世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離

要約

異数性は、ゲノムの不安定性、複雑な染色体を持つ細胞を細胞周期逮捕を最終的に生成に します。このペーパーでは、複雑な染色体を分割するために停止を構成する細胞を分離する簡単で便利な方法を提供します。

要約

染色体の誤った分離は、異数性、細胞が不均衡な染色体数を港を条件に します。証拠の複数のラインは強くその異数性をゲノムの不安定性は、最終的に彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を持つ細胞を生成するトリガーを示します。細胞の複雑な染色体の分離と性状、細胞生理学的不均衡な染色体数の影響を検討することが重要です。日には、手法が確立されてないような構成する細胞を確実に分離します。このペーパーでは、標準の安価な培養技術を利用した複雑な染色体の濃縮と異数性細胞の解析のためのプロトコルを提供します。このプロトコルは、その誘導分泌老化関連の表現、プロ炎症性のプロパティ、および免疫細胞と対話する能力を含む複雑な染色体を構成する細胞のいくつかの機能を分析する使用することができます。がん細胞は、染色体数の不均衡をしばしば港、異数性が両方のプロと反 tumorigenic 効果を暴くの究極の目標と、正常細胞の細胞生理に及ぼす影響について解読することが重要です。

概要

染色体分配の過程でエラーは、異数性半数体補^1,2,3,4の倍数ではない染色体数によって特徴付けられる条件に します。異数性染色体ゲノム不安定性^5,が生成されますさらにトリガーのレプリケーション ストレス^6,7,8,9,10増加核型の複雑さ、および最終的に細胞¹⁰個体の細胞周期の停止につながる。ここで紹介した方法の目的を生成し細胞をサイクリングからこのような個体を分離です。安価な培養技術を採用し、このプロトコル分離と複雑な染色体の異数性細胞の細胞周期逮捕の評価が容易になります。これらの細胞は、ArCK (複雑核型で逮捕) セルおよびコントロールとしてサイクリング欠の相手として呼ばれます。

このプロトコルは、この目的のために確立される最初の 1 つを分離することができ、さらなる研究の ArCK 線を含む、彼らの誘導老化と老化関連の分泌形質 (SASP) に限定されない、プロ炎症機能、および能力を免疫細胞に関与します。ここで紹介した方法未変換、不死化ひと細胞で開発されていますが、がんでまだテストされていません。いくつかの変換されたセルが 1 つまたは複数の経路の抑制による細胞周期の停止に敏感である可能性があります。さらにしたがって、他の細胞では検証を実行する必要があります。

プロトコル

培養条件

RPE 1 テロメラーゼ セルラインだったダルベッコ変更イーグル培地中で培養 (材料表) 10% を添加したウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン 100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン。セル 5% CO₂加湿環境で 37 ° C で培養。下記プロトコル 10 cm 皿を使用して開発されているし、報告されるすべての技術的な詳細は、これらの料理を参照してください。別の料理を使用している場合スケール アップまたはそれに応じてダウンします。

1. 網膜色素上皮細胞の同期

1. すべての実験のための以上 15 通路を受けていない新鮮な解凍のセルを使用します。1 日に解凍し、~2.5 - 10 cm 培養皿に 10⁵ RPE 1 テロメラーゼ セル x 5.0 を調剤します。標準的な成長媒体の 8 mL を追加し、一晩インキュベートします。(診断) などの標準的な細胞カウンターを使用してセル数を決定します。
   注: セル密度は RPE 細胞の成長条件を指します。成長条件が異なるセルは並ぶ; の間で異なる場合があります。それらをそれに応じて調整することを検討してください。
2. 2 日目、通常成長培地を吸引し、5 mM チミジンを含む 8 mL の培地を追加して G1/S のボーダーでセルを同期します。
   注: チミジン濃度と治療期間を異なる細胞間で異なる場合があります。テストするセルの行の最適な条件を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。
3. 3 日目、24 h チミジン培地 (ステップ 1.2) を追加した後、培地を吸引・洗浄の 3 回 1 × PBS のセルによってチミジン ブロックからのリリースします。通常培 8 mL を追加し、インキュベーターにプレートを返します。

2 世代異数性の細胞分裂期キナーゼ Mps1 の活動と干渉

1. 3 日目、リリース後 6 h チミジン ブロックから (ステップ 1.3; 細胞が有糸分裂を入力する前に、これは約 3-6 時間)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄し、500 nM リバーシン (Mps1 阻害剤) を添加した培地で置き換えます。
   注: RPE 細胞有糸分裂 9 12 h を入力後チミジン ウォッシュ アウト^10,11。ただし、細胞周期は異なる細胞株によって異なります。したがって、(例えば、DNA コンテンツを介してFACS 解析を測定することによって) 確立された方法によって細胞周期解析を実行してパイロット実験におけるそれらの動態を決定することが重要です。さらに、細胞間最適な作業 Mps1 阻害剤濃度が異なる場合があります。RPE1 細胞を用いた以前の実験は、500 nM^10、11,12の作業濃度リバーシンを使用して成功しています。テストするセルの行の最適な濃度を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。
2. 日目 4、12 h リバーシン治療 (約 6 h 細胞有糸分裂後) 後、リバーシン培地を吸引し、洗浄 3 回 1 × PBS のセル。プレートに 8 mL の正規の成長培地を追加し、インキュベーターにセルを返します。

