendirmek için tek hücreli sıralama gerçekleştirir.
   Not: Tek hücreli sıralama tek hücre düzeyi¹³hücre nüfus arasında kromozom ve alt kromozom değişiklikleri belirlemek için köklü bir yöntemdir. Tek hücreli sıralama gerçekleştirmeye ilişkin ayrıntılı yordamlar¹⁰başka bir yerde bulunabilir.

Sonuçlar

Bu yöntem bir vitro doku kültürü sistemi onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanır. Bu nüfus ArCK (Arrested karmaşık Karyotypes ile) hücreler olarak adlandırılır. Şekil 1A deney düzeni gösterir. Vahşi tipi Bisiklete binme RPE-1 hTERT hücreleri timidin G1/S sınırında eşzamanlı ve kromozom mis segregasyon ikna etmek için Mps1 inhibitörü ile tedavi. İğ zehir nocodazole hücrelere 72 h kromozom mis segregasyon indüksiyon sonra eklenir. 12 saat sonra nocodazole tedavi, hala çoğalırlar edebiliyoruz aneuploid hücreleri mitoz girin ve Mikrotubul polimerizasyonu ile girişim nedeniyle bu hücre döngüsü aşamasında sıkışıp kalırlar. Bunlar tuzağa hücreleri kolayca nazik sallamak-off tarafından kaldırıldı sonra. Sallamak-off işlem tekrarlanan 3 - 5 kere hücreleri Bisiklet tümüyle kaldırılmasını sağlamaktır. Şekil 1B 1 RPE hücrelerinin temsilcisi görüntüleri tedavinin her aşamasında gösterir.

ArCK hücreler, hücre döngüsü yavaşlatıcılar, p53, p21 ve euploid ve aneuploid hücreleri, Bisiklete binme şekil 2Agösterildiği gibi kıyasla p16 gibi daha yüksek düzeyde görüntüler. Ayrıca, şekil 2B olumlu β-galaktozidaz ile karşılaştırıldığında euploid kontrol hücreleri, ArCK hücrelerdeki hücresel yaşlanma köklü bir marker boyama gösterir.

Resim 2: ArCK hücreleri kullanan temsilcisi sonuçları. (A) Western blot değerlendirilmesi hücre döngüsü inhibitörü düzeyleri euploid, aneuploid Bisiklete binme ve ArCK hücreleri. P53, p21 ve p16 düzeyde western blot analizi ile belirlenmiştir. Aktin yükleme denetimi olarak görev yaptı. (B) β-galaktozidaz yaşlanma ArCK hücrelerdeki düzeyini değerlendirmek boyama. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (β-Gal) faaliyet euploid hücreleri ve ArCK hücreleri tespit edilmiştir. Ölçek bar 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu hücre döngüsü tutuklama aneuploid hücreleri ile karmaşık karyotypes, önemli bir özelliği tek hücreli ArCK hücreler birden çok, görüntüler şekil 3' te, rasgele kromozom kazançları ve kayıpları sıralama temsilcisi karyotip analizi tarafından gösterildiği gibidir. Bu bulgu önceki raporları¹⁰ile tam anlaşma mevcuttur.

Şekil 3: temsilcisi tek hücreli sıralama ArCK hücrelerinin. Karyotip altı temsilcisi ArCK hücre gösterilen segmentasyon çizer. Segmentasyon araziler (vahşi RPE-1 kadın kökenli diploit hücre kültürünü türüdür) bir günlük₂ ölçekte x 1 euploid başvuru göre kromozom tüm kopya sayısını gösterir. Kromozom kazançlar kırmızı, kromozom kayıp yeşil vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Oluşturmak ve karmaşık karyotypes (ArCK) ile tutuklandı hücreler için zenginleştirmek için bu roman yöntemi birden çok kromozom kazancı veya zararı var ve bölmek ateşkes hücreleri çalışma için sağlar. Yöntem kurulum hızlı ve güvenilir bir şekilde ArCK hücre izolasyon kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Bu tahlil en kritik adımda titizlikle ilaç tedavisi kronolojisi ve en önemlisi, aneuploid Bisiklete binme hücre kaldırma kontrol ediyor. En iyi sonuçlar için nocodazole tedavi ve shake-off onlar hala yuvarlak ve Mitotik, Mitotik hücre ölümü veya kayma olasılığı G1 içine önleme iken Bisiklete binme hücreleri plaka kaldırılır emin olmak için özellikle önem zamanı, potansiyel bir tetraploid nüfus oluşturma. Sallamak-off zamanlaması önerilen 12-h nocodazole kuluçka üzerinden iki saatten fazla sapma tavsiye edilmez.

Hücreleri nasıl karmaşık karyotypes daha derin bir anlayış kolaylaştırmak için potansiyel var ArCK gelecek çalışmalar hücre fizyolojisi etkiler. Özellikle, yeni yapılan bir çalışmada bağışıklık sistemi hücrelerinin ile etkileşim edebiliyoruz ve¹⁰ArCK tetikleyici bağışıklık Gümrükleme hücreleri gösterdi. Burada açıklanan yöntemi ArCK hücreleri bağışıklık izni dönüştürülmemiş hücrelere ve nasıl oncogenic dönüştürme çalışmanın temel moleküler mekanizmaları açıklama da dahil olmak üzere, daha fazla karakterizasyonu için mükemmel bir başlangıç noktası sağlar Bu gözetim mekanizması, alan^14,15dakika içinde çok önemli bir soru atlamak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B