3. Aneuploid サイクリング細胞と ArCK 人口の濃縮の除去

1. 日 6、約 72 時間細胞を入力最初の細胞分裂後に (手順 2.2; リバーシン洗浄アウト後, 約に相当する約 66 時間は、この 2-3 細胞周期)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄、300 nM ノコダゾールを含有する培地に置き換えます。
   注: 最近の仕事は示した RPE 1 細胞の染色体の異数性 genomically 不安定について彼らの増殖を逮捕最初不良有糸分裂¹⁰の後の 2-3 細胞周期。ただし、この速度は異なる細胞の間で異なる場合があります。したがって、構成するサイクリング細胞の除去のための適切なタイミングを決定するためのパイロット実験を実行することが重要です。
2. 一日 7、ノコダゾール治療後 12 h 培地を吸引し、プレートに 3 mL の 1x PBS を追加します。プレートの側面をタップすることで分裂期の細胞を振り払います。分裂細胞も除去できるように各タップ プレートを回転させます。
3. 分裂期細胞の完全な除去を確実には、複数のラウンド (3-5 回を推奨)、吸引・追加 3 mL の 1x PBS 各ラウンド間の振り払いプロセスを繰り返します。
4. 振り払い後、軽く蓋または板のエッジに付着した液体を吸い出しなさい。簡単に言えば、10 倍の倍率の顕微鏡の下でプレートを確認してください。いくつかの分裂期の細胞が観察されることを確認します。5 つ以上の分裂期の細胞は、対物レンズ 10 倍の下で見られている、振り払いの別のラウンドを繰り返します。
   注: 分裂期細胞は丸みを帯びているが、振り払い後部分的に切断可能性があります。ノコダゾール治療の次のラウンドに細胞を公開する前に分裂細胞の完全な除去のために重要です。そう失敗はおよび/または四倍体細胞生成の結果有糸分裂細胞死につながる可能性があります。
5. 最終的な揺れオフ後 5 mL の 1x PBS で 1 回細胞を洗います。プレートに 330 nM ノコダゾールを含む 8 mL の培地を追加し、12 時間インキュベートします。
6. 孵化後分裂細胞が観察されなくなるまでノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.5) 12 時間間隔を繰り返します。通常、治療/手ふれ off の 4-5 回を推奨します。
   注: ここで提供される情報は、RPE 細胞を参照してください。治療/手ふれ off のラウンド数は、異なる細胞間で異なる場合があります。ノコダゾールに長引くと不必要な露出を避けるために、慎重に判断して、パイロット実験における異数サイクリング細胞の効率的かつ完全な除去のために必要なラウンド数に不可欠です。
7. ノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.6) の 4 〜 5 ラウンドの後通常成長培地 10 mL を加えるし、孵化させなさい。将来の操作または試金の使用前に 12-24 時間の残りの部分にセルを許可します。
   注: 最終振るオフ後セルが皿に残って逮捕細胞周期、最近¹⁰、示すように、複雑な染色体を抱きます。これらの細胞は、弧 (複雑核型で逮捕) 細胞と呼ばれます。分離の一週間以内 ArCK 集団でアッセイを実行することをお勧めします。
8. 必要に応じて、複雑な染色体で逮捕された細胞の割合を評価するために収集し、スタンダード セルのカウンターを使用して各シェイクオフからセルをカウントします。

図 1: 生成し、複雑核型 (弧) と代表的な画像を構成する細胞の分離に使用するメソッドの全体的なスケマティック。(A)図の ArCK 細胞世代と分離のプロトコル。(B) RPE 1 テロメラーゼ細胞治療の各段階での代表的なイメージ。(赤で記載) の最後のパネルでは、分離の ArCK セルを表します。スケール バー 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

4. ArCK 人口の特性評価

1. 次の試金の実行によって ArCK 人口の分離を成功させるを確認します。
   1. ロバ β-ガラクトシダーゼ (老化マーカー) を染色、市販を使用してキット (材料の表を参照してください)。
   2. 市販キット (材料の表を参照) を用いて CCL2 などの炎症性サイトカインの分泌を測定します。
   3. 細胞周期阻害剤 p53、p21、ウェスタンブロットで p16 の増加されたレベルを確認します。
      注: これらのアッセイを正しく制御するため ArCK 集団は欠異数のサイクリング細胞と比較する必要があります。前者は低通過、野生型 RPE 1 テロメラーゼ細胞は指数関数的に成長しています。後者は RPE 1 テロメラーゼの偏析を誤染色体を誘導する、最初異常有糸分裂後 72 時間のセルを収穫して取得できます。これを行うには、最初のノコダゾール治療 (ステップ 3.1) の前に右ステップ 1.1 および収穫細胞から上記プロトコルに従います。
2. 逮捕された細胞の核型を評価するために単一セルのシーケンスを実行します。
   メモ: 単一セルの配列は、単細胞レベル¹³でセル人口の間で染色体とサブ染色体の変化を調べること確立された方法です。単一セルのシーケンスを実行する方法の詳細な手順は、他の場所で¹⁰で見つけることができます。

結果

このメソッドは、彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を構成する細胞を分離するための in vitro培養システムを利用しています。この人口は、ArCK (逮捕された複雑な染色体で) 細胞と呼ばれます。図 1 aは、実験の方法を示します。野生型サイクリング RPE 1 テロメラーゼ細胞チミジンと G1/S の国境で、同期化、染色体の誤った分離を誘発する Mps1 阻害剤と扱われます。スピンドルの毒ノコダゾールは、染色体の誤った分離の誘導後 72 時間のセルに追加されます。異数性の細胞増殖するまだことができるノコダゾール治療後 12 時間は有糸分裂を入力し、微小管重合の干渉のためには、この細胞周期段階に閉じ込められています。閉じ込められたこれらのセルが穏やかな振り払いによって簡単に削除されます。振り払いプロセスは繰り返し 3 - 5 回、サイクリング細胞を完全に除去です。図 1 bは、治療の各段階での RPE 細胞の代表的なイメージを示しています。

ArCK 細胞は、p53、p21、図 2 aに示すように、欠と異数性細胞をサイクリングに比べて p16 などの細胞周期阻害剤の増加されたレベルを表示します。また、図 2 bは、肯定的な β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 欠細胞と比較して細胞の細胞老化の十分に確立されたマーカーを示します。

図 2: ArCK 細胞を利用した代表的な結果。((A))の西部のしみ欠、サイクリング、異数性、ArCK 細胞の細胞周期阻害剤レベルを評価します。P53、p21、p16 のレベルは、西部のしみの分析により決定しました。アクチンはローディング コントロールとして提供しています。(B) β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 細胞老化のレベルを評価します。欠細胞と ArCK 細胞老化関連 β ガラクトシダーゼ (β Gal) 活動を求めた。スケール バー 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

この細胞周期の停止は、ランダム染色体の利得そして損失で図 3ArCK セルが複数表示されるシーケンスの単一セルから代表的な核型分析によって示されている複雑な染色体を構成する細胞の顕著な特徴です。この発見は、以前のレポート¹⁰との完全な合意です。

図 3: ArCK 細胞の代表的な単一セル配列。セグメンテーションは、六つの代表的な ArCK 細胞の核型を示すプロットされます。セグメント化プロットは、(RPE 1 野生型は女性の出自の 2 倍体細胞ライン) ログ₂規模で欠基準 X に 1 からすべての染色体のコピー数が表示されます。染色体の利益は、緑色で、赤の染色体損失でハイライトされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

この新規メソッドを生成し、複雑な染色体 (弧) の逮捕された電池の豊かは、複数の染色体の利得または損失を持ち、分割停止細胞の研究のためことができます。方法セットアップは迅速かつ信頼性の高い方法で ArCK 細胞の分離を容易にする設計されています。

この試験で最も重要なステップは、薬物治療のタイムラインと、最も重要なは、構成するサイクリング細胞の除去厳密制御です。最適な結果を得るのためのノコダゾール治療と振るオフのタイミングは特に重要な彼らはまだ丸みを帯びたと分裂、G1 に分裂細胞死やスリッページの可能性を防止するプレートからサイクリングのセルを削除するには四倍体の人口を作成する可能性があります。推奨 12 h ノコダゾール インキュベーションから 2 時間以上を振り払いのタイミングに逸脱はお勧めできません。

将来に関する ArCK 細胞どのように複雑な染色体のより深い理解を促進する可能性がある細胞生理学に影響を与えます。特に、最近の研究は、免疫系の細胞と対話すること、トリガー免疫クリアランス ArCK の細胞¹⁰を示した。ここで述べる方法免疫クリアランス未変換細胞とどのように発癌の研究の基礎となる分子メカニズムの解明を含む ArCK セルのさらなる評価のため優秀な出発点を提供します。この監視のメカニズム、フィールド^14,15の重大な質問をバイパスがあります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